Role průtokové cytometrie při vyšetřování vzorků lymfatických uzlin a extranodálních tkání

Overview

Vyšetření lymfoproliferací v lymfatických uzlinách průtokovou cytometrií poskytuje pouze minimální informace o morfologii (orientační stanovení velikosti a granularity buněk), a zcela postrádá informace topografické. Nicméně velkou výhodou této metody je především rychlost stanovení a hodnocení kombinace vyšetřovaných antigenů, kde neméně důležité jsou i intenzity exprese jednotlivých znaků. Toto je zcela zásadní pro hematologické malignity, kdy se různá onemocnění mohou na morfologické úrovni velmi podobat a odchylky vzhledu buněk mohou být minimální. Při diagnostice lymfomů korelace histologie a imunohistochemie s průtokovou cytometrií poskytuje komplexnější pohled pro interpretaci jednotlivých nálezů. Cílem tohoto článku je poskytnout základní informace o vyšetření lymfatických uzlin a biopsií extranodálních tkání průtokovou cytometrií se zaměřením na lymfoproliferativní onemocnění a vytvořit odrazový můstek pro spolupráci mezi patologem a cytometristou.

Klíčová slova:

průtoková cytometrie – Lymfoproliferace – Lymfatická uzlina

Metoda průtokové cytometrie je velice jednoduchá a efektivní. Její princip je založen na průchodu částic suspenze přes laserový paprsek. Přístroj detekuje světlo rozptýlené od těchto částic, kde snímá rozptyl světla v malém úhlu (tzv.forward scatter“ FSC), tato hodnota je úměrná velikosti buněk a dále zaznamenává boční rozptyl světla (tzv. „side scatter“ SSC), který je ovlivněn hlavně granularitou částic a členitostí jádra. Dále je vybaven fotodetektory, které zachycují vybrané části světelného spektra emitovaných fluorescenčními molekulami. Díky tomu je možné použít vícenásobné značení analyzovaných částic pomocí fluorochromů odlišných ve svých emisních spektrech. Nejčastěji se používá navázání fluorescenční značky na monoklonální protilátku. Základní a stručný postup cytometrického vyšetření spočívá v přidání monoklonálních protilátek značených fluorochromem k suspenzi částic našeho zájmu. Protilátka se během krátké inkubace naváže na antigen. Ve většině případů je třeba optimalizovat postup značení, ať již promytím vzorku před přidáním protilátek (pro odstranění volných imunoglobulinů), použitím přísady pro snížení nespecifické vazby protilátek, promytí vzorku po barvení pro snížení pozadí, či cytolýza erytrocytů. Můžeme detekovat jak povrchové, tak intracelulární antigeny. Na trhu je již k dispozici celá řada komerčních souprav, které i tyto postupy významně zjednodušují.

Od publikace článku „Imunofenotypizace průtokovou cytometrií v patologii“ v Česko-slovenské patologii z roku 2013 ke skokovému pokroku na poli průtokové cytometrie nedošlo. Nové slibné metody se zatím příliš nerozšířily do rutinní diagnostiky, ačkoli na některých pracovištích věnujících se souběžně i výzkumné činnosti se pomalu zabydlují. Jedná se v prvé řadě o spektrální průtokovou cytometrii (s rozšířením počtu detekčních kanálů), hmotnostní cytometrii (se značením protilátek konjugovaných s multiatomovými značkami izotopů kovů místo fluorescenčního) a zobrazovací cytometrii (ta kombinuje cytologický obraz s fluorescenčním značením). Výraznějších pokroků však bylo dosaženo v oblasti dostupnosti průtokových cytometrů, dále pak zejména v nabídce značených monoklonálních protilátek, eventuálně i hotových protilátkových koktejlů. Tím pádem je možné metodiky zavést i v laboratořích, které je dosud nevyužívaly (1-6).

Standardizace v průtokové cytometrii je samostatná a náročná kapitola. Je k dispozici velké množství protilátek, celá řada fluorochromů a v současnosti je na trhu také široké spektrum přístrojů. Díky pokrokům v použití výpočetní techniky je stále snadnější zpracovávat větší objemy dat, ale pouze za předpokladu, že jsou tato data porovnatelná v rámci standardizace. V tom případě je možné, a někdy je to dokonce součástí standardizovaného postupu, použít automatické vyhodnocení na základě počítačových algoritmů (7,8).

 

VYŠETŘOVANÝ MATERIÁL

Vyšetření tkáně lymfatických uzlin má řadu nesporných výhod, vždy je však třeba mít na paměti i její omezení. V prvé řadě je to metoda, která pracuje se suspenzí částic, nejčastěji buněk. To znamená nutnost převedení solidních tkání do buněčné suspenze a z toho vyplývá omezení pro vzorky s buňkami pevně lpícími k sobě, nebo s významným podílem vazivové tkáně. Další limitací je viabilita vyšetřovaných buněk. Buňky nekrotické či podléhající apoptóze často nespecificky váží protilátky, či samotné fluorochromy, případně vykazují jistou míru autofluorescence, čímž se mohou objevovat „nesmyslné“ kombinace antigenů vyvolávající dojem abnormální populace. K odlišení neviabilních elementů proto slouží specifické barvení, kdy se nejčastěji využívá vlastnosti fluorescenčních molekul nepřestupovat přes intaktní buněčnou membránu anebo být aktivně vypuzovány z buňky. Existují i další možné postupy.

Při podezření na lymfoproliferaci je důležitý výběr samotné uzliny vhodné pro vyšetření. Nejčastěji na základě klinického vyšetření společně s některou ze zobrazovacích metod (USG, CT). Je-li lymfadenopatie generalizovaná, je vhodnější vyšetřit uzliny krční, pak axilární. Nejméně vhodné jsou uzliny tříselné. Při odběru uzliny je nutné minimalizovat riziko poškození tkáně, včetně termického. Následně je třeba vzorek rychle transportovat do laboratoře bez použití fixačních roztoků a naopak pro zabránění vyschnutí vzorku doplnit vhodné transportní medium. Dle doby transportu lze použít obyčejný fyziologický roztok, lépe fosfátový pufr (PBS), ideálně pak kultivační medium (např. RPMI 1640). Materiál větších rozměrů (např. velká uzlina) zejména při transportu na větší vzdálenost je vhodné zabalit do mulu navlhčeného fyziologickým roztokem, aby na povrchu neosychal.

Příprava lymfatické uzliny či biopsie pro vyšetření průtokovou cytometrií spočívá v převedení solidní tkáně na suspenzi jednotlivých buněk. Lze využít čistě manuální postup, nejčastěji pomocí skalpelu nebo disociace vzorku pístovým homogenizátorem, ale je možné i přístrojové zpracování. Pro hematologické malignity je manuální příprava postačující (při vědomí limitovaného uvolnění nádorových buněk do suspenze z fibrotických vzorků), pro jiné materiály nikoli. V takovém případě je nutné použít enzymatické disociace, které však mají určité nevýhody, zejména změny v konformacích detekovaných epitopů, či může dojít až k jejich úplné ztrátě. Další nevýhodou použití enzymů je navýšení ceny vyšetření (9–12).

 

VYUŽITÍ METODY V PATOLOGII

Vyšetření lymfatických uzlin průtokovou cytometrií je zaměřeno na detekci lymfomů, kromě Hodgkinovy choroby, z následujících důvodů.

Nádory pocházející z buněk mimo hematopoetickou řadu vyžadují složitější přípravu tkáně, takže při jednoduchém mechanickém zpracování nejsou cytometricky detekovatelné. Různé varianty Hodgkinova lymfomu jsou pro tuto metodu také velmi obtížně zjistitelné. Diagnostických buněk je málo, nemají jednoznačný a specifický imunofenotyp, v některých případech je vyšší podíl vaziva ve vzorku a v neposlední řadě mají buňky tendenci se shlukovat. Existují sice práce, které popisují úspěšnou cytometrickou detekci, ale v běžné praxi se cytometricky Hodgkinův lymfom nevyšetřuje (13,14).

Prekurzorové hematologické neoplazie se v lymfatických uzlinách nalézají velmi vzácně, snad s výjimkou T lymfoblastického lymfomu, což ale také není častá diagnóza.

Pro rozlišení různých typů zánětlivých reakcí nejsou dosud definovány charakteristické imunofenotypy buněčných populací, které by měly dostatečný diagnostický význam. V těchto situacích je stěžejní nález histologický v kombinaci s dalšími vyšetřeními (imunohistochemie, molekulární biologie, sérologie).

Mezi nejčastěji se vyskytující lymfoproliferace patří B lymfomy, kterými se dále budeme více zabývat, mezi vzácné pak patří T/NK lymfomy. Další jednotky jsou zcela raritní a při běžném vyšetření se s nimi nejspíše nesetkáme.

Pro průkaz nádorové proliferace lymfocytů je nejdůležitější stanovení klonálního původu buněčné populace. K identifikaci B lymfocytů slouží antigeny, které jsou přítomny na všech fyziologických buňkách (např. CD19, CD20, CD22, CD79b). Pro lymfomy vycházející z B buněk se používá vyšetření exprese dvou variant lehkých imunoglobulinových řetězců kappa a lambda. Při běžném vývoji B lymfocytů dochází k náhodnému výběru jedné varianty, takže jejich rozdělení by mělo být přibližně 1:1 (teoreticky). V praxi je však jejich poměr mnohem více variabilní. V případě klonální proliferace dochází k výrazné převaze jedné varianty daného řetězce nad druhým. Jako přesvědčivý průkaz přítomnosti B lymfomu je pro lymfatické uzliny uváděn poměr K:L mimo rozmezí 0,3 – 3,0. Vždy je vhodné zohlednit všechny vyšetřené parametry, neboť v případě přítomnosti méně početného patologického klonu nemusí být poměr exprese variant lehkých řetězců výrazněji odchýlen. I absence exprese povrchových imunoglobulinů je diagnosticky cenná. Základní rozdělení B lymfoproliferací spočívá ve stanovení exprese molekul CD5 a CD10. Ač existují výjimky, toto schéma je relativně spolehlivé. Skupina CD5+/CD10lymfomů zahrnuje lymfom z buněk pláště (MCL), chronickou lymfocytární leukemii/malobuněčný B lymfom (CLL/SLL) a některé velkobuněčné B lymfomy. Exprese CD5-/CD10+ je charakteristická pro folikulární lymfom (FL), Burkittův lymfom (BL) a část velkobuněčných B lymfomů. Do poslední skupiny spadají ostatní lymfomy, které typicky neexprimují ani CD5 ani CD10. Např. skupina lymfomů marginální zóny, lymfoplazmocytární lymfom, skupina splenických lymfomů, opět některé z velkobuněčných B lymfomů apod. Další znaky slouží k podrobnějšímu rozdělení patologických B lymfocytů v rámci výše uvedených skupin či stanovení prognózy (např. CD23, CD38, CD43, CD44,CD71, CD200). Některé lymfomy vykazují víceméně specifický imunofenotyp (např. CLL/SLL), některé nelze pouze na základě cytometrického obrazu v podstatě odlišit (zejména skupina CD5-/CD10-). To záleží také na dostupném rozsahu vyšetřovaných antigenů (1-6, 15-18).

Pro T lymfomy se dosud používala detekce aberantních imunofenotypů, která spočívá v průkazu negativity znaků, které běžně exprimují všechny T lymfocyty (jako CD2, CD3, CD5, CD7), anebo naopak exprese antigenů, které by se na T lymfocytech vyskytovat neměly (např. CD10, CD13, CD33). V současnosti je však navíc k dispozici protilátka proti konstantní části beta řetězce T buněčného receptoru (TRBC1), která existuje ve dvou variantách, s obdobným významem jako rozlišení lehkých řetězců kappa a lambda u B lymfocytů. Týká se to těch T lymfomů, které mají přítomen T receptor alfa/beta. Při použití detekce exprese varianty TRBC1 může docházet k nálezu zřetelné klonální proliferace, avšak pouze v minimálním počtu. V tom případě se označuje jako T lymfocytární klon nejasného významu (TCUS). Podrobnější rozdělení lymfomů vycházející z T či NK řady většinou vyžaduje stanovení exprese dalších antigenů. Vzhledem k tomu, že se jedná o poměrně vzácné diagnózy, řada laboratoří detailnější typizaci neprovádí (1-6,19-23).

Význam průtokové cytometrie v diagnostice onemocnění vycházejících z proliferace plazmatických buněk je přehledně popsáno v článku popisujícím úlohu průtokové cytometrie při vyšetření kostní dřeně v tomto čísle časopisu a popis zde nebudeme znovu opakovat.

 

PŘÍKLADY NEJČASTĚJŠÍCH B LYMFOMŮ S UKÁZKAMI ZOBRAZENÍ DAT Z PRŮTOKOVÉHO CYTOMETRU

Chronická lymfocytární leukémie/malobuněčný B lymfom (chronic lymphocytic leukaemia/small lymphocytic lymphoma, CLL/SLL)

Nádorové buňky v typickém případě exprimují znaky B lymfocytů (CD19, CD20, CD79b, sIg (povrchový imunoglobulin)), často je však intenzita snížená až negativní oproti benigním B lymfocytům. Nejčastěji je to CD79b, dále CD20, či sIg. Dále bývají typicky pozitivní znaky CD5, jako jeden ze základních diskriminačních znaků, CD23, CD200 a CD43. Ty jsou důležité pro odlišení lymfomu z buněk pláště. Naopak antigeny FMC7 a CD10 jsou typicky u CLL/SLL negativní. Exprese CD81 bývá snížená až negativní. Vzhledem k variabilitě detekovaných imunofenotypů CLL (stejně jako u ostatních lymfomů) existují skórovací systémy pro stanovení pravděpodobnosti správného zařazení patologické populace, např. „Matutes score“. Přesto patří tato lymfoproliferace mezi poměrně dobře popsané a se specifickým imunofenotypem. Znaky CD38 a ZAP-70 patří mezi prognostické znaky, zvažovány jsou ale i další (18) (obr. 1).

Lymfom marginální zóny (marginal zone lymphoma, MZL) a jeho varianty včetně extranodálního lymfomu ze slizniční lymfoidní tkáně (mucosa associated lymphoid tissue MALT)

Patří mezi lymfomy s nespecifickým imunofenotypem, což znamená, že neexprimuje CD5 ani CD10, a neexprimuje další znak, který by byl charakteristický výhradně pro tento lymfom. Odlišení od dalších lymfoproliferací je tedy obtížnější, často bývá nutné zohlednit i klinické nálezy a výsledky dalších pomocných vyšetření. Samotný nález průtokové cytometrie tedy spíše vymezuje oblast pravděpodobné diagnózy. Typicky jsou pozitivní znaky B buněk CD19, CD22, CD79b, negativní CD5, CD10, CD103. Někdy jsou pozitivní i CD11c, CD21, CD25, CD27, CD35, CD39, CD43, sIgD (povrchový imunoglobulin D), CD23 je většinou negativní. Některé kombinace znaků činí diagnózu pravděpodobnější, nicméně dosud není známa žádná, která by byla dostatečně spolehlivá. Další důležitým momentem je skutečnost, že imunofenotypicky nelze odlišit lymfoplazmocytární lymfom (LPL) (obr. 2).

Folikulární lymfom (FL)

Folikulární lymfom v typických případech exprimuje CD10, buňky bývají malé až středně velké a častou je i snížená exprese CD19, méně často může být snížená i exprese CD20 a CD22. CD79b bývá exprimován v obvyklé intenzitě. Většinou jsou pozitivní CD21, IgM; negativní je CD43. CD5 je pak typicky negativní. V některých případech je popisována diskrepance mezi imunohistochemickým barvením a nálezem průtokové cytometrie. Problematické bývá odlišení buněk zárodečného centra, které mívají obdobný imunofenotyp jako buňky FL, většinou je ale vídáme bez exprese lehkých povrchových řetězců. U středně až velkobuněčných forem CD10+ B lymfomů je také třeba korelace s histologií pro přesné zařazení, zda se jedná o FL vyššího stupně či variantu difuzního velkobuněčného lymfomu (DLBCL). Při vyšetření kostní dřeně v rámci stagingu je nutné mít na paměti, že část FL může při infiltraci dřeně ztrácet expresi molekuly CD10 (obr. 3).

Lymfom z buněk pláště (mantle cell lymphoma, MCL)

Tento lymfom vycházející z plášťových buněk lymfatické uzliny většinou exprimuje v obvyklé intenzitě B buněčné znaky – CD19, CD20, CD22, CD79b. Typicky je přítomna molekula CD5. Důležité je proto odlišení od ostatních CD5 pozitivních lymfoproliferací, nejčastěji CLL/SLL. MCL tedy na rozdíl od CLL obvykle neexprimuje CD23, CD200 a většinou ani CD43. Naopak pozitivní by měl být antigen FMC7 a CD81. Pozitivními znaky mohou být i CD11c, CD38. Antigen CD71 je většinou negativní (obr. 4).

Difuzní velkobuněčný B lymfom (diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)

Difuzní velkobuněčný B lymfom stále zůstává heterogenní skupinou, která zahrnuje různé typy morfologických, genetických i imunofenotypových variant. Charakteristicky je zastoupen velkými buňkami (avšak ve variabilním poměru). V cytometrickém obraze tak bývají výrazné odchylky morfologických parametrů (velikost a granularita buněk). U části je patrná exprese CD10. Další pozitivní znak bývá CD71. Poměrně vzácně je pozitivní průkaz CD56. CD23 je většinou negativní, CD5 je častěji negativní, ale může být i pozitivní a to jak „de novo“, tak i v rámci transformace lymfomů nižších stupňů malignity (obr. 5).

Periferní T lymfom, blíže neurčený (peripheral T-cell lymphoma, not otherwise specified PTCL, NOS)

Jedná se o skupinu lymfoproliferací vycházející z T buněk, které není možné klasifikovat jako některé z ostatních jednoznačně definovaných T lymfomů (např. angioimunoblastický T lymfom, hepatosplenický T lymfom atd.) Již z toho je zřejmé, že se nejedná o homogenní diagnostickou jednotku. Navíc je nutné odlišit i další T lymfomy, u nichž některá kritéria nebyla splněna pro limitace vyšetřovacího rozsahu (obecně je vhodnější mluvit o zralých T lymfomech) (obr. 6).

ZÁVĚR

Závěrem je nutné zdůraznit, že těžiště diagnostiky lymfoproliferativních onemocnění spočívá na histologickém a imunohistochemickém vyšetření. Tyto metody mají na druhou stranu svá omezení, je žádoucí tyto nedostatky vhodným způsobem kompenzovat a korelovat výsledky z více metodik. Jednou z možností je právě vyšetření tkáně průtokovou cytometrií, kde obrovská výhoda je rychlost této metody a již během několika hodin můžete svými výstupy upřesnit diagnózu a rozšířit pohled patologa. To s sebou ale nese nutnost zajistit k vyšetření nativní nefixovanou tkáň uzliny, dále její rychlý transport z místa chirurgického odběru na pracoviště patologie a v neposlední řadě dostupnost metody průtokové cytometrie v místě. Teprve souhra všech těchto podmínek umožní vyšetření efektivně provést. Počty zdravotnických zařízení, která disponují dostupným průtokovým cytometrem, postupně narůstají. Výše předložený text by měl nově začínajícím laboratořím usnadnit orientaci v této, dle názoru autorů, pro diagnostiku velmi užitečné metodě.

 

PROHLÁŠENÍ

Autor práce prohlašuje, že v souvislosti s tématem, vznikem a publikací tohoto článku není ve střetu zájmů a vznik ani publikace článku nebyly podpořeny žádnou farmaceutickou firmou. Toto prohlášení se týká i všech spoluautorů

Adresa pro korespondenci:
MUDr. Tomáš Zajíc
Krajská nemocnice Liberec,
Oddělení klinické mikrobiologie a imunologie
Husova 357/10, 460 63, Liberec
e-mail: tomas.zajic@nemlib.cz