Novorozenecký screening přináší pokrok v diagnostice závažných vrozených poruch imunity

Overview

Severe combined immunodeficiency (SCID) screening je souhrnný název pro nástroj časné detekce řady závažných vrozených poruch imunity. Současná kvantifikace excizních DNA molekul TREC a KREC umožňuje časně diagnostikovat závažné buněčné i protilátkové vrozené defekty imunity. Do dvouletého pilotního programu screeningu se v letech 2022–2023 v České republice zapojilo > 90 % novorozenců (vyšetřeno bylo 198 675 vzorků). Diagnostikováni byli 2 pacienti se SCID na podkladě CD3 epsilon deficience a atypického kompletního DiGeorgova syndromu a dalších 17 pacientů s jinými vrozenými poruchami imunity, z toho 9 s agamaglobulinemií. U dvou pacientů se SCID umožnil screening časnou kauzální terapii, tj. transplantaci hematopoetických buněk / thymu, u non-SCID pacientů vedla časná znalost jejich diagnózy k zavedení adekvátních režimových a profylaktických opatření za účelem snížení jejich následné morbidity. Od 1. ledna 2024 byl screening závažných vrozených poruch imunity spolu se spinální muskulární atrofií integrován do celoplošného novorozeneckého laboratorního screeningu.

Klíčová slova:

screening – SCID – těžká kombinovaná imunodeficience – TREC – KREC – agamaglobulinemie

Úvod

Těžká kombinovaná imunodeficience (severe combined immunodeficiency, SCID) spolu s dalšími kombinovanými imunodeficity jsou vzácné život ohrožující formy vrozených poruch imunity charakterizované poruchou vývoje T lymfocytů. Transplantace hematopoetických kmenových buněk / thymu představují kauzální terapie, jejich úspěšnost se však snižuje s věkem pacienta a prodělanými infekcemi,^(1,2) proto je klíčové časné stanovení diagnózy. Předmětem screeningového vyšetření je analýza tzv. T receptorových excizních kroužků (T-cell receptor excision circle, TREC) v periferní krvi ze suché kapky krve. TREC jsou malé cirkulární molekuly DNA, které vznikají při vývoji T lymfocytů v thymu, jejich snížení proto avizuje poruchu časného vývoje těchto buněk.^(3,4) Obdobnou metodou kvantifikující tzv. kappa rekombinační excizní kroužky (kappa recombination excision circle, KREC) lze ze stejného materiálu zjistit závažné vývojové poruchy B lymfocytů, tzv. agamaglobulinemie. Mezi vrozené poruchy imunity dnes řadíme více než 450 onemocnění rozdělených do 10 kategorií.⁽⁵⁾ Možnost jejich zachycení vyšetřením TREC a KREC uvádí tabulka 1.

V České republice proběhl v letech 2022–2023 pilotní program screeningu SCID, od ledna 2024 byl SCID screening začleněn do standardního novorozeneckého laboratorního screeningu. Obdobně jako např. ve Švédsku⁽⁶⁾ či Švýcarsku⁽⁷⁾ sestává ze současného vyšetření TREC a KREC, čímž je možné identifikovat jak SCID, tak i vrozené agamaglobulinemie, např. X-vázanou agamaglobulinemii.^(7–9) Metodou vyšetření je polymerázová řetězová reakce v reálném čase (qPCR), používán je komerční kit (Perkin Elmer).

Výsledky

V průběhu dvouletého pilotního programu bylo vyšetřeno celkem 198 675 vzorků (128 694 v Praze, 69 981 v Brně), což představuje > 90 % všech novorozenců. Do klinických center bylo odesláno k vyšetření 58 pacientů a identifikováno bylo 19 vrozených poruch imunity, z toho 2 onemocnění SCID a 9 vrozených agamaglobulinemií (obr. 1). V celém souboru byly evidovány 2 případy laboratorní falešné pozitivity (tj. byl zjištěn abnormální počet KREC, ale následným vyšetřením byl stanoven normální počet B lymfocytů), ostatní pozitivity byly dány přítomností známých sekundárních faktorů interferujících s vývojem lymfocytů novorozence (prematurita, infekce, maternální medikace). U 8 pacientů zůstává jejich abnormální imunofenotyp bez vysvětlení. Oba pacienti se SCID podstoupili časné kauzální terapie (viz kazuistiky), žádné z dětí s agamaglobulinemií neprodělalo k lednu 2024 závažný infekt. Výsledky naznačily, že by incidence SCID v ČR mohla být mírně vyšší než původně odhadovaných 1 : 100 000, zatímco incidence vrozené agamaglobulinemie by se mohla zvýšit až na 1 : 20 000 (dříve udáváno
1–2 : 100 000).

Kazuistiky

SCID – CD3ε deficience

Pacient A je t.č. dvouletý chlapec narozený ve stanoveném termínu porodu zdravým rodičům jako eutrofický novorozenec. Měsíc před porodem proběhlo u matky onemocnění covid-19, poslední dva týdny gravidity užívala methyldopa pro gestační hypertenzi. Matka má vzácnou kongenitální methemoglobinemii (mutace HBB na chromozomu 11), otec je zdráv, osmiletá sestra má rovněž kongenitální methemoglobinemii a desetiletý bratr je zdráv. Devatenáctý den života pacienta byla klinickému pracovišti hlášena pozitivita SCID screeningu s výsledkem TREC „0 kopií / 100 000 buněk“ ze dvou různých odběrů (fyziologická hodnota TREC > 100 kopií na 100 000 buněk), KREC v normě. Rodina byla ihned informována o nutnosti urgentního vyšetření, jímž byla záhy potvrzena hluboká T lymfopenie svědčící pro onemocnění SCID s T-B+NK+ buněčným fenotypem. V odstupu necelých tří týdnů byla panelovým sekvenováním identifikována homozygotní mutace v CD3E (c.353-10C>G, na chromozomu 11), přičemž oba rodiče jsou přenašeči této mutace. Současně byla u pacienta potvrzena diagnóza methemoglobinemie, na jejíž přítomnost již poukazovala centrální cyanóza a mírné periferní desaturace kyslíku při křiku. Již při prvním klinickém vyšetření byla rodině doporučena přísná izolace v domácím prostředí a bylo ukončeno kojení pro riziko přenosu infekce cytomegalovirem (CMV) mateřským mlékem (matka byla CMV seropozitivní). U dítěte byla zahájena antibiotická profylaxe (sulfamethoxazol/trimethoprim) a imunoglobulinová substituce. U pacienta, rodičů a sourozenců byla vyžádána typizace human leukocyte antigen (HLA) a u pacienta byl vyloučen lymfopoetický chimérismus. V sedmi týdnech věku byl proveden převod nativního štěpu kostní dřeně od HLA identického bratra (přípravný režim: alemtuzumab, fludarabin, treosulfan; profylaxe reakce štěpu proti hostiteli – graft versus host disease, GVHD: cyklosporin A a mykofenolát mofetil). Engraftment (přihojení) trombocytů byl dokumentován sedmnáctý potransplantační den, engraftment granulocytů den dvacátý. Dvacátý první den se rozvinuly příznaky akutního GVHD II. stupně – exantém na trupu a gastrointestinální příznaky, následné navýšení kortikoterapie mělo dobrý efekt. V dalším potransplantačním období nenastaly do dvou let věku dítěte závažné komplikace, pacient prodělával frekventnější v.s. virové respirační infekty a byl léčen pro sekundární hypertenzi, při postupně narůstajícím podílu autologních erytrocytů se opět objevila cyanóza. Imunosupresivní terapie byla ukončena po pátém měsíci po transplantaci. Ve dvanácti měsících věku dítěte bylo zahájeno standardní očkování dle protokolu pro pacienty po transplantaci kmenových hematopoetických buněk. Osmnáct měsíců po transplantaci prokazuje vyšetření chimérismus v neseparované periferní krvi 80 % genotypu příjemce, T lymfocyty jsou dárcovského původu a plně funkční (test blastické transformace v normě) a klinický stav pacienta je velmi dobrý (obr. 2).

SCID – kompletní athymie

Pacient B je nyní osmiměsíční chlapec narozený ve 38. týdnu gravidity s porodní hmotností 2845 g jako první dítě tohoto páru. Matka měla suboptimálně kompenzovaný diabetes mellitus, a to převážně v perikoncepčním období (prekoncepčně a v raných fázích těhotenství měla dle ošetřujícího diabetologa převážně hyperglykemie), v prvním trimestru byl glykovaný hemoglobin HbA1c 45–49 mmol/mol, přičemž ideální hodnota v těhotenství pro diabetickou matku je < 42 mmol/mol. Již prenatálně byla u dítěte diagnostikována komplexní srdeční vada, postnatálně byly zjištěny mnohočetné vývojové vady páteře (hemivertebry, fúze obratlů a motýlové obratle; obr. 3) a hypoparathyreóza. Hlášení o pozitivním výsledku screeningu obdrželo klinické pracoviště desátý den života dítěte s výsledkem TREC „0 kopií / 100 000 buněk“, KREC v normě. V diferenciálním krevním obraze byl patrný normální počet lymfocytů, ovšem vyšetření lymfocytárních populací prokázalo kompletní absenci T lymfocytů s normálním zastoupením dalších leukocytů (T-B+NK+ imunofenotyp). Ultrazvukovým vyšetřením ani magnetickou rezonancí hlavy a páteře nebyl nalezen thymus. Pacient byl převeden do izolačního režimu a již v prvním měsíci věku byla zahájena antimikrobiální profylaxe (sulfamethoxazol/trimethoprim, flukonazol a acyklovir), imunoglobulinová substituce a ukončeno kojení k prevenci přenosu CMV. Přes mnohočetné vývojové vady nebyla u pacienta nalezena očekávaná mikrodelece 22q11.2 svědčící pro DiGeorgův syndrom, následně se ani celoexomovým sekvenováním nepodařilo ozřejmit jiné monogenní příčiny vrozené aplazie thymu (např. geny TBX1, PAX1, FOXN1, CDH7, FOXI3). Po konzultaci s thymovým týmem z Great Ormond Street Hospital ve Velké Británii jsme jako pravděpodobnou příčinu SCID s thymickou aplazií stanovili diabetickou fetopatii. Dekompenzovaný diabetes matky je jednou z extrémně vzácných negenetických příčin kompletního fenotypu DiGeorgova syndromu (s celým spektrem vrozených vad). Pacient byl indikován ke kauzální terapii transplantací thymu. Předtransplantační průběh byl komplikován katétrovou sepsí, hepatopatií s cholelithiázou pravděpodobně iatrogenní etiologie a norovirovou infekcí. Pacientovi byl ve třech měsících věku v Londýně transplantován thymus HLA-neidentického dárce (obr. 4). Měsíc po transplantaci došlo k tranzientnímu zvýšení T lymfocytů v periferní cirkulaci, přičemž se jednalo o lymfocyty dárce, jež během následujících tří měsíců opět vymizely. Pro přítomnost specifických protilátek proti HLA I. a II. třídy dárce, jež mohou mít nežádoucí vliv na přihojení thymového štěpu, byla zahájena terapie cyklosporinem A. Známky nové thymopoézy T lymfocytů jsou obvykle očekávány cca 5–6 měsíců po transplantaci thymu. V mezidobí zůstává pacient v domácím prostředí. Ačkoliv je do očekávané rekonstituce buněčné imunity zvýšené riziko infekcí a u dítěte je opakovaně prokazována přítomnost norovirů a Clostridium difficile ve stolici a viru parainfluenzy v horních cestách dýchacích, dosud žádnou další klinicky závažnou komplikaci neprodělal.

X-vázaná agamaglobulinemie

Případ nyní desetiměsíčního pacienta C přinesl (neúmyslně) příležitost zaslepeně otestovat senzitivitu laboratorního screeningu. Klinickému pracovišti byl hlášen abnormální výsledek vyšetření KREC „0 kopií / 100 000 buněk“ (fyziologická hodnota KREC > 100 kopií na 100 000 buněk), normální TREC. V té době čtrnáctidenní donošený eutrofický novorozenec z druhé fyziologické gravidity byl pozván ke klinickému vyšetření, přičemž již v průběhu prvotního telefonického rozhovoru s matkou vyplynulo, že starší sourozenec má vrozenou poruchu protilátkové imunity, X-vázanou agamaglobulinemii (XLA, tzv. Brutonovu), a je známo, že matka dětí je přenašečkou patogenní varianty v genu BTK (c.126T>A). U dítěte byl záhy verifikován nulový počet periferních CD19+ B lymfocytů a molekulárně genetickým vyšetřením byla potvrzena příčinná mutace v genu BTK. Od druhého měsíce věku dítěte byla zahájena subkutánní imunoglobulinová substituce (300 mg IgG / kg / měsíc), kterou aplikují rodiče dítěti doma. V dalším průběhu chlapec dosud dobře prospíval, závažně nestonal a nevyžadoval žádnou celkovou antibiotickou léčbu. Jedinou dosavadní komplikací jsou recidivující hemofilové konjunktivitidy, řešené lokálními antiseptiky a antibiotiky.

V době narození pacienta bylo jeho bratrovi pět let. Jeho anamnéza ilustrativně demonstruje průběh neléčené vrozené poruchy protilátkové imunity. Diagnóza XLA u něj byla stanovena ve třech a půl letech, kdy byl odeslán k imunologickému vyšetření pro vysokou infekční nemocnost: od deseti měsíců věku prodělával hnisavé otitidy, po prvním očkování proti spalničkám, zarděnkám a příušnicím rozvinul v odstupu 14 dnů pneumonii s vysokou zánětlivou aktivitou a nutností hospitalizace. Od nástupu do školky užíval opakovaně celková antibiotika pro protrahované hnisavé rinitidy, otitidy a bronchitidy, byl prakticky trvale zahleněný. Imunologickým vyšetřením bylo zjištěno hluboké snížení IgG, IgA i IgM, absence CD19+ B lymfocytů v periferní krvi a absence postvakcinačních protilátek. Po zahájení imunoglobulinové substituce (300 mg IgG / kg / měsíc) se snížila infekční nemocnost dítěte, s výjimkou oboustranné maxilární sinusitidy závažněji nestonal, prodělal onemocnění covid-19 s mírným průběhem (obr. 5).

Závěr

Od 1. ledna 2024 se součástí celoplošného novorozeneckého laboratorního screeningu stal screening SCID, což představuje významný pokrok v péči o pacienty se závažnými vrozenými poruchami imunity. Screeningová metoda používaná v České republice detekuje nejzávažnější onemocnění postihující T a B lymfocyty, ale nezachytí všechny vrozené poruchy imunity. U screenovatelných onemocnění demonstrují pilotní data vysokou efektivitu celého metodického a klinického aparátu, pro podrobnou analýzu incidence a efektu časné diagnózy na prognózu pacientů bude nutné získat dlouhodobější data. Komplexní výstup z pilotního programu bude předmětem samostatné budoucí literární reference. |

Poděkování

Naše poděkování patří pacientům a jejich rodinám, jakož i týmům pracovišť, která se na organizaci SCID screeningu s mimořádnou houževnatostí podílejí. Konkrétně jsou to screeningové laboratoře Kliniky pediatrie a dědičných poruch metabolismu ve Všeobecné fakultní nemocnici v Praze a Centra molekulární biologie a genetiky ve Fakultní nemocnici v Brně, referenční klinická pracoviště Ústav imunologie Fakultní nemocnice v Motole v Praze a Pediatrická klinika Fakultní nemocnice Brno, Ústav klinické imunologie a alergologie, Fakultní nemocnice u sv. Anny v Brně a genetické laboratoře Centra kardiovaskulární a transplantační chirurgie v Brně a laboratorního centra CLIP v Praze.