Deficit vitaminu B12 – další výzva k rozšíření novorozeneckého laboratorního screeningu?

Overview

Úvod: Deficit kobalaminu (Cbl, B₁₂) se projevuje v kojeneckém věku neprospíváním, makrocytární anemií, hypotonií, opožděním/regresem vývoje, mikrocefalií a epilepsií. Jednou z příčin deficitu B₁₂ u novorozenců je in utero získaný deficit maternálního původu. Po vzoru jiných zemí EU představujeme průběžné výsledky pilotního projektu novorozeneckého laboratorního screeningu (NLS) deficitu Cbl probíhajícího na spolupracujících pražských pracovištích.

Metody: Pro podezření na deficit B₁₂ stačí odchylka alespoň 1 primárního markeru: propionylkarnitin > 3,8 μmol/l, poměr propionylkarnitin/acetylkarnitin > 0,3, methionin < 7 μmol/l, poměr propionylkarnitin/methionin > 0,5 (stanoveno tandemovou hmotnostní spektrometrií). Jako druhostupňové markery využíváme kyselinu methylmalonovou (MMA) > 2,5 μmol/l a celkový homocystein (tHcy) > 12 μmol/l. U pozitivních nálezů provádíme u novorozence i matky test vstřebávání Cbl a stanovujeme celkový B₁₂ (stanoveno elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou), holoTC (stanoveno chemiluminiscenční imunoanalýzou), foláty (stanoveno elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou), sérovou MMA (stanoveno kapalinovou chromatografií s tandemovou hmotnostní spektrometrií), tHcy (stanoveno vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií) a vybrané sirné metabolity. U matek dále stanovujeme markery chronické gastritidy.

Výsledky: K 21. 02. 2024 byl deficit B₁₂ vyšetřen v 20 419 krevních kapkách (86,1 % z celkového počtu odebraných vzorků). 863 novorozenců mělo pozitivní alespoň 1 z prvostupňových markerů (2nd tier 4,2 %). Celkově jsme zachytili 6 novorozenců s elevovanými hodnotami MMA, ve 4 případech se jednalo o pravou pozitivitu, 1 případ byl falešně pozitivní, 1 případ byl záchyt kombinované malonové/methylmalonové acidurie. V našich předběžných výsledcích dosahoval neonatální deficit B₁₂ incidenci 1 : 5105 (95% CI 1 : 1994 – 1 : 8735).

Závěr: Předběžná data z naší studie prokazují vysokou incidenci neonatálního deficitu B₁₂ ve spolupracujících pražských porodnicích. Výsledky mohou sloužit jako vědecký podklad k rozšíření NLS v České republice.

Práce vznikla s podporou grantového projektu AZV NU22-07-00126, RVO-VFN64165 a programu Cooperatio, vědní oblasti „Pediatrie“ a „Metabolické a endokrinní nemoci“.

Klíčová slova:

novorozenecký screening – vitamín B12 – kobalamin – deficit B12

Úvod

Vitamin B₁₂, známý i jako kobalamin (B₁₂, Cbl) patří do skupiny vitaminů rozpustných ve vodě. V přirozené stravě se vyskytuje v potravinách živočišného původu jako hovězí maso a játra, ryby, vejce nebo mléčné výrobky.⁽¹⁾ Pro plně kojené děti je výlučným zdrojem B₁₂ mateřské mléko a dále zásoby nashromážděné ještě během intrauterinního vývoje.⁽²⁾ Denní potřeba B₁₂ se pohybuje v rozmezí od 0,4 μg u novorozenců a kojenců, 2,4 μg u adolescentů a dospívajících a 2,6 μg u gravidních a kojících žen.⁽³⁾

Cbl, nazvaný i „nejkrásnější kofaktor v přírodě“, je po chemické stránce nejsložitější známý koenzym.⁽⁴⁾ V intracelulárním prostředí působí jako kofaktor 2 enzymů, které jsou nepostradatelné pro metabolické děje: methylmalonyl-CoA-mutáza a methioninsyntáza.⁽⁵⁾ Ve formě adenosyl-Cbl je kofaktorem methylmalonyl-CoA-mutázy. Jedná se o mitochondriální enzym, který katalyzuje izomerizaci methylmalonyl-CoA na sukcinyl-CoA, jednu z anaplerotických reakcí Krebsova cyklu.⁽⁶⁾ Druhou biochemickou reakcí, ve které se Cbl účastní ve formě methyl-Cbl, je remethylace homocysteinu (Hcy) na methionin (Met) pomocí enzymu methioninsyntázy.⁽⁷⁾ Poruchy v těchto enzymech vedou k závažným metabolickým onemocněním.⁽⁸⁾

B₁₂ se v krvi vyskytuje vázán na vazebné proteiny: holotranskobalamin (holoTC) a holohaptokorrin (holoHC) (obr. 1).⁽⁹⁾ Biologicky aktivní frakce je pouze holoTC, známý i jako aktivní B₁₂.⁽¹⁰⁾ V biochemické rutinní diagnostice se uplatňuje stanovení celkového B₁₂ a stanovení holoTC. Dosud neexistuje jednoznačný vědecký konsenzus pro referenční rozmezí jak holoTC, tak celkového B₁₂. V textu uvádíme referenční rozmezí využívané na Klinice pediatrie a dědičných poruch metabolismu 1. LF UK a VFN (KPDPM). Celkový B₁₂ (referenční rozmezí 145–569 pmol/l) zahrnuje obě plasmatické frakce Cbl, jak holoTC, tak holoHC. Vzhledem k tomu, že biologicky aktivní B₁₂ je vázán pouze na holoTC, nejeví se stanovení celkového B₁₂ jako ideální marker pro diagnostiku deficitu B_12..^(11,12) HoloTC (referenční rozmezí 30–165 pmol/l), reprezentující biologicky dostupný Cbl pro buňky, se jeví jako optimální marker pro posuzování deficitu B₁₂.⁽¹³⁾ Fyziologicky dochází k poklesu holoTC mezi 4.–6. měsícem života u plně kojených dětí. Mezi specializovaná vyšetření ke stanovení deficitu B₁₂ patří stanovení sérové kyseliny methylmalonové (MMA) a stanovení celkového Hcy (tHcy).⁽¹⁴⁾ MMA je velmi citlivý marker intracelulárního deficitu B₁₂.^(15,16)
Fyziologické referenční rozmezí do 1. roku života je < 700 nmol/l, nicméně u plně kojených dětí dochází k fyziologickému vzestupu mezi 4.–6. měsícem života až k hodnotám kolem 2000 nmol/l.^(17,18) Po prvním roce života by hodnoty MMA neměly přesáhnout 270 nmol/l. Mezi jiné stavy, které se mohou projevit vzestupem MMA, patří dědičné poruchy transportu a intracelulárního zpracování Cbl nebo chronické onemocnění ledvin.⁽¹⁹⁾ Další funkční marker deficitu B₁₂ je tHcy. Referenční rozmezí ve věkové skupině 0–18 let je 3,5–10 μmol/l, nad 18 let 3,5–15 μmol/l. Nevýhodou oproti MMA je nižší senzitivita a specificita, výhodou častější dostupnost v rutinních laboratořích. Mezi jiné stavy vedoucí k elevaci tHcy patří deficit folátů, chronické onemocnění ledvin, hypotyreóza, farmaka (antiepileptika, antimetabolity folátů).⁽²⁰⁾

Lehký deficit B₁₂ (holoTC 16–30 pmol/l) se projevuje nespecifickými příznaky jako zvýšená únava, anemie, neprospívání a nevysvětlitelné opožďování psychomotorického vývoje (PMV). Těžký deficit B₁₂ (holoTC < 16 pmol/l) se může projevovat jako letargie, odmítání kojení, zvýšená dráždivost, hypotonie, absence úsměvu, opoždění PMV či jeho regres, neprospívání, poruchy růstu, nízká porodní hmotnost, anemie. Dále mohou být přítomny známky demyelinizace, epilepsie nebo glositida. Častou mylnou představou je, že musí být vyjádřena makrocytární anemie – v naší studii byla přítomna u 28 % kojenců.⁽²¹⁾ Eventuální přítomnost pancytopenie dále může rozšířit dif. dg. Většina klinických příznaků se projeví v prvních měsících života.^(22–25)

Stavy, které vedou k deficitu Cbl v dětské populaci, jsou výrazně heterogenní. U novorozenců a kojenců převažuje in utero získaný deficit na podkladě nepoznaného deficitu B₁₂ u matky – nejčastěji z důvodu nediagnostikované malabsorpce na podkladě chronické gastritidy nebo u matek veganek. Mezi další příčiny patří pozdní zavádění příkrmů nebo dědičné poruchy transportu B₁₂. U starších dětí se jedná o nutriční příčiny (nedostatek masa v potravě), onemocnění gastrointestinálního traktu (celiakie, Crohnova nemoc, stavy po resekci terminálního ilea, pankreatická insuficience, hypo/achlorhydrie) nebo dědičné poruchy transportu B₁₂.^(26,27)

Navzdory tomu, že léčba deficitu B₁₂ je jednoduchá a efektivní, dosud neexistují národní nebo mezinárodní doporučení pro léčbu deficitu B₁₂ v dětské populaci. Recentně britský National Institute for Health and Care Excellence publikoval doporučení pro léčbu deficitu B₁₂ u pacientů starších 16 let.⁽²⁸⁾ Na KPDPM při podezření na deficit B₁₂ současně vyšetřujeme matku a dítě. Při vyšetřování matky novorozence s deficitem B₁₂ je potřeba klást důraz na anamnézu stran diety, onemocnění gastrointestinálního traktu a užívaná farmaka. Při podezření na malabsorpci provádíme CobaSorb (neradioaktivní test k posouzení vstřebávání B₁₂) u dítěte i matky. Po ukončení testu a vyloučené malabsorpci zahajujeme terapii magistraliter připraveným B₁₂ sirupem 6 μg/ml v dávce 2 ml 1× denně (tj. 12 µg/den) s následnou kontrolou hladin holoTC, celkového B₁₂, MMA a tHcy 3 týdny a 6 týdnů po zahájení léčby. Po 6 týdnech léčby snižujeme dávku na 2 ml 3× týdně a pokračujeme v substituci do normalizace hladin MMA s laboratorním monitorováním jedenkrát za 6 týdnů do zavedení příkrmů či do ukončení kojení a převodu dítěte na umělou mléčnou výživu. Finální kontrola hladin celkového B₁₂, holoTC, MMA a tHcy probíhá v 6. měsíci života. Je nutné zdůraznit, že vždy léčíme i matku ve spolupráci s všeobecným praktickým lékařem nebo internistou (event. gastroenterologem/hematologem).

Vzhledem k potencionálně závažným dopadům na dětský organismus a faktu, že se jedná o lehce a efektivně léčitelné onemocnění, byl deficit B₁₂ zařazen jako součást novorozeneckého laboratorního screeningu (NLS) ve 13 evropských zemích (obr. 2). Časná diagnostika in utero získaného deficitu Cbl umožňuje zabránit rozvoji závažného neurologického postižení. Od června 2022 probíhá pilotní studie deficitu B₁₂ v porodnicích na území Hlavního města Prahy.

Metody

Pilotní projekt screeningu deficitu B₁₂ probíhá od června 2022 ve 4 pražských fakultních nemocnicích: Všeobecná fakultní nemocnice, Fakultní Thomayerova nemocnice, Fakultní nemocnice Motol a Ústav pro péči o matku a dítě. Na spolupracujících pracovištích konsentující rodičky obdrží informovaný souhlas se zapojením do pilotního programu screeningu deficitu B₁₂ u novorozenců. Pro zapojení do screeningu není nutný žádný odběr krve navíc, vyšetření se realizuje ze standardní suché krevní kapky. Pro stanovení deficitu B₁₂ využíváme následující primární markery: propionylkarnitin (cut-off > 3,8 μmol/l), poměr propionylkarnitin/acetylkarnitin (cut-off > 0,3), Met (cut-off < 7 μmol/l), poměr propionylkarnitin/Met (cut-off > 0,5). Pro záchyt stačí jeden pozitivní marker. Jako druhostupňové markery využíváme MMA (cut-off > 2,5 μmol/l) a tHcy (cut-off > 12 μmol/l). Analyty v suché krevní kapce jsou stanovovány pomocí tandemové hmotnostní spektrometrie. Primárním cílem screeningu deficitu B₁₂ je odhalení závažného nedostatku tohoto mikronutrientu u novorozenců. Mezi sekundární cíle patří detekce maternálního deficitu B₁₂, deficitu proteinů CblA, CblB, CblC, CblD, CblE, CblF, CblJ, CblX, deficitu MTHFR, deficitu methylmalonyl-CoA-mutázy, deficitu methylmalonyl-CoA-epimerázy, deficitu ACSF3 (kombinovaná malonová/methylmalonová acidurie – CMAMMA).

U pozitivních záchytů v rámci dalšího dif. dg. procesu provádíme jak u novorozence, tak u matky test vstřebávání vitaminu B₁₂ (CobaSorb) a stanovujeme celkový B₁₂ (stanoveno elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou), holoTC (stanoveno chemiluminiscenční imunoanalýzou), foláty (stanoveno elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou), sérovou MMA (stanoveno kapalinovou chromatografií s tandemovou hmotnostní spektrometrií), tHcy (stanoveno vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií) a vybrané sirné metabolity. U matek dále stanovujeme protilátky proti vnitřnímu faktoru (stanoveno ELISA), gastrinu (stanoveno chemiluminiscenční imunoanalýzou), protilátky proti parietálním buňkám (stanoveno nepřímou imunofluorescencí). Všechny biochemické metody jsou ve VFN rutinně využívány.

Výsledky

K 21. 2. 2024 bylo ve spolupracujících porodnicích odebráno 23 713 suchých krevních kapek, deficit B₁₂ byl vyšetřen v 20 419 krevních kapkách. Konsentující matky s pilotním projektem screeningu B₁₂ představovaly 86,1 % z celkového počtu odebraných vzorků. Celkově 863 novorozenců mělo pozitivní alespoň 1 marker, 2nd tier MMA představoval 4,2 %. Celkově jsme do 21. 2. 2024 zachytili 6 novorozenců s elevovanými hodnotami MMA. Ve 4 případech se jednalo o pravou pozitivitu, 1 případ byl falešně pozitivní, 1 případ byl záchyt CMAMMA. V našich předběžných výsledcích dosahoval neonatální deficit B₁₂ incidenci 1 : 5105 (95% CI 1 : 1994 – 1 : 8735). Všichni zachycení novorozenci a jejich matky byli dále vyšetřováni a sledováni na KPDPM. Výsledky shrnuje tabulka 1. V rámci sekundárních cílů screeningu se podařilo zachytit 1 novorozence s CMAMMA. Podle dostupné literatury se jedná o vzácnou biochemickou odchylku, pravděpodobně s benigním průběhem.⁽²⁹⁾

Diskuse

Naše studie prokazuje relativně vysokou incidenci deficitu B₁₂ v novorozenecké populaci narozené v několika pražských nemocnicích, která je podobná incidenci fenylketonurie (1 : 4960) v České republice. Ve studii z německého Heidelbergu dosahovala incidence neonatálního deficitu B₁₂ 1 : 5355,⁽³⁰⁾ podobnou incidenci 1 : 5000 prokázala italská studie,⁽³¹⁾ avšak estonská studie prokázala incidenci 1 : 3000.⁽³²⁾ Předpokládáme, že za rozdílnou incidenci mezi jednotlivými státy může rozličný životní styl a jiné hodnoty cut-offs, které jsou využívané pro reportování jednotlivých případů. Vzhledem k tomu, že jeden z rizikových faktorů deficitu B₁₂ během gravidity a následně u novorozence je nízký socioekonomický status matky, předpokládáme, že na celorepublikové úrovni může incidence neonatálního deficitu B₁₂ dosahovat ještě vyšších čísel. Výhodou NLS deficitu B₁₂ je, že nepřímo cílí i na matky – jednou z nejčastějších příčin deficitu B₁₂ u novorozenců je in utero získaný deficit na podkladě nepoznaného deficitu u matky. Proto předpokládáme, že NLS může nepřímo pomáhat ke včasné diagnostice chronické gastritidy a jiných nemocí spojených s malabsorpcí B₁₂ u dosud klinicky asymptomatických matek. Limitace screeningu vidíme v tom, že nemusí odhalit lehčí formy deficitu B₁₂ při narození, které při nedostatečném obsahu Cbl v mléku deficitních matek mohou v pozdějším kojeneckém věku progredovat do závažného deficitu. Proto zůstává v rukou primárních pediatrů myslet na deficit B₁₂ u kojenců. Každé kojené dítě před zavedením příkrmů s neprospíváním, opožděným PMV nebo hypotonií by v rámci dif. dg. procesu mělo mít vyšetřený metabolismus B₁₂.

Závěr

Předběžná data z naší studie prokazují vysokou incidenci (1 : 5105) neonatálního deficitu B₁₂ u novorozenců narozených v pražských porodnicích. Předpokládáme, že zařazení screeningu deficitu B₁₂ ze suché krevní kapky mezi celoplošný NLS splňuje kritéria WHO podle Wilsona a Jungera. Neonatální deficit B₁₂ je potencionálně závažný stav, který může vést k nevratnému poškození CNS, ovšem existuje jednoduchá, dostupná, rodinu nezatěžující a finančně nenáročná léčba. Naše studie může sloužit jako vědecký podklad k zařazení deficitu B₁₂ do rutinního NLS v České republice. |