Vliv kyseliny hyaluronové o nízké, střední a vysoké molekulární hmotnosti na lidské kmenové buňky zubní dřeně

Overview

Úvod a cíl práce: Kmenové buňky zubní dřeně (KBZD) vykazují přirozeně vysokou pozitivitu na povrchový receptor glykoprotein CD44 podílející se mimo jiné na indukci mineralizace odontoblastů, přičemž kyselina hyaluronová (KH) je jeho hlavní ligandou. Cílem experimentu bylo posoudit vliv KH o nízké (NMH-KH), střední (SHM-KH) a vysoké (VMH-KH) molekulární hmotnosti na fenotypový profil, proliferační aktivitu a diferenciační potenciál lidských KBZD.

Metodika: Experiment byl proveden v in vitro podmínkách na dvou liniích lidských KBZD odlišných dárců (třetí molár – muž, 25 let, a první premolár – muž, 9 let). Tyto linie byly kultivovány ve standardním médiu a od druhé pasáže také ve třech experimentálních kultivačních médiích obsahujících 0,1 % kyseliny hyaluronové (KH) ve třech molekulárních hmotnostech: NMH-KH (116 kDa), SHM-KH (540 kDa) a VHM-KH (1500 kDa). Analýza fenotypu byla provedena v sedmé pasáži pomocí průtokového cytometru Vi-Cell XR, viabilita byla měřena analyzátorem Vi-Cell v sedmé pasáži a počet buněk analyzátorem Z2 Coulter ve všech pasážích. Osteodiferenciace a chondrodiferenciace byly indukovány komerčně dodávanými diferenciačními médii a prokazovány histologickým barvením s alciánovou modří a alizarinovou červení.

Výsledky: Linie KBZD využité v našem experimentu vykazovaly fenotyp typický pro lidské KBZD (vysoká pozitivita pro CD 13, CD 29, CD 44, CD 90 a OCT3/4), byly schopny překročit Hayflickův limit a diferencovat v buňky produkující osteogenní a chondrogenní extracelulární matrix. Během experimentu dosáhly KBZD linie 1 kultivované v kontrolním médiu / médiu 1 (116 kDa KH) / médiu 2 (540 kDa KH) / médiu 3 (1500 kDa KH) v tomto pořadí celkem 14,1 / 15,3 / 15,4 / 14,8 populačních zdvojení. Medián doubling time s minimální a maximální hodnotou ve stejném pořadí byl 31,6 (29,2; 36,8) / 29,6 (28,5; 30,6) / 30,3 (26,7; 31,3) / 30,5 (29,7; 33,8) hodin. Viabilita KBZD získaných ze sedmé pasáže byla ve stejném pořadí 92,3 / 93,1 / 91,8 / 92,6 %. KBZD linie 2 kultivované v kontrolním médiu / médiu 1 (116 kDa KH) / médiu 2 (540 kDa KH) / médiu 3 (1500 kDa KH) dosáhly v tomto pořadí celkem 16,7 / 17,2 / 16,7 / 16,8 populačních zdvojení. Medián doubling time s minimální a maximální hodnotou ve stejném pořadí byl 28,9 (24,5; 35,2) / 27,4 (24,5; 32,6) / 28,3 (24,0; 38,4) / 27,1 (25,3; 33,9) hodin. Viabilita KBZD získaných ze sedmé pasáže byla ve stejném pořadí 80,1 / 82,5 / 81,8 / 80,9 %.

Závěr: Ověřili jsme, že KBZD v přítomnosti kyseliny hyaluronové o molekulárních hmotnostech 116, 540 a 1500 kDa v koncentraci 0,1 % přežívají, proliferují a udržují si schopnost diferencovat ve zralé buněčné elementy. Dále jsme ověřili původní předpoklad, že nízkomolekulární forma kyseliny hyaluronové bude mít rozdílný dopad na fenotyp KBZD než forma vysokomolekulární.

Klíčová slova:

kmenové buňky – zubní dřeň – kyselina hyaluronová – scaffold

ÚVOD

Kmenové buňky (KB) jsou eukaryotní buňky, které se vyznačují dvěma specifickými vlastnostmi. Jsou nadány vysokou schopností proliferace umožňující překročení Hayflickova limitu a zároveň mohou diferencovat ve zralé buněčné linie. Jako totipotentní označujeme KB, které mohou bez omezení diferencovat na jakýkoliv jiný typ buněk embryonálních i extraembryonálních tkání. Řadíme sem zygotu a první generaci KB z ní odvozenou. Dále rozeznáváme pluripotentní KB, které mohou diferencovat do buněk všech tří zárodečných listů – entoderm, ektoderm a mezoderm – čili do jakékoliv tkáně mnohobuněčného organismu. Poslední linií KB jsou multipotentní KB, které mohou produkovat pouze buňky odvozené ze zárodečného listu, z jehož tkání jsou samy izolovány. Během života organismu zajišťují KB vývoj orgánů příslušného zárodečného listu, jeho buněčnou obnovu, a udržují tak tkáňovou homeostázu. KB dále dělíme na embryonální kmenové buňky (EKB) a adultní kmenové buňky (AKB). EKB jsou pluripotentní kmenové buňky s širokým diferenciačním potenciálem. Jsou ale získávány z embrya v období blastocysty a jejich odběr je tak spojen s etickými problémy (zánik embrya, definice života aj.), což limituje jejich využití. AKB jsou multipotentní kmenové buňky, jejichž diferenciace je omezena příslušností k jednomu ze tří zárodečných listů. Izolace AKB probíhá postnatálně a jejich využití není spojeno s tolika etickými otázkami.

Kmenové buňky zubní dřeně (KBZD) patří mezi adultní kmenové buňky, které mají schopnost diferencovat ve zralé mezenchymální a neuroektodermální buněčné typy. Jsou odebírány ze zubní dřeně stálých zubů a výhodou oproti jiným zdrojům KB v lidském těle je tak jejich relativně snadná dostupnost. KBZD je možné získávat z extrahovaných zubů, nejčastěji třetích dolních molárů, v rámci plánovaného léčebného zákroku. Tyto zuby jsou po extrakci považovány za biologický odpad a likvidovány. Izolace zubní dřeně tak nepředstavuje pro pacienta žádný zákrok nad rámec běžného ošetření, který by byl proveden pouze za účelem izolace buněk.

Kyselina hyaluronová (KH) je glykosaminoglykan složený z disacharidových jednotek obsahujících kyselinu D-glukuronovou a N-acetylglukosamin. Tento biopolymer je jednou z hlavních složek extracelulární matrix a je hojně zastoupen ve většině pojivových tkání. Nejvyšších koncentrací dosahuje v synoviální tekutině, kůži, pupečníkové šňůře či očním sklivci. Dále je významnou složkou extracelulární matrix zubní dřeně, a tudíž i přirozeným prostředím pro KBZD [1].

Za běžných podmínek se KH v těle vyskytuje ve své vysokomolekulární formě (VMH-KH). VMH-KH se podílí díky svým hygroskopickým vlastnostem na hydrataci, lubrikaci a udržování osmotické rovnováhy tkání, redukuje aktivitu a produkci prozánětlivých mediátorů a metaloproteináz, inhibuje angiogenezi, snižuje výskyt volných kyslíkových radikálů a inhibuje schopnost makrofágů fagocytovat [2, 3, 4, 5]. Nitrokloubní aplikace exogenní VMH-KH stimuluje synovialocyty k vyšší produkci endogenní VMH-KH, stimuluje proliferaci chondrocytů a inhibuje degradaci kloubní chrupavky [6]. Při reparaci tkání brání KH ukládání kolagenu, a tím napomáhá bezjizevnatému hojení [7]. Při zánětu dochází ke štěpení VMH-KH na středně dlouhé (SMH-KH) a krátké (NMH-KH) fragmenty. Tyto fragmenty vykazují odlišnou biologickou aktivitu než VMH-KH. Jejich přítomnost zvyšuje imunitní odpověď a produkci prozánětlivých cytokinů a růstových faktorů [8]. Zvýšená přítomnost NMH-KH byla pozorována v postižených tkáních, např. při revmatoidní artritidě a mnoha neinfekčních onemocněních plic (sarkoidóza, plicní fibróza, astma, plicní hypertenze, CHOPN) [9, 10]. NMH-KH může indukovat progresi některých tumorů [11–13]. NMH-KH je také schopna indukovat angiogenezi [14, 15]. Mezi receptory KH patří povrchový znak 44 (CD 44), což je transmembránový glykoprotein přítomný ve většině lidských buněk a ovlivňující jejich migraci, uptake a degradaci KH, adhezi, orientaci, aktivaci a homing lymfocytů. V posledních letech se výzkum zaměřuje na přítomnost tohoto povrchového znaku u buněk tumorů a metastáz, kde by KH mohla být díky vazbě KH-CD44 využita v rámci tzv. targeted drug delivery (cílená distribuce léčiva) [16].

Důsledky vazby KH na CD 44 se však liší v závislosti na molekulární hmotnosti KH. Tento jev byl popsán např. u fibroblastů, které reagují při navázání VMH-KH na jejich CD 44 zvýšenou diferenciací, naopak při vazbě NMH-HA dochází k inhibici diferenciace [17]. U makrofágů vazba NMH-KH-CD 44 indukuje jejich klasickou aktivaci a expresi prozánětlivých genů, při vazbě VMH-KH dochází naopak k aktivaci alternativní cestou a indukci reparativních procesů [18]. CD 44 je hojně exprimován také na povrchu KBZD. Doposud publikovaná data naznačují vliv VMH-KH na diferenciaci KBZD v odontoblasty, avšak neexistují další studie, které by tyto informace potvrdily [19]. Zároveň neexistují studie, které by se věnovaly vlivu různých molekulárních hmotností kyseliny hyaluronové na KBZD.

Vzhledem k relativně snadné dostupnosti, diferenciačnímu potenciálu a vysoké proliferační aktivitě se KBZD dostávají do popředí zájmu výzkumu kmenových buněk, tkáňového inženýrství a regenerativní medicíny. K takové aplikaci je však buňky nutné na místo použití přenést a na místě je udržet. Využitím vhodného materiálu utvářejícího trojrozměrnou strukturu získáme nosič, tzv. scaffold, který umožňuje aplikaci a udržení buněk na předem určeném místě. Scaffoldy jsou tedy dočasné podpůrné struktury pro růst buněk a tkání [20]. Jedním z potenciálních materiálů pro tvorbu scaffoldů je kyselina hyaluronová (KH). Jako látka tělu vlastní má KH pro implantaci do organismu výhodné vlastnosti, neboť je biokompatibilní, biodegradabilní, resorbovatelná a je přirozenou součástí extracelulární matrix. Technologické zpracování KH umožňuje její produkci ve formě prášku či tvarově libovolných porézních i monolitických struktur a její funkční skupiny (karboxylové kyseliny a alkoholy) mohou být využity k síťování do podoby hydrogelu [20]. Mezi hlavní nevýhody nemodifikované KH patří rychlost její degradace, a tedy i horší mechanické a bariérové vlastnosti in vivo; tento nedostatek je ale možno kompenzovat dalšími biochemickými úpravami [21, 22].

Scaffold jako dočasná podpůrná struktura buněk je při in vivo použití postupně degradován. Degradace KH probíhá za postupného štěpení vysokomolekulárních řetězců na řetězce střední až nízké molekulární hmotnosti. Vzhledem k odlišným signálním vlastnostem různých molekulárních hmotností KH je proto důležité znát vliv různě dlouhých řetězců KH na buňky, pro které je budoucí využití scaffoldu z KH zamýšleno.

Cílem experimentu bylo posoudit in vitro vliv KH o nízké, střední a vysoké molekulární hmotnosti na základní biologické vlastnosti lidských KBZD (proliferační aktivita, viabilita, fenotypový profil, jejich schopnost diferencovat v buňky produkující kostní a chrupavčitou extracelulární matrix).

MATERIÁL A METODY

Protokol izolace a metodika experimentu byly schváleny Etickou komisí Fakultní nemocnice Hradec Králové (souhlasy č. j. 200612 S0lP, 201011 S14P, 201812 S07P). Dárci zubů či jejich zákonní zástupci byli před samotnou extrakcí informováni o povaze experimentu a podepsali informovaný souhlas s využitím KBZD pro výzkumné účely.

Extrakce zubů dvou dárců (linie 1: třetí molár – muž, 25 let, linie 2: první premolár – muž, devět let) proběhla za standardních podmínek v lokální anestezii. Extrahované zuby byly ošetřeny dezinfekčním roztokem a transportovány v Hankově balancovaném solném roztoku (HBSS, Invitrogen, USA) do laboratoře tkáňových kultur. Zubní dřeň byla izolována za sterilních podmínek v laminárním boxu. Korunková část byla od kořenů oddělena Luerovými kleštěmi a zubní dřeň vyjmuta ostrým exkavátorem. Ta byla následně kompletně rozrušena působením enzymů kolagenáza typ I (3 mg/ml, Sevapharma, ČR) a dispáza (4 mg/ml, Invitrogen, USA) po dobu 50 minut, centrifugována na 600 g (2000 rpm) po dobu pěti minut.

KBZD byly kultivovány v atmosféře s 5 % CO₂ za teploty 37 °C. Po 24 hodinách od izolace bylo z kultivační nádoby odstraněno kultivační médium a za užití PBS vymyty zbytky tkání zubní dřeně a neadherující buňky (erytrocyty, fibroblasty, zbytky cév). Následně byly pozorovány jednotlivé buňky či kolonie KBZD. Všechny buňky byly kultivovány do druhé pasáže v totožném médiu. Toto médium sestávalo z alfa-MEM (Gibco, UK), 2% fetálního telecího séra (FCS) (PAA, USA), 10 ng/ml EGF (PeproTech, USA), 10 ng/ml PDGF (PeproTech, USA), 0,2 mM L-askorbové kyseliny (Sigma, USA), 2 % glutaminu (Gibco, UK), 100 U/ml penicilinu (Gibco, UK), 100 µg/ml streptomycinu (Gibco, UK), 20 µg/ml gentamicinu (Gibco, UK) a 50 mM dexametazonu (Sigma, USA) podle standardního protokolu naší laboratoře [23]. Po sedmi dnech kultivace byly KB z povrchu kultivační nádoby uvolněny pomocí 0,05 % trypsin-EDTA (Gibco, UK) a nasazeny do nové kultivační nádoby. Každá další pasáž proběhla po dosažení 70 % konfluence. Část KBZD získaná z druhé pasáže byla kryokonzervována a zbylá část byla využita k prokázání vlastností typických pro KB (dosažení Hayflickova limitu, ověření schopnosti diferenciace a vyšetření fenotypu). Po jejich ověření byly KB rozmrazeny a všechny následující experimenty probíhaly dvojitě k ověření reprodukovatelnosti. KBZD obou linií byly rozděleny a kultivovány ve třech testovaných médiích a jako negativní kontrola byla užita kultivace ve standardním kultivačním médiu. Testovaná média se skládala ze standardního kultivačního média obohaceného o 0,1 % rozpuštěné KH (Contipro, a.s., ČR) o molekulové hmotnosti: médium 1: 116 kDa, médium 2: 540 kDa, médium 3: 1500 kDa. Buněčná viabilita a počet populačních zdvojení byly měřeny za užití Vi-Cell analyzer (Beckman Coulter, USA) a Z2 Coulter (Beckman Coulter, USA). Pro analýzu fenotypu byly využity KBZD získané ze sedmé pasáže (kultivované pět pasáží v médiu s KH), pozitivita znaků CD29 (BD Biosciences Pharmingen, Belgium), CD34 (Dako, Denmark), CD44 (BD Biosciences Pharmingen, Belgium), CD45 (Dako, Denmark), CD71 (Dako, Denmark), CD90 (BD Biosciences Pharmingen, Belgium), HLA I (Dako, Denmark), HLA II (Dako, Denmark) byla měřena průtokovým cytometrem Cell Lab Quanta (Beckman Coulter, USA). Viabilita byla hodnocena pomocí Vi-Cell analyzer (Beckman Coulter, USA) podle protokolu dodavatele.

Pro průkaz schopnosti KBZD kultivovaných v médiu s KH diferencovat ve zralé buněčné linie byla zvolena diferenciace v kostní a chrupavčitou tkáň. Za účelem chondrogenní diferenciace byly KBZD kultivovány po 21 dní v médiu v tomto složení: alfa-MEM (Gibco, UK), kyselina askorbová 1 % (Sigma, USA), dexametazon 0,02 % (Sigma, USA), penicilin/streptomycin 1,2 % (Gibco, UK), glutamin 1,9 % (Gibco, UK), 50 ng/ml TGF-β1 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). Následně byly buňky a extracelulární matrix fixovány 4% paraformaldehydem, zality do parafínu a pro prokázání kyselých mukopolysacharidů, které se hojně vyskytují v chondrogenní matrix, obarveny alcianovou modří pro histologické vyšetření.

Za účelem osteogenní diferenciace byly KBZD kultivovány po 21 dní v kultivačním médiu složeném z alfa-MEM (Gibco, UK), FCS 19 % (PAA, USA), kyseliny askorbové 1 % (Sigma, USA), Beta glycerolfosfátu 2 % (Sigma, USA), glutaminu 1,9 % (Gibco, UK), penicilinu/streptomycinu 1,2 % (Gibco, UK), dexametazonu 37 µl/l (Sigma, USA). Následně byly buňky a vyprodukovaná extracelulární matrix fixovány 4% paraformaldehydem, zality do parafínu a pro demonstraci přítomnosti osteogenní matrix a kalciových depozit obarveny aliziarinovou červení pro histologické vyšetření.

VÝSLEDKY

Během experimentu dosáhly KBZD linie 1 kultivované v kontrolním médiu / médiu 1 / médiu 2 / médiu 3 v tomto pořadí celkem 14,1 / 15,3 / 15,4 / 14,8 populačních zdvojení (graf 1). Medián doubling time s minimální a maximální hodnotou ve stejném pořadí byl 31,6 (29,2; 36,8) / 29,6 (28,5; 30,6) / 30,3 (26,7; 31,3) / 30,5 (29,7; 33,8) hodin. průběžné hodnoty jsou uvedeny v grafu 2. Viabilita KBZD získaných ze sedmé pasáže byla ve stejném pořadí 92,3 / 93,1 / 91,8 / 92,6 %. KBZD linie 2 kultivované v kontrolním médiu / médiu 1 / médiu 2 / médiu 3 v tomto pořadí celkem 16,7 / 17,2 / 16,7 / 16,8 populačních zdvojení (graf 3). Medián doubling time s minimální a maximální hodnotou ve stejném pořadí byl 28,9 (24,5; 35,2) / 27,4 (24,5; 32,6 ) / 28,3 (24,0; 38,4) / 27,1 (25,3; 33,9) hodin. průběžné hodnoty jsou uvedeny v grafu (graf 4). Viabilita KBZD získaných ze sedmé pasáže byla ve stejném pořadí 80,1 / 82,5 / 81,8 / 80,9 %.

U KBZD kultivovaných v médiu s přídavkem NMH-KH jsme zaznamenali oproti KBZD kultivovaných v ostatních médiích a negativní kontrole pokles znaků CD 105 a OCT 3/4 u linie 1 a u KBZD linie 2 došlo k poklesu znaků CD 105, CD 117 a CD 146. Pozitivita ostatních sledovaných znaků byla srovnatelná (tab. 1, tab. 2) (graf 5, graf 6).

U obou testovaných linií dlouhodobě kultivovaných v kontrolním médiu, médiu 1, 2 a 3 jsme byli schopni indukovat diferenciaci v osteoblasty a prokázat přítomnost vápníkových depozit v extracelulární matrix (obr. 1). Chondrogenní diferenciaci jsme prokázali u obou testovaných linií kultivovaných pouze v kontrolním médiu, médiu 1 a 3 (obr. 2). V médiu 2 došlo během diferenciačního experimentu ke kontaminaci kultivačních nádob plísní, a proto byly z experimentu vyřazeny.

DISKUSE

KBZD jsou snadno dostupným zdrojem mezenchymálních KB. Jejich využití v regenerační medicíně a tkáňovém inženýrství nabízí širokou škálu aplikací, a to nejen ve stomatognátní oblasti. KBZD byly In vitro diferencovány v buňky podobné Langerhansovým ostrůvkům pankreatu schopné sekrece inzulinu či v hepatocyty. in vivo byla prokázána jejich schopnost indukovat regeneraci buněk rohovky, periferních nervů, cév a dalších [24–29]. Pokud se omezíme pouze na oblast orální, in vivo studie na zvířecích modelech ukazují, že aplikace KBZD do čelistních kostních defektů podporuje jejich hojení [30–33] a aplikace do nevitálního zubu indukuje regeneraci zubní dřeně [34–36]. Omezený počet studií se věnuje vlivu KBZD na integraci implantátů do čelistních kostí, avšak jejich pozitivní vliv zatím nelze interpretovat jako statisticky významný [37–39].

KH je glykosaminoglykan, který má pro své protizánětlivé, hydratační, regenerační, osteokonduktivní a biokompatibilní vlastnosti potenciál využití i ve stomatologii [40, 41]. Díky variabilním možnostem jeho technologického zpracování je k dispozici ve formě spongiózní, tuhé, gelu či prášku, a dovoluje tak zvolit ideální provedení podle místa aplikace [42]. Zároveň je KH dobře kombinovatelná s jinými látkami, ať už chemickými úpravami, či prostou absorpcí [42]. V důsledku těchto úprav lze kombinovat výhody zvolených materiálů podle zamýšleného použití. KH je tak široce využitelným materiálem pro celou řadu indikací. Na našem pracovišti jsme úspěšně otestovali aplikaci spongiózního materiálu vzniklého lyofilizací roztoku KH s oktenidin dihydrochloridem pro léčbu alveolární ostitis [40]. Při autologní transplantaci fibroblastů kolonizujících nosič z KH byl tento materiál použit jako štěp pro krytí gingiválních recesů [43, 44]. Kopolymer kyseliny hyaluronové, mléčné a glykolové lze díky jeho pomalé degradaci použít ve formě membrány jako bariéru pro krytí kostěných defektů s lepšími výsledky než při použití prosté membrány z polymeru kyseliny mléčné a glykolové [41]. Protizánětlivé působení KH bylo demonstrováno snížením zánětlivých projevů dásní při dlouhodobé aplikaci 0,2% gelu KH [45].

K použití KBZD in vivo je nutné buňky na místo přenést a v místě je udržet. K tomuto účelu slouží scaffoldy, které podle zvoleného materiálu mohou nejen plnit funkci podpůrnou, ale mohou samy buňky ovlivňovat [46]. Mezi materiály využívané pro tvorbu scaffoldů patří i KH, která je ve vysokomolekulární formě přirozenou součástí pojivových tkání. Je biokompatibilní, biodegradabilní snadno resorbovatelná a díky svému vysokému zastoupení v těle je i součástí přirozeného prostředí buněk. Mezi ostatními materiály pro tvorbu scaffoldů je specifická svým funkčním působením na kultivované buňky. Mezenchymální KB kultivované ve scaffoldech z KH produkují výrazně větší množství kolagenu II než při kultivaci ve scaffoldech z polyethylenglykolu [47]. Stejný efekt mělo i přidání KH do scaffoldů z kolagenu při kultivaci chondrocytů [46]. KBZD vykazují přirozeně vysokou pozitivitu na povrchový receptor glykoprotein CD44 podílející se mimo jiné na indukci mineralizace odontoblastů [19].  KH indukuje vazbou na CD 44 in vivo mineralizaci KBZD a in vitro jejich diferenciaci v odontoblasty [19, 48]. Její snadnou in vivo degradaci, a tedy krátký čas, po který plní funkci scaffoldu či bariéry, lze zpomalit biochemickými úpravami [21, 22] či mísením s kolagenem, které kombinuje výhody obou materiálů [46].

I přes zpomalení degradace je nutné, aby postupné odbourávání scaffoldu probíhalo až do jeho plného vymizení. Při degradaci KH dochází k jejímu štěpení na kratší řetězce, a tedy ke snižování molekulární hmotnosti řetězců KH. Bioaktivní vlastnosti KH jsou podmíněny právě délkou řetězců [5, 9, 17, 18], a proto je nutné znát vliv různých molekulárních hmotností KH na buňky, které jsou s ní v kontaktu. Této problematice se doposud věnuje jen velmi omezené množství publikací a při literární rešerši jsme nenalezli publikaci, která by se věnovala porovnání vlivu různých molekulárních hmotností KH na lidské KBZD.

Cílem experimentu proto bylo posoudit vliv KH o nízké, střední a vysoké molekulární hmotnosti rozpuštěné v kultivačním médiu na fenotypový profil, proliferační aktivitu a diferenciační potenciál lidských KBZD. U KBZD kultivovaných v médiu s přídavkem VMH-KH jsme podle očekávání nepozorovali významné odchylky ve fenotypu oproti negativní kontrole, naopak u KBZD kultivovaných v médiu s přídavkem NMH-KH jsme zaznamenali u některých znaků odchylky výrazné.

U KBZD kultivovaných v médiu s přídavkem NMH-KH byl oproti KBZD kultivovaných v ostatních médiích a negativní kontrole patrný pokles znaků CD 105 a OCT 3/4 u linie 1.
U linie 2 došlo k poklesu znaků CD 105, CD 117 a CD 146. Pozitivita ostatních sledovaných znaků byla srovnatelná. OCT 3/4 je znak typický pro KB a je asociován s nízce diferencovaným fenotypem [49]. Snížení OCT 3/4 může ukazovat na indukci diferenciace KBZD. I přes tento výsledek, který naznačuje sníženou schopnost KBZD kultivovaných v médiu s nízkomolekulární KH diferencovat ve zralé buněčné elementy, jsme byli schopni i u těchto buněk indukovat diferenciaci ve zralé buněčné linie. CD 105 a CD 146 jsou znaky asociované s angiogenezí [50, 51]. Vzhledem k tomu, že angiogeneze je podle některých publikací indukována NMH-KH [14, 15], je pro nás tento výsledek překvapující. Exprese CD 44 nebyla výrazně ovlivněna, byť se jedná o znak, který obvykle bývá přítomností KH ovlivněn [19, 48]. Tento výsledek si vysvětlujeme nízkou koncentrací KH v kultivačních médiích a tuto hypotézu by bylo vhodné v dalších experimentech ověřit kultivací KBZD v médiích s vyšší příměsí KH a analyzovat transkriptom buněk metodou qPCR pro kvantitativní analýzu exprese genů se zaměřením na DSPP a DMP-1 (markery odontogenní diferenciace), jež jsou vazbou KH-CD 44 ovlivněny [19]. Ověření získaných poznatků by bylo vhodné experimentálně potvrdit na více liniích.

ZÁVĚR

Experimentem jsme ověřili, že lidské KBZD v přítomnosti KH o molekulárních hmotnostech 116, 540 a 1500 kDa přežívají, proliferují a udržují si schopnost diferencovat ve zralé buněčné elementy. Dále jsme ověřili původní předpoklad, že NMH-KH bude mít rozdílný dopad na fenotyp KBZD než VMH-KH.

Podpořeno programem PROGRES Q40/06.

MDDr. Jan Schmidt

Stomatologická klinika LF UK a FN

Sokolská 581

500 05 Hradec Králové

e-mail: jan.schmidt@lfhk.cuni.cz