Změny v kvalitě hojení ran po podání nenasycených mastných kyselin u potkana

Overview

Úvod:

Ačkoli mechanizmus vlivu nenasycených mastných kyselin na hojení ran nebyl doposud zcela objasněn, je jisté, že nutriční stav pa­cienta hojení kožní rány zásadně ovlivňuje.

Cíl: 

Cílem bylo zjistit, jaký vliv na rychlost a kvalitu hojení kožní rány bude mít krátkodobé podání omega-3 a omega-6 nenasycených mastných kyselin.

Materiál a metodika:

Mladým potkanům kmene Wistar bylo orogastrickou sondou podáváno buď přesně definované množství 20% tukových emulzí (experimentální skupiny E a F s různým poměrem omega-3 : omega-6 : omega-9 nenasycených mastných kyselin) nebo vody (skupina C, kontrolní). Po týdnu aplikace byla zvířatům na hřbetu vytvořena kožní rána a týden bylo pokračováno s dietou. Při ukončení pokusu byla odebrána krev a vzorky rány. Sledovány byly změny v plazmatických hladinách mastných kyselin, 4-hydroxy-2-nonenalu a míra oxidačního stresu jak v plazmě, tak v ráně. Rychlost a kvalita hojení byly posouzeny pomocí digitální planimetrie a histologicky. Výsledky byly statisticky zpracovány neparametrickými testy.

Výsledky:

Byly zjištěny signifikantní změny u zvířat v experimentálních skupinách v hladinách mastných kyselin v plazmě a dále vyšší schopnost tkáně a plazmy vyrovnat se s oxidačním stresem.

Závěr:

Krátkodobé podání určitého poměru nenasycených mastných kyselin má pozitivní vliv na hojení ran.

Klíčová slova:

nenasycené mastné kyseliny – hojení ran – antioxidační kapacita – 4-HNE – 4-hydroxy-2-nonenal

Úvod

Přestože se s problematikou hojení ran setkáváme v chirurgické praxi den­ně, incidence a prevalence ran a hojivých procesů není dobře standardizována a monitorována a existuje jen málo celostátních dat týkajících se péče o rány. Hojení ran jak akutních, tak chronických (dekubity, syndrom diabetické nohy, ulcus cruris, atd.), rány po plánovaných operacích i speciální typy ran, jako jsou popáleniny, představují velkou ekonomickou zátěž zdravotního systému, a to zejména u hospitalizovaných pa­cientů [1].

Rychlost a kvalita hojení kožní rány závisí nejen na velikosti, hloubce a typu rány, ale také na komorbiditách pa­cienta, věku a jeho compliance. Nutriční stav by měl být jedním ze sledovaných parametrů při evaluaci pa­cienta s jakýmkoli typem rány. Jednotlivé složky výživy –  bílkoviny [2,3], vitaminy [4], stopové prvky a mastné kyseliny (MK) [5,6] již byly předmětem řady studií zaměřených na hojení ran, nicméně ovlivnění rychlosti a kvality hojení kožní rány po podání nenasycených MK nebylo prozatím zcela objasněno.

Cílem prezentované experimentální studie bylo zjistit, zda se krátkodobé podání omega-3 a omega-6 nenasycených MK v různém poměru odrazí v kvalitě hojení kožní rány u laboratorního potkana.

Materiál a metodika

Experiment byl prováděn v souladu s doporučením European Com­munity Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, projekt pokusů byl schválen Komisí pro ochranu zvířat Masarykovy Univerzity a komisí Ministerstva zemědělství ČR.

Do experimentu bylo zařazeno 30 potkanů kmene Wistar (stáří 3 týdny, hmotnost 160,4 ± 12,64 g). Zvířata byla náhodně rozdělena do 3 skupin (n = 10), kontrolní skupina C, experimentální skupiny E a F. Po týden­ní přípravě (návyk na úchop rukou a aplikace sondou) byla zvířatům další týden (preoperační fáze) 1× den­ně pomocí orogastrické sondy aplikována buď 20% tuková emulze v dávce 0,2 g/ kg (v poměru omega-3 : omega-6 : omega-9 MK 1 : 1 : 1,5 ve skupině E a v poměru 3 : 1 : 5 ve skupině F) nebo aqua pro injectione za stejných podmínek o stejném objemu skupině kontrolní. Poté byla zvířatům v i.p. anes­tezii ketaminem (100 mg/ kg) a xylazinem (10 mg/ kg) provedena kruhovitá excize kůže o průměru 2 cm v plné tloušťce na hřbetu a ponechána k hojení per secundam intentionem. V průběhu dalšího týdne (pooperační fáze) bylo pokračováno v aplikaci speciální diety. Experiment byl ukončen 21. den, kdy byla zvířatům v celkové i.p. ane­stezii odebrána krev pomocí intrakardiální punkce a vzorky tkáně z oblasti rány.

Z krve byl stanoven krevní obraz, hladiny MK v plazmě ve fosfolipidové i triacylglycerolové frakci, hladina 4-hydroxy-2-nonenalu (4-HNE), parametry oxidačního stresu a antioxidační kapacity plazmy. Vzorky tkáně byly hodnoceny pomocí elektronové a fluorescenční mikroskopie. Makroskopicky byla rychlost hojení a kontrakce rány hodnocena digitální planimetrií. Výsledky byly statisticky zpracovány neparametrickou statistickou analýzou (C vs. E vs. F, Kruskal-Wal­lisův test, následovaný vícečetným srovnáním –  Man­n-Whitneyho post hoc test). Výsledky jsou prezentovány jako medián (dolní a horní kvartil) na hladině významnosti p < 0,05.

Výsledky

V základním panelu hematologické analýzy nebyly zjištěny žádné rozdíly mezi skupinami. Dvoutýden­ní aplikace tukových emulzí vedla ke změnám hladin MK ve fosfolipidové i triacylglycerolové frakci: celkové množství omega-3 ani omega-6 MK sice nebylo signifikantně změněno, ale ve skupině omega-3 sledovaných MK se blížilo signifikanci (Kruskal-Wal­lis; p = 0,061). Detailní analýza pak odhalila signifikantní změny uvnitř skupin omega-3 (jedna kyselina ze čtyř sledovaných omega-3) a omega-6 (dvě ze šesti sledovaných omega-6) MK v obou frakcích (fosfolipidové i tracylglycerolové) plazmy. V plazmatických hladinách 4-HNE nebyly zjištěny signifikantní rozdíly mezi skupinami. Analýza dalších parametrů oxidačního stresu odhalila signifikantní snížení hydrogen peroxidu a poměru nitrátů/ nitritů ve skupině E a F, přičemž nejnižší hodnoty byly naměřeny ve skupině F. Produkce reaktivních forem nitrogenů a nitrátů (reactive nitric species; RNS) se signifikantně zvýšila ve skupině E a F s nejvyšší naměřenou hodnotou opět ve skupině F. Podávání tukových emulzí naopak neovlivnilo produkci reaktivních forem kyslíku (reactive oxygen species; ROS), RNS a celkovou antioxidační kapacitu.

Parametry oxidačního stresu stanovené fluorescenční mikroskopií korelovaly s výsledky z plazmy. Distribuce ROS v experimentálních skupinách E a F byla difuzní, na rozdíl od dobře ohraničené lokalizace u skupiny C. Dobře zabarvená jádra jsou důkazem min. interference a přítomnosti artefaktů. Barvení na RNS ukázalo jejich zvýšené množství ve skupinách E a F s difuzním charakterem distribuce. Tyto výsledky jsou podpořeny vizualizací produktů lipidové peroxidace. V nálezech elektronové mikroskopie dominovaly změny v zastoupení buněčných elementů v experimentálních skupinách E a F ve srovnání se skupinou kontrolní, a to v poměrném nižším zastoupení fibroblastů, vyšší produkci makrofágů a vyšším počtu kolagen­ních vláken organizovaných do větších shluků. Makroskopická analýza hojení ran digitální planimetrií odhalila větší stupeň kontrakce rány ve skupině C (57,9 %) než v experimentálních skupinách F (46,3 %) a E (32 %).

Diskuze

Hojení kožní rány prochází třemi základními fázemi, které se vzájemně prolínají: 1. zánět; 2. proliferace; 3. maturace. Ovlivnění průběhu hojení rány nenasycenými MK může probíhat na mnoha úrovních a nebylo doposud zcela objasněno. Protektivní účinky omega-3 nenasycených MK na kardiovaskulární systém [7], obezitu, aterosklerózu, diabetes mel­litus a jiné civilizační nemoci jsou známy již řadu let a jsou i nadále předmětem mnoha studií. Omega-3 a omega-6 MK mají vzájemně do jisté míry antagonistické působení: omega-3 jsou považovány za protizánětlivé, omega-6 spíše za prozánětlivé. Proto je důležitá jejich vzájemná rovnováha v lidském organizmu, a tedy i jejich optimální poměr v potravě. Toho bývá dosaženo u tzv. středomořského typu stravy (Mediter­rian diet), kdy je poměr omega-3 : omega-6 okolo 1 : 1– 4, naproti tomu u západního typu diety, „fast food“ (Western diet) je vyšší poměr omega-6 a mnohdy dosahuje hodnoty až 1 : 20, což přispívá i k vyšší incidenci civilizačních nemocí v těchto zemích [8]. Proto byly v našem experimentu použity tukové emulze s různým poměrným zastoupením uvedených tříd nenasycených MK. Z našich výsledků plyne, že i krátkodobé podávání nenasycených MK vede ke změnám v celkových plazmatických hladinách omega-3 ve fosfolipidové a triacylglycerolové frakci na hranici signifikance, se signifikantními změnami u ně­kte­rých nenasycených MK v obou frakcích. Tyto výsledky jsou v korelaci s předchozími studiemi [2,9]. Elektronová mikroskopie odhalila intenzivnější produkci kolagenu v experimentálních skupinách, což nás vede k domněnce, že se rány ve skupině E a F v době ukončení experimentu (týden od vytvoření defektu) nacházely již v maturační fázi hojení, zatímco u skupiny C byly ještě v proliferační fázi, event. na pomezí proliferační a maturační fáze hojení. Tento nález je v souladu s výsledky studie [10] prokazující, že omega-3 nenasycené MK stimulují fibroblasty k vyšší produkci kolagenu. Sledované parametry oxidačního stresu –  4-HNE, jakožto konečný produkt lipidové peroxidace [11], ROS a RNS, potvrdily, že zvířata suplementovaná nenasycenými MK jsou schopna se vyrovnat s oxidačním stresem lépe než zvířata ze skupiny kontrolní.

Nalezení optimálního poměru podávaných nenasycených MK pro hojení ran k ovlivnění zejména zánětlivé fáze hojení rány je problematické. Fáze zánětu pro hojení rány je nepostradatelná z důvodu odstranění cizorodých a avitálních (nekrotických) tkání, nicméně její prodloužení vede k prodloužení hojení a vzniku rány chronické. Přesné objasnění mechanizmu působení nenasycených MK ve fyziologických a patofyziologických procesech na celulární a molekulární úrovni by bylo možné využívat do budoucna k ovlivnění léčby ran dlouhodobě se hojících, tzv. chronických ran (non-heal­­ing wounds).

Závěr

Krátkodobé podání MK v experimentu u potkanů před operací a v průběhu hojení vedlo k signifikantním změnám v hladinách ně­kte­rých MK třídy omega-3 a omega-6 ve fosfolipidové a triacylglycerolové frakci, přičemž i suma omega-3 nenasycených MK dosahovala úrovně hraniční signifikance. Výsledky vypovídají, že zvířata v experimentálních skupinách měla vyšší schopnost vyrovnat se s oxidativním stresem v pooperačním období, což koreluje i s výsledky elektronové mikroskopie. Závěrem lze říci, že i krátkodobé podání zvýšeného množství omega-3 nenasycených MK, obzvlášť před plánovaným chirurgickým zákrokem, může pozitivně ovlivnit hojení kožní rány.

Poděkování

Autoři děkují p. Jaroslavu Nádeníčkovi za technickou pomoc. Tato studie byla součástí projektu Masarykovy Univerzity „Kardiovaskulární systém napříč obory –  od molekulární dia­gnostiky po klinická vyšetření“ MUNI/ A/ 1157/ 2017 a projektu „Studium molekulární podstaty vybraných patologických stavů a onemocnění“ MUNI/ A/ 0910/ 2017 s podporou Specifického výzkumného univerzitního grantu poskytovaného MŠMT ČR v roce 2018.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Alica Hokynková, MD

Klinika popálenin a plastické chirurgie LF MU a FN Brno

Jihlavská 20

625 00 Brno

e-mail: alicah@post.cz

Přijato k recenzi: 26. 6. 2018

Přijato do tisku: 14. 8. 2018