MikroRNA jako biomarkery odpovědi na léčbu sunitinibem u pacientů s metastatickým karcinomem ledvin – pilotní studie

Overview

Východiska:
Karcinom ledviny tvoří 2–3 % všech zhoubných nádorů. Léčba metastatické formy tohoto onemocnění se opírá zejména o tyrozinkinázové inhibitory (TKI). Pro efektivní indikaci TKI je nevyhnutelná předpověď léčebné odpovědi pacientů. Cílem této práce proto bylo nezávislé ověření výsledků dosud publikovaných studií zabývajících se prediktivním potenciálem mikroRNA (miRNA).

Materiál a metody:
Zvolili jsme sedm nejvýznamnějších kandidátních miRNA a analyzovali jsme jejich expresi u 44 pacientů rozdělených do skupiny se špatnou a dobrou odpovědí na léčbu sunitinibem, rozdělených dle délky období do progrese. Vzorky nádorové tkáně jsme analyzovali metodou kvantitativní PCR za použití specifických sond TaqMan pro testované miRNA.

Výsledky:
Potvrdili jsme, že dvě miRNA jsou odlišně exprimovány u pacientů odpovídajících a neodpovídajících na léčbu sunitinibem. Ostatní analyzované miRNA neměly prediktivní potenciál.

Závěr:
Z dosud studovaných miRNA se nám podařilo potvrdit prediktivní potenciál u dvou studovaných miRNA.

Klíčová slova:
mikroRNA – renální karcinom – sunitib

Úvod

Metastatický renální karcinom (metastatic renal cell carcinoma – mRCC) je v současnosti léčen zejména tyrozinkinázovými inhibitory (TKI), přičemž v 1. linii je nejpoužívanějším léčebným přípravkem sunitinib [1]. Přestože téměř u všech pacientů dochází ke vzniku rezistence, existuje velká variabilita v délce období do progrese (progression-free survival – PFS) trvající od několika týdnů po nasazení léčby až po více než 24 měsíců [2]. U některých pacientů existuje primární rezistence nádoru, u některých se vytvoří až postupně. Dnes však není možné tyto pacienty předem identifikovat a včas jim poskytnout další léčebné možnosti 2. a 3. linie bez zbytečných časových, zdravotních a finančních ztrát [1].

MikroRNA (miRNA) představují velkou skupinu krátkých (18–25 nukleotidů) nekódujících RNA, které posttranskripčně regulují genovou expresi. Komplementární vazbou na oblast 3’UTR své cílové molekuly mRNA způsobují její destabilizaci nebo iniciují degradaci komplexu mRNA-miRNA. Tímto způsobem regulují více než 50 % lidského genomu a účastní se jak fyziologických, tak patologických procesů [3]. miRNA jsou detekovatelné ve všech tkáních a tělních tekutinách a vychýlení jejich hladin z normálních hodnot může sloužit jako diagnostický, prognostický a prediktivní ukazatel [4]. Mezi výsledky prací, které se věnují prediktivnímu potenciálu miRNA u mRCC existují průniky, byly ovšem získány na relativně malých kohortách pacientů [5–10]. Nezávislé ověření je proto nevyhnutelné pro další vývoj v personalizaci léčby RCC.

Materiál a metody

Ve studii byly použity vzorky tkáně primárních tumorů fixované ve formalinu a archivované v parafinu (formalin-fixed paraffin-embedded – FFPE) získané ve čtyřech onkologických centrech v ČR (Masarykův onkologický ústav, Brno; Thomayerova nemocnice, Praha; Fakultní nemocnice Plzeň; Fakultní nemocnice Hradec Králové) v letech 2008–2014 od pacientů s mRCC léčených sunitinibem. Klinicko-patologická data byla získána z registru RENIS a z lékařských záznamů. Místní etické komise ve všech centrech schválily postup studie a všichni pacienti podepsali informovaný souhlas. Nejlepší dosažená léčebná odpověď podle kritérií RECIST a délka PFS byly použity pro definici odpovědi na léčbu, přičemž PFS delší než 18 měsíců s kompletní nebo částečnou remisí nebo se stabilizací onemocnění bylo považováno za dobrou odpověď. PFS kratší než 6 měsíců a progrese nebo pouze stabilizace onemocnění byla definována jako špatná léčebná odpověď. Podle uvedených kritérií bylo vybráno 44 pacientů (24 odpovídajících, 20 neodpovídajících na léčbu). Na základě vyhledávání v dostupné literatuře jsme vybrali sedm kandidátních miRNA vhodných pro ověření – miR-155, miR-484, miR-221, miR-222, miR-133, miR-410 a miR-942.

Celková RNA obohacená o krátké RNA byla izolována pomocí komerční izolační sady mirVANA miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, USA). Koncentrace a čistota RNA byly změřeny pomocí přístroje Nanodrop 2000c (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA). V reverzní transkripci a qRT-PCR byly použity primery specifické pro vybrané miRNA a reakčních chemikálií TaqMan Universal PCR Master Mix II, No UNG, postupovalo se podle protokolu výrobce (TaqMan miRNA Assay protocol, Applied Biosystems). qRT-PCR byla provedena v duplikátu pro každý vzorek na přístroji LightCycler 480 (Roche Life Science, Basel, Switzerland).

Hladina exprese byla normalizována relativně k průměrné expresi všech testovaných miRNA. Výsledky byly statisticky vyhodnoceny Mann-Whitney U testem, ROC analýzou a kombinovanou Kaplan-Meierovou analýzou v softwaru GraphPad Prism 5. Hladina hodnoty p < 0,05 byla považována za statisticky významnou.

Výsledky

U pacientů neodpovídajících na léčbu byly významně zvýšeně exprimovány miR-133 a miR-942 (p < 0,05). Hladina miR-942, nejvíce deregulované miRNA, byla zvýšená 2,86×. Z ostatních miRNA vykazovala asociaci s léčebnou odpovědí miR-221 (p < 0,1), jejíž hladiny byly snížené u neodpovídajících pacientů.

Závěr

V současnosti je dostupných šest původních prací pojednávajících o prediktivním potenciálu miRNA u mRCC [5–10]. Kromě jiných faktorů se malé soubory pacientů v jednotlivých studiích zdají být důvodem, proč se jejich výsledky překrývají jen minimálně. Berkers et al [7] pozorovali zvýšenou hladinu miR-155 u pacientů s horší odpovědí, což bylo později potvrzeno také v dalších dvou publikacích [5,9]. miR-484 byla také vzájemně potvrzena ve dvou studiích [5,8].

V naší studii jsme pozorovali, že miR-133 a miR-942 jsou zvýšeně exprimované u pacientů s horší odpovědí na léčbu sunitinibem, jak již bylo pozorováno také v minulosti [8]. Prediktivní potenciál nebyl potvrzen u ostatních testovaných miRNA, ukázala se však slabá asociace mezi odpovědí na léčbu a hladinou miR-221. Po potvrzení dalšími rozsáhlejšími studiemi mohou hladiny miR-133 a miR-942, které jsme v naší studii nezávisle validovali, sloužit v budoucnu jako jeden z nástrojů pro personalizaci léčby u pacientů s mRCC.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Tato studie byla vypracována s grantovou podporou Ministerstva zdravotnictví České republiky, grant č. 15-34678A. Všechna práva vyhrazena.

doc. MUDr. Ondřej Slabý, Ph.D.

CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU

Kamenice 753/5 625 00 Brno

e-mail: on.slaby@gmail.com

Obdrženo: 19. 3. 2018

Přijato: 20. 3. 2018