Využití mikroRNA ve slinách pro diagnostiku nádorových onemocnění

Overview

Východiska:
Jedním z moderních přístupů identifikace biomarkerů nádorových onemocnění, a to jak na tkáňové úrovni, tak i v tělních tekutinách, je profilování exprese mikroRNA (miRNA). miRNA tvoří skupinu téměř 3 000 krátkých, 18–25 nukleotidů dlouhých nekódujících RNA. Slouží jako regulační prvky, které řídí expresi genů na posttranskripční úrovni, tj. na úrovni molekul mRNA. Schopnost miRNA inhibovat translaci či indukovat degradaci onkogenů a nádorových supresorů je podstatou jejich zapojení do procesů kancerogeneze. Důkazů o funkcích miRNA v regulaci procesů, jako jsou apoptóza, buněčná proliferace, diferenciace či invazivita, neustále přibývá. Analýza expresních profilů miRNA je proto stále častěji využívána pro účely molekulární diagnostiky nádorových onemocnění, analogicky jako je tomu u studií založených na profilování kódujících RNA. Z hlediska analytického využití je podstatná skutečnost, že miRNA jsou vysoce stabilní v tělních tekutinách vč. slin a vyskytují se zde v relativně vysokých hladinách. miRNA ve slinách již byly pro diagnostické účely úspěšně testovány u řady nádorových onemocnění, přičemž hlavní výhodou slin jako biologického materiálu je skutečnost, že jsou získatelné zcela neinvazivně.

Cíl:
Cílem přehledového článku je shrnout dosavadní míru poznání z oblasti cirkulujících miRNA u nádorových onemocnění se zaměřením na využití miRNA ve slinách pro účely onkologické diagnostiky.

Klíčová slova:
mikroRNA – sliny – diagnostika – nádorové onemocnění

Úvod

MikroRNA (miRNA) jsou krátké nekódující molekuly RNA o délce 18–25 nukleotidů, které posttranskripčně regulují genovou expresi. miRNA byly popsány teprve na začáku 90. let 20. století a od té doby bylo zjištěno, že se v organizmech účastní biologických dějů, jako je např. proliferace, buněčný cyklus, apoptóza, diferenciace či invazivita. Význam miRNA v diagnostice a prognostikaci nádorových onemocnění proto neustále narůstá. Téměř polovina současného výzkumu v oblasti miRNA je zaměřena na studium deregulace miRNA u nádorových onemocnění. Včasná dia-gnostika mnoha nádorových onemocnění zvyšuje pravděpodobnost úspěšné léčby, jedním z hlavních cílů výzkumu miRNA v onkologii je proto také nalézení nových neinvazivních diagnostických biomarkerů.

miRNA vyskytující se v tělních tekutinách jako tzv. cirkulující miRNA byly popsány v krvi, a to v plazmě i séru, moči, mateřském mléku, slzách a slinách. Tělní tekutiny představují snáze dostupná diagnostická média, než jsou např. vzorky tkání, a proto sledování pozměněných hladin miRNA v tělních tekutinách u různých onemocnění nabízí velmi zajímavé možnosti využití.

V tomto přehledovém článku je věnována pozornost miRNA ve slinách, které vykazují odlišné hladiny u pacientů s nádorovým onemocněním v porovnání se zdravými kontrolami, případně mezi pacienty v různých stadiích onemocnění. Až do současnosti byly popsány odlišné hladiny miRNA ve slinách u nádorů hlavy a krku, jícnu, slinivky břišní, tlustého střeva a konečníku.

Sliny – využití v diagnostice

Sliny představují jednoduše dostupné diagnostické médium, neboť slinné žlázy jsou obklopeny krevními kapilárami a pro jejich vzájemnou vysokou propustnost může docházet k výměně molekul. Biomarkery původem z krve se proto mohou vylučovat do slin, jejichž odběr za účelem diagnostiky různých patologických stavů je jednoduchý a neinvazivní [1]. Sliny jsou oproti krvi médiem, které lze odebírat bez rizika i u zvláštních skupin pacientů, jako jsou děti, hemofilici nebo osoby užívající intravenózně narkotika [2].

Termín „salivaomics“ lze volně přeložit jako přístup založený na vysokokapacitních metodách zabývající se studiem molekul přítomných ve slinách s cílem odhalit potenciál těchto molekul v diagnostice různých patologických stavů. V současnosti tento termín zahrnuje studium šesti typů molekul, a to DNA (tedy genom a epigenom v případě metylovaných genů), mRNA a miRNA (transkriptom), metabolických látek (metabolom), proteinů (proteom) a mikrobů (mikrobiom) [3,4]. Využití slin v diagnostice bylo hojně popisováno i ve 20. století [5,6] a ve 21. století tento trend stále sílí. Mezi onemocnění, u kterých bylo popsáno využití slinných biomarkerů, patří např. onemocnění periodontu [7], riziko zubního kazu [8], nádorové bujení [9,10], autoimunitní choroby, jako je Sjörgenův syndrom [11] či celiakie [12], kardiovaskulární choroby [13], metabolické choroby [14] či infekční onemocnění [15].

Genom ve slinách člověka je tvořen jak lidskou, tak mikrobiální DNA. Genetické a epigenetické změny při patologických procesech mohou být tedy sledovány i ve slinách. Kupříkladu byly stanoveny odlišné stupně metylace promotorů ve slinách u pacientů s karcinomem dutiny ústní [16]. Proteom ve slinách je tvořen přibližně z 3 000 proteinů vykonávajících různé biologické funkce [17]. Proteiny jako biomarkery byly popsány v mnoha studiích, např. u sledování odpovědi pacientek na terapii karcinomu prsu [18] nebo u pacientů s periodontitidou [19]. Metabolom je soubor všech metabolitů, které také mohou být využívány jako biomarkery onemocnění. Například studie z roku 2010 popsala odlišné profily metabolitů u pacientů s nádory dutiny ústní, prsu a pankreatu [20], dále byl identifikován metabolom pacientů s neurodegenerativní demencí [21]. Mikrobiom představuje mikroorganizmy kolonizující dutinu ústní, kterých bylo identifikováno přes 600 druhů [22]. Existuje ale i studie zvyšující toto číslo na 10 000 druhů [23]. Sliny mohou být použity k diagnostice infekčních chorob nejen kultivačními, ale i molekulárními metodami [24,25]. Navíc bylo popsáno specifické složení mikrobiomu u neinfekčních onemocnění, jako je např. karcinom pankreatu [26], nebo dokonce obezita [27]. Transkriptom (mRNA) ve slinách byl popsán roku 2004 [28] a od té doby bylo publikováno několik studií zabývajících se mRNA biomarkery u nádorových a jiných systémových onemocnění. Specifický transkriptom byl popsán u karcinomu pankreatu [29] či plic [30], dále například u Sjörgenova syndromu [11].

miRNA ve slinách byly prokázány roku 2009, a to v souvislosti s dlaždicobuněčným karcinomem dutiny ústní (oral squamous cell carcinoma – OSCC) [31]. Zájem o deregulaci těchto krátkých nekódujících RNA ve slinách u různých onemocnění poté narostl. Deregulace miRNA ve slinách byla popsána u pacientů s autismem [32], se Sjörgenovým syndromem [33], a dokonce bylo navrženo, že by mohla souviset se stárnutím [34]. Nejvíce studií v dané oblasti ale sleduje deregulace miRNA v souvislosti s nádorovými onemocněními, o kterých také pojednává tento přehledový článek.

MikroRNA

miRNA jsou krátké nekódující molekuly RNA o délce 18–25 nukleotidů vznikající v buňce dvoustupňovým procesem. Poprvé byly miRNA popsány roku 1993 u Caenorhabditis elegans. Bylo zjištěno, že jeden ze zkoumaných genů, lin-4, nekóduje žádný protein, ale pouze transkripty o přibližné délce 22 nukleotidů [35], které jsou díky komplementárním sekvencím k opakovaným sekvencím v nepřekládané oblasti na 3‘ konci (3‘untranslated region – 3’UTR) oblasti genu lin-14 schopny regulovat jeho expresi [36]. Roku 2000 bylo objeveno, že i gen let-7 u C. elegans kóduje 21-nukleotidové RNA komplementární k elementům v 3’UTR genu lin-41, které regulují expresi tohoto genu [37]. Záhy bylo zjištěno, že gen let-7 se nachází i u dalších organizmů vč. člověka a bylo navrženo, že jeho transkripty, tedy přibližně 21nukleotidové RNA, mají původ v prekurzorech vlásenkovitých struktur [38]. Název mikroRNA (se zkratkou miRNA nebo miR) vznikl roku 2001, kdy byly ve třech laboratořích identifikovány další druhy těchto krátkých molekul [39–41].

Význam miRNA v nádorové transformaci u člověka jako první popsali Carlo Croce a George Calin, kteří zkoumali deleci na chromozomu v oblasti 13q14, která se vyskytuje u více než poloviny pacientů s chronickou lymfocytární leukemií. Zjistili, že v dané oblasti se nacházejí geny mir-15 a mir-16, jejichž snížená exprese by mohla vést ke vzniku leukemie [42]. Brzy poté byly identifikovány snížené hladiny miR-143 a miR-145 u pacientů s kolorektálním karcinomem (colorectal cancer – CRC) [43], nižší exprese let-7 byla zaznamenána u pacientů s rakovinou plic [44] a další miRNA se změněnou expresí byly popsány u glioblastomu [45] a u rakoviny prsu [46].

Od té doby až do současnosti bylo dle databáze miRBase popsáno 2 588 lidských miRNA (miRBase Sequence Database, Release 21, dostupná online na www.mirbase.org) [47], přičemž jejich význam při vzniku rakoviny neustále narůstá. Díky profilování miRNA a hlubokému sekvenování [47,48] přibývá důkazů o možnostech využití miRNA v diagnostice, prognostikaci, a dokonce terapii nádorových onemocnění [49–51].

Biogeneze miRNA je proces, kdy jsou geny mir přepisovány a překládány v tzv. primární miRNA (pri-miRNA), které jsou následně upraveny v tzv. prekurzorové miRNA (pre-miRNA) a poté ve zralé miRNA za účasti ribonukleáz a dalších proteinů [52–55]. Zralé jednořetězcové miRNA jsou vázány do umlčujícího komplexu indukovaného RNA (RNA-induced silencing complex – RISC), který je schopen regulace genové exprese na posttranskripční úrovni [56–58]. Regulace probíhá dvojím způsobem v závislosti na komplementaritě mezi miRNA a cílovou mRNA. Je-li komplementarita úplná nebo téměř úplná, dochází k degradaci cílové mRNA, kde se uplatňuje princip RNA interference [59–61]. Pokud je komplementarita pouze částečná, dochází k represi translace vazbou na 3’UTR cílové mRNA [36]. Hlavní biologické funkce miRNA zahrnují regulaci diferenciace a proliferace buněk [35], apoptózy [62], metabolizmu lipidů [63] a glukózy [64] či odpověď na stres [63]. Dysregulace a porušená funkce miRNA mohou tedy vést ke vzniku různých onemocnění, jako jsou např. kardiovaskulární [65], neurologické choroby [66] a převážně onemocnění nádorová [42], kde miRNA fungují jako onkogeny i jako nádorové supresory [67].

Cirkulující miRNA

Roku 2008 bylo poprvé popsáno, že se miRNA vyskytují v tělních tekutinách, konkrétně v plazmě a séru, ve vysoce stabilní formě [68,69]. Navíc byly toho roku detekovány zvýšené hladiny miRNA v séru pacientů s nádorovými onemocněními, jako je difuzní velkobuněčný B lymfom [70] a karcinom prostaty [71]. Přítomnost miRNA byla v následujících letech popsána i v dalších tělních tekutinách, a to ve slinách [31,72], moči [73], slzách či mateřském mléce [74,75]. Sekrece miRNA do tělních tekutin probíhá dvěma hlavními způsoby. Sekrece může být buď pasivní, kdy se miRNA uvolňují do cirkulace z poškozených buněk či tkání [69,71,76], např. při metastázování či chronických zánětech nebo z krátce žijících krevních buněk, jako jsou trombocyty a monocyty [77]. Druhým způsobem je aktivní sekrece. miRNA mohou být uvolňovány v extracelulárních vezikulech, jako jsou mikrovezikuly [78,79], mezi které se řadí i exozomy [80]. Další vezikuly obsahující cirkulující miRNA jsou apoptická tělíska [81]. Bylo zjištěno, že se miRNA mohou vyskytovat i mimo vezikuly, a to ve vazbě na proteiny Ago2 [82] a Ago1, Ago3, Ago4 [83], nukleofosmin 1 [84] a HDL [85]. Jednotlivé formy cirkulujících miRNA popisuje obr. 1 [86].

Cirkulující miRNA vykazují vysoký stupeň stability. Hladiny miRNA se nemění při inkubaci při pokojové teplotě [71], při 4 °C a uchovávání při –70 °C [87], zůstávají stabilní po mnoha cyklech zamražování a rozmražování, po varu a po působení vysokých a nízkých hodnot pH [69]. Odolávají působení RNáz, které jsou přítomny v krvi [69,71,88]. Předpokládá se, že stabilita miRNA v tělních tekutinách je zajištěna uzavřením v mikrovezikulech [78–80] a vazbou na proteiny [82,84,85]. Mikrovezikuly se zdají být odolnější proti působení RNáz než miRNA v komplexu s proteiny [89]. Byla také vyslovena hypotéza, že cirkulující miRNA může být chráněna modifikacemi. Mezi obecné modifikace miRNA patří metylace [90], adenylace [91] a uridylace [92]. Vychází se z předpokladu, že tatáž miRNA je odolnější vůči působení RNáz v cirkulaci než v tkáni či buňce, a proto je možné, že je tato odolnost zajištěna právě zmíněnými modifikacemi. Nicméně modifikované cirkulující miRNA ještě nebyly prokázány [77].

miRNA jako hormony

V souvislosti s objevem cirkulujících miRNA bylo navrženo, že miRNA mohou fungovat jako hormony, tedy jako signální molekuly přenášející informace mezi donorovými a recipientními buňkami či tkáněmi. První důkaz o této funkci miRNA byl podán ve studii z roku 2007, kdy bylo zjištěno, že miRNA jsou transportovány v exozomech a že tyto exozomy jsou předávány mezi buňkami [80]. Koncept cirkulujících miRNA jako hormonů byl popsán v mnoha studiích, počínaje rokem 2008, kdy Hunter et al prokázali přítomnost miRNA v mikrovezikulech v periferní krvi u zdravých jedinců a navrhli, že by tyto miRNA mohly regulovat homeostázu krevních buněk a jejich metabolické dráhy [78]. Následně Skog et al pozorovali mikrovezikuly pocházející z glioblastomu. Tyto mikrovezikuly obsahovaly proteiny, mRNA a miRNA a byly transformovány normálními buňkami v signály podporující nádorové bujení [93]. miRNA se v cirkulaci vyskytují i v apoptických tělískách. Tento objev přinesl také zjištění, že se konkrétně miR-126 může podílet na inhibici rozvoje aterosklerózy u myší [81] a v souladu s tímto zjištěním byly pozorovány nižší hladiny miR-126 u pacientů s koronární aterosklerózou [94].

Další možností transportu miRNA v cirkulaci je vazba na proteiny. Tyto miRNA jsou cílovými buňkami z cirkulace zachycovány pomocí receptorů, které rozeznávají proteiny vázající RNA [85,95]. Zatím bylo popsáno působení miRNA jako hormonu pouze v komplexu s HDL, kdy po přijetí takového komplexu recipientní buňkou došlo k posttranskripční regulaci příslušné mRNA [85].

Mnoho dalších studií se zabývá mezibuněčnou komunikací pomocí cirkulujících miRNA, a to především ve veziklech, neboť tyto miRNA by mohly být potenciálně využity k terapeutickým účelům [96]. Tyto objevy značí, že cirkulující miRNA významně ovlivňují buňky a tkáně v různých částech těla, a to dvojím způsobem – mohou napomáhat progresi onemocnění (destruktivní efekt), nebo před poškozením organizmu chránit (protektivní efekt) [97]. Tyto poznatky představují nové možnosti využití cirkulujících miRNA, a proto je v této oblasti veden intenzivní výzkum.

Metodické aspekty detekce cirkulujících miRNA

I přes značné výhody cirkulujících miRNA zůstává jejich detekce náročná. Pro významné rozdíly ve výsledcích izolace, měření a kvantifikace miRNA prováděných různými metodami neexistuje jednotný postup, který by byl aplikovatelný pro klinické využití cirkulujících miRNA jako biomarkerů. Tyto rozdíly jsou dány především odlišným zpracováním vzorků, neefektivní izolací, hemolýzou ve vzorcích krve, ne vždy spolehlivou účinností reverzní transkripce a polymerázové řetězové reakce (polymerase chain reaction – PCR), které se ke kvantifikaci miRNA užívají, či nejednotností v používání referenčních genů [96,98].

Prvním krokem v detekci miRNA z tělních tekutin je nakládání se samotným vzorkem. V případě krevních vzorků je situace komplikována skutečností, že trombocyty, leukocyty [78,99] i erytrocyty [100] obsahují vlastní miRNA, a je proto možné, že uměle zvyšují hladiny extracelulárních miRNA. Bylo dokázáno, že koncentrace miRNA se měnily při dlouhodobém uchovávání trombocytů [101] i erytrocytů [102] při pokojové teplotě a že hladiny miRNA ovlivňuje i hemolýza erytrocytů [103]. Zvyšování počtů krevních elementů při některých patologických podmínkách může také měnit koncentrace extracelulárních miRNA [104], stejně jako se miRNA mohou vyplavovat z trombocytů při srážení krve za účelem získání séra [105]. S tím se pojí i výběr samotného koagulačního činidla. Bylo zjištěno, že nejlepší volbou je kyselina ethylendiamintetraoctová (ethylenediaminetetraacetic acid – EDTA), neboť citrát i heparin, které se pro koagulaci také využívají, mohou inhibovat kvantitativní PCR (qPCR) [106,107]. Faktory jako např. hemolýza nejsou v případě slin relevantní, nicméně kontaminace vzorku miRNA pocházejícími z buněčných elementů slin (např. epiteliální buňky dutiny ústní, leukocyty či trombocyty) problém představuje.

Izolaci miRNA z tělních tekutin, konkrétně z plazmy a séra, komplikuje více faktorů. Je mezi nimi i přítomnost proteinů, které mohou zhoršit výtěžnost izolace a následně i ovlivnit průběh PCR [108]. miRNA se také v tělních tekutinách vyskytují ve velmi nízkých koncentracích [109]. Pro izolaci miRNA se používají různé komerční kity, jejichž vhodnost porovnávalo již mnoho studií. Jednotlivé kity se v úspěšnosti izolace extracelulární RNA odlišují [110,111].

Dalším krokem je kvantifikace izolované miRNA, která probíhá nejčastěji třemi způsoby. Nejvíce používanou metodou je qPCR, dále sekvenování nové generace či hybridizační metody s použitím mikročipů. Každá z těchto metod poskytuje jisté výhody i nevýhody, jako jsou např. rozdíly v senzitivitě a specificitě, kapacitě přístrojů či ceně [112]. Faktory ovlivňující detekci volných miRNA ve slinách jsou shrnuty v tab. 1.

Diagnostické využití miRNA ve slinách

miRNA byly poprvé ve slinách detekovány roku 2009, kdy byla prokázána přítomnost miRNA ve slinách i ve slinném supernatantu [31]. miRNA byly následně ve slinách detekovány v exozomech [72], přičemž bylo zjištěno, že v této formě se vyskytují nejvíce [113]. Bylo navrženo, že by miRNA ve slinách mohly sloužit jako biomarkery nádorových a jiných onemocnění, především z oblasti hlavy a krku. Ideální biomarkery by měly být senzitivní a specifické, stabilní, měly by být produktem drah zapojených přímo do vzniku onemocnění, neovlivnitelné potravou, měřitelné v mezích detekce [114], dostupné neinvazivními metodami, specifické pro danou chorobu, měly by chorobu předpovídat ještě před nástupem klinických příznaků a biomarkery nalezené u modelových organizmů by měly být použitelné i u člověka [74]. Mezi RNA biomarkery řadíme i miRNA, a to tkáňové i extracelulární neboli cirkulující. V mnoha studiích byla popsána deregulace exprese miRNA při různých onemocněních vč. nádorových [115]. miRNA ve slinách se řadí mezi cirkulující miRNA. Tyto miRNA jsou vhodnými biomarkery nádorových onemocnění z mnoha důvodů. Jsou to méně komplexní molekuly bez posttranskripčních modifikací, jejich detekce a amplifikace je snadná a jejich sekvence jsou konzervované u člověka a u dalších modelových organizmů [74]. Změny jejich exprese se snadno detekují a jejich expresní profily jsou pro danou tělní tekutinu specifické [69]. miRNA ve slinách tyto podmínky splňují. Vyskytují se ve vysoce stabilní formě [116] a jejich exprese je u nádorových onemocnění deregulována [31]. Sliny samy o sobě jsou vhodným médiem pro využití v diagnostice onemocnění. Odběr slin je nenáročný, neinvazivní, vzorky se jednoduše zpracovávají, transportují i uchovávají [117].

Následující podkapitoly popisují jednotlivé studie zabývající se výskytem miRNA ve slinách ve spojitosti s nádorovými onemocněními. Souhrn všech deregulovaných miRNA poskytuje tab. 2.

Nádory hlavy a krku

Nádory hlavy a krku zahrnují nádory dutiny ústní, faryngu (konkrétně nasofaryngu, orofaryngu a hypofaryngu), laryngu, dutiny nosní a vedlejších dutin nosních, velkých a malých slinných žláz [118]. Jedná se o velmi časté nádorové onemocnění, ročně je na celém světě diagnostikováno kolem 900 000 nových případů [119]. Nejčastějším buněčným typem je dlaždicobuněčný (spinocelulární) karcinom, který tvoří až 90 % všech nádorů hlavy a krku. Postihuje nejčastěji rty, dutinu ústní, hltan i hrtan [120]. Jedná se o maligní nádor vyvíjející se z dlaždicových buněk, které lemují dýchací a trávicí trakt a který může metastazovat lymfatickými cévami [121]. Protože je míra přežití dlaždicobuněčného karcinomu (squamous cell carcinoma – SCC velice nízká [120], hledají se nové způsoby časné detekce onemocnění a úspěšné léčby.

Spojitost mezi dlaždicobuněčným karcinomem hlavy a krku (head and neck squamous cell carcinoma – HNSCC) a miRNA byla objevena roku 2008, kdy byla tkáňová miR-21 analyzována jako onkogen podporující růst nádoru. Pro studii byli vybráni pacienti s nádory orofaryngu, dutiny ústní, laryngu a hypofaryngu [122]. miRNA ve slinách byla objevena o rok později, a to u pacientů s OSCC [31]. Od tohoto objevu se výzkumné týmy zaměřily na využití miRNA ve slinách jako biomarkerů pro diagnostiku HNSCC, zvláště pro OSCC, v jehož případě se sliny zdají být vhodnějším médiem než plazma či vzorky tkání, neboť karcinom přímo omývají [123]. Navíc ve slinách byly již pro diagnostiku OSCC biomarkery popsány, a to biomarkery proteinové [124], mRNA biomarkery [9] a DNA biomarkery [125].

OSCC tvoří až 90 % všech nádorů dutiny ústní. Jedná se o agresivní karcinom s vysokou mortalitou, nicméně při časné detekci onemocnění se míra přežití zvyšuje až na 90 % [126]. Při porovnání pacientů s OSCC se zdravými kontrolami byla poprvé zaznamenána odlišná exprese miRNA ve slinách roku 2009. Jednalo se o snížení hladin miR-200a a miR-125 u pacientů s OSCC. Bylo tedy navrženo, že by se tyto dvě miRNA mohly užívat jako neinvazivní a rychlé diagnostické markery v diagnostice OSCC [31]. Wiklund et al následně pozorovali aberantní expresi miR-375 a metylaci miR-200c-141 u OSCC jak ve tkáních, tak ve slinách [127].

OSCC se většinou vyvíjí z prekanceróz, mezi které patří např. leukoplakie. Časná detekce prekanceróz snižuje riziko rozvoje nádoru [128]. Byla proto zkoumána exprese miRNA ve slinách u prekanceróz dutiny ústní. První studie porovnávala deregulaci exprese miRNA ve slinách u progresivní a neprogresivní orální leukoplakie. Byla prokázána odlišná exprese 25 miRNA, přičemž signifikantní rozdíly mezi progresivními a neprogresivními leukoplakiemi vykazovaly miR-10b, miR-145, miR-708, miR-181c a miR-99b. Byla také srovnávána exprese miRNA ve tkáni pacientů s podobnými leukoplakiemi s expresí miRNA ve slinách a byla detekována deregulovaná exprese stejných miRNA, ačkoli hladiny miRNA ve slinách byly nižší [129]. Ve druhé studii bylo zjištěno, že zvýšená exprese miR-21, miR-145 a miR-184 může napomáhat časné diagnostice prekanceróz, které se maligně transformují v OSCC, přičemž pouze v případě miR-184 existuje statisticky signifikantní korelace [130]. Hung et al o rok později popsali, že hladiny miR-21a miR-31 jsou zvýšeny u pacientů s prekancerózami dutiny ústní [131], což je v souladu s výsledky studie z roku 2012, kdy byly zvýšené hladiny miR-31 ve slinách popsány u OSCC. V této studii bylo navíc pozorováno, že po excizi karcinomu hladiny miR-31 prudce poklesly [132].

Další poznatky poskytla rozsáhlá studie, ve které byly porovnávány vzorky slin od pacientů s OSCC, OSCC v remisi, orálním lichen planus a od zdravých kontrol. Nejdůležitějším nálezem byly zvýšené hladiny miR-27b u pacientů s OSCC oproti všem ostatním skupinám, což z miR-27b činí důležitý biomarker tohoto onemocnění. Byly pozorovány i snížené hladiny miR-136 u OSCC oproti zdravým kontrolám i OSCC v remisi [133].

Mezi další miRNA, které byly navrženy jako nové neinvazivní markery HNSCC, patří i miR-9, miR-191 a miR-134. Navíc byla popsána metoda pro izolaci velkého množství miRNA i z malého objemu slin [134]. Dále bylo objeveno, že miR-372 podporuje rozvoj HNSCC a že její hladiny po resekci tumoru klesly [135].

Mezi HNSCC, resp. OSCC, se řadí i dlaždicobuněčný karcinom jazyka (tongue squamous cell carcinoma – TSCC). Jazyk bývá postižen karcinomem ve 41 % případů karcinomů dutiny ústní [136]. Duz et al popsali snížené hladiny miR-193-5p u pacientů s TSCC oproti zdravým kontrolám. Nadto zjistili, že ve vzorcích slin odebraných po operaci tumoru se hladiny této miR vrátily k normálu, což by z miR-193-5p mohlo činit marker specifický pro TSCC [137].

První studie zkoumající deregulaci exprese miRNA ve slinách pacientů s karcinomy slinných žláz se zaměřila na karcinom příušní žlázy. V této studii byly popsány rozdíly exprese miRNA u benigních a maligních nádorů příušní žlázy. Největší specificitu, a tedy i možnost klinického využití, vykazovala kombinace navrhovaných markerů miR-140,miR-223, miR-15b a miR-132 [138]. Stejní autoři také sledovali rozdíly v expresi miRNA ve slinách u pacientů s různými histologickými typy nádorů příušní žlázy, a to benigními i maligními. Ve výsledku identifikovali sedm miRNA s vyšší expresí u pacientů s nádorem, z toho vybrali dvě miRNA, miR-1233 a miR-211, jako biomarkery nádorů příušní žlázy s 91% senzitivitou a 86% specificitou. V této studii bylo také zjištěno, že pět ze sedmi miRNA, které vykazovaly odlišnou expresi u pacientů s nádorem a u zdravých kontrol, nebylo exprimováno ve slinách získaných přímo z příušní žlázy. Z toho plyne, že by tyto miRNA neměly být specificky exprimovány či vylučovány postiženou příušní žlázou [139].

Nádory jícnu

Karcinom jícnu představoval v roce 2015 celosvětově jedenácté nejčastější nádorové onemocnění s incidencí 483 000 a šestou nejčastější příčinu úmrtí kvůli nádoru se 439 000 úmrtími za rok [119]. Nádory jícnu se dělí na dva hlavní typy – SCC vyvíjející se z epitelových buněk, a adenokarcinom, který mívá počátek v dolní části jícnu [140]. Z důvodu hledání alternativy k invazivním vyšetřením a nutnosti časné diagnostiky onemocnění bylo zkoumáno, zda by miRNA ve slinách nemohly představovat nové biomarkery karcinomu jícnu. První studie se zabývala expresí miRNA ve slinném supernatantu pacientů. Byly pozorovány zvýšené hladiny miR-21 [141]. V další studii byly analyzovány vzorky slin i supernatantu slin. Ve slinách byla zaznamenána zvýšená exprese miR-10b*, miR-144 a miR-451, v supernatantu kromě jmenovaných i exprese miR-21. Tyto miRNA byly tedy navrhnuty jako nové biomarkery karcinomu jícnu [142]. Další studie se zabývala miRNA ve slinách i tkáních u dlaždicobuněčného karcinomu jícnu (esophageal squamous cell carcinoma – ESCC). Byly pozorovány zvýšené hladiny miR-196a ve tkáních i ve slinách oproti zdravým kontrolám. Dále byla zkoumána funkce miR-196a v patogenezi ESCC. Byl vysloven názor, že se tato miRNA zapojuje do několika významných signálních drah, jako je např. regulace buněčného cyklu pomocí proteinu p53, a mohla by se proto podílet na inhibici apoptózy nádorových buněk [143].

Nádory slinivky břišní

Nádory slinivky břišní představovaly roku 2012 sedmou nejčastější příčinu úmrtí způsobenou nádorovým onemocněním [144]. Počet nových případů za rok 2015 se pohyboval okolo 425 000 [119]. Nejčastějším typem karcinomu pankreatu je duktální adenokarcinom se zastoupením 85 % [145]. Karcinom postupuje agresivně a neexistuje efektivní screening pro jeho časnou detekci. V důsledku toho se onemocnění až v 85 % případů dostane do pokročilých stadií, kdy je chirurgická léčba možná pouze u 15 % pacientů [146]. Pozdní stadia karcinomu nelze resekovat, protože již metastazuje ve vzdálenějších částech těla či vrůstá do cév [147]. Nalezení vhodného biomarkeru pro časnou detekci onemocnění by tedy mohlo zlepšit jeho prognózu.

První studie zabývající se vhodností miRNA jako biomarkerů nádorů pankreatu sledovaly a zaznamenaly změnu exprese miRNA v plazmě [148] a tkáni [149]. Pro četné výhody slin jako diagnostického média provedli Xie et al studii exprese miRNA ve slinách u pacientů s resekabilním karcinomem pankreatu a jako biomarkery vhodné pro diagnostiku onemocnění navrhli miR-3679-5p a miR-940. Rozdílná exprese těchto miRNA byla pozorována i při porovnání maligního karcinomu pankreatu s benigním [150]. Humeau et al u pacientů s neresekabilním adenokarcinomem pankreatu zaznamenali zvýšenou expresi miR-21, miR-23a, miR-23b a miR-29c oproti zdravým kontrolám. Kromě tohoto objevu navíc popsali miR-210 a let-7c jako biomarkery pankreatitidy a miR-216 jako miRNA, jejíž exprese odlišuje pankreatitidu od karcinomu, i když v tomto případě senzitivita dosahovala pouze 50 % [146].

Další studii zabývající se miRNA ve slinách u nádorů pankreatu publikovali Machida et al. Tato studie ovšem popisuje karcinomy pankreatobiliárního traktu, který zahrnuje kromě slinivky břišní i žlučník a mimojaterní žlučové cesty. Autoři se zaměřili na exozomální miRNA, přičemž vycházeli z předpokladu, že miRNA se ve slinách vyskytují převážně v exozomech [72,113] a že již byly popsány čtyři exozomální miRNA v séru u pacientů s karcinomem slinivky. Jednalo se o miR-1246, miR-4644, miR-3976 a miR-4306 [151]. Dvě z těchto exozomálních miRNA, miR-1246 a miR-4644, vykazovaly zvýšené hladiny exprese i ve vzorcích slin pacientů s pankreatobiliárním karcinomem. Bylo tedy navrženo, že tyto exozomální miRNA mají původ v postižené tkáni, neboť zvýšené hladiny miR-1246 u pacientů s pankreatobiliárním karcinomem byly pozorovány i ve tkáních [152], ze kterých se mohou vyplavovat do krve a z krve do slin. Nicméně limitací uvedené studie je fakt, že byli vybráni pouze pacienti s pokročilými stadii karcinomu. Aby byl screening karcinomu na podkladě miRNA biomarkerů efektivní, bylo by třeba provést další studie zkoumající expresní hladiny miRNA v časnějších stadiích vývoje karcinomu či u pacientů s chronickou pankreatitidou, ze které se karcinom často vyvíjí [153].

Nádory kolorekta

CRC představuje třetí nejčastější nádorové onemocnění na světě [119]. Souvislost mezi miRNA ve slinách a CRC popisuje v současnosti v anglické literatuře jediná studie, kdy byly prokázány zvýšené hladiny miR-21 u pacientů, a to nejen ve slinách, ale i v plazmě. Nicméně miR-21 ve slinách se jeví jako vhodnější biomarker pro screening CRC díky větší senzitivitě i specificitě, navíc sliny představují technicky jednodušší diagnostické médium [154].

Závěr

miRNA jsou důležité posttranskripční regulátory genové exprese a v tělních tekutinách, jako je krev, moč či sliny, představují důležité biomarkery stavu organizmu. V mnoha studiích bylo prokázáno, že se míra exprese miRNA u různých patologických stavů a onemocnění výrazně liší, přičemž nejvíce pozornosti je věnováno expresi miRNA u pacientů s nádorovými onemocněními. Porovnáváním expresních hladin miRNA u pacientů a zdravých kontrol lze identifikovat diagnostické biomarkery, porovnáním různých skupin pacientů pak biomarkery prognostické.

Využití cirkulujících miRNA ve slinách pro časnou diagnostiku a případně stanovení prognózy u pacientů s nádorovým onemocněním má nesporný potenciál pro zlepšení kvality života pacientů. U čtyř typů nádorových onemocnění, jejichž časná diagnostika je pro terapii klíčová, byla popsána významná deregulace exprese různých slinných miRNA. Zavedením metod využívajících detekce miRNA ve slinách jako biomarkerů těchto nádorových onemocnění by se tedy mohla urychlit diagnostika či příp. posoudit prognóza. Sliny navíc pro jednoduchost odběru, skladování i další zpracování představují vhodné neinvazivní diagnostické médium.

Nicméně aby slinné miRNA mohly být využívány v klinické praxi, je třeba zhodnotit vliv řady metodických aspektů způsobujících technologickou variabilitu při jejich detekci. Po nalezení optimálních analytických postupů a jejich standardizaci a po rozšíření studií na větší počet pacientů a nezávislých validacích výsledků by miRNA mohly sloužit jako užitečné biomarkery daných onemocnění.

Výsledky tohoto výzkumu byly získány v rámci projektu CEITEC 2020 (LQ1601) za fi nančního přispění Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy České republiky v rámci účelové podpory z prostředků Národního programu udržitelnosti II.

 Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do bi omedicínských časopisů

prof. RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D.

Masarykův onkologický ústav

Žlutý kopec 7

656 53 Brno

e-mail: on.slaby@gmail.com

Obdrženo: 8. 3. 2018

Přijato: 15. 5. 2018