Detekcia cirkulujúcich nádorových buniek v periférnej krvi u pacientov s urotelovým karcinómom – pilotná štúdia. Porovnanie so štandardným histologickým vyšetrením

Overview

Východiská:
Cieľom pilotnej štúdie bolo zistiť, či expresiu génov pre UP-II a EGFR RT-PCR a imunohistochemicky (IH) na vzorkách odobratých pred a po operácii možno využiť ako potenciálny nádorový marker na detekciu cirkulujúcich nádorových buniek (CNB) v periférnej krvi pacientov s TCC a výsledky porovnať so štandardným histopatologickým vyšetrením.

Materiál a metódy:
43 pacientov (33 mužov a 10 žien) s TCC o vo veku 37–85 rokov, priemer 65 ± 12 rokov. Z nich 40 (93 %) malo TCC močového mechúra, 2 (4,6 %) TCC obličkovej panvičky a 1 (2,3 %) TCC močového mechúra, močovodu a obličkovej panvičky. V rámci štúdie bolo odobratých 10 ml periférnej krvi pacientov pred a do 1 hod po operácii, imunomagneticky separované CNB a určená expresia génov EGFR a UP-II pomocou RT-PCR. Následne bolo histopatologicky vyšetrené TCC tkanivo, určená endolymfatická, intravaskulárna a perineurálna invázia, expresia CK-7, CK-20, stromelysinu, Ki-67, p 53. IH bola vykonané aj na vzorkách separovanej krvi pred a po operácii na prítomnosť CNB farbením hematoxylínom-eozínom (HE) a podľa Papanicolaua (PAP), ako aj na prítomnosť expresie CK-7, CK-20.

Výsledky:
EGFR a UP-II boli exprimované u 24 z 35 (68,6 %) a u 19 z 35 (54,3 %) vzoriek TCC tkaniva. EGFR nebol exprimovaný v žiadnej vzorke krvi ani imuno-separovaných buniek. UP-II bol exprimovaný v 1 z 19 (5,3 %) vzoriek imuno-separovaných CNB získaných pred operáciou, ale v žiadnej vzorke imuno-separovaných CNB získaných po operácii (P < 0,9999). Expresia UP-II bola detegovaná v 2 z 32 (6,3 %) vzoriek krvi odobratých pred operáciou a v 3 z 32 (9,4 %) vzoriek krvi odobratých do jednej hodiny po operačnom zákroku (P < 0,9999). U 11 zo 43 (25,6 %) pacientov sa pri histopatologickom vyšetrení zistila invázia TCC, z toho: u jedného intravaskulárna, u 6 endolymfatická, u jedného intravaskulárna a endolymfatická a u 3 intravaskulárna, endolymfatická a perineurálna. Vyšetrenie separovanej krvi pred a po operácii farbením HE a PAP a na CK-7, CK-20 bolo takmer vo všetkých vzorkách negatívne. Pri IH tkaniva TCC na CK-7, ­CK-20, stromelysin bola pozitivita v 97,7 %, 74,4 % a 97,7 %. Cytologické vyšetrenie moču bolo pozitívne u 19 (50 %) z pacientov a korelovalo s vyšším grade G3 u 20 (46,5 %) pacientov. Expresia Ki-67 bola u pacientov s G3 (31,15 %) signifikantne vyššia ako u pacientov s G1 (7,53 %) (p < 0,01). Pri skúmaní TCC tkaniva sa nenašiel signifikantný vzťah medzi grade a expresiou p53 a stromelysinu.

Záver:
Testy neukázali zmeny expresie génov pre EGFR a UP-II v periférnej krvi a v imuno-separovaných bunkách pacientov pred a po operačnom zákroku. Výsledky v tomto súbore pacientov s TCC s prevažne nižším štádiom pTNM nepotvrdili výskyt CNB TCC v periférnej krvi.

Kľúčové slová:
urotelové nádory – RT PCR – beta-aktín – uroplakin II – EGFR gen – cytokeratiny – cirkulujúce nádorové bunky – minimálna reziduálna choroba

Východiská

Detekcia a molekulová charakteristika cirkulujúcich nádorových buniek (CNB) pri nádoroch urogenitálneho sy­stému môže mať využitie v terapii a prognóze [1]. Skúmal sa aj vplyv operácie na rozsev CNB s tým, že chirurgický výkon neovplyvnil rozsev nádorových buniek. CNB sa našli iba u pacientov s metastázami (MTS) [2]. Vo viacerých štúdiách bola pri nádoroch obličiek, prostaty a urotelových nádoroch (TCC) na detekciu CNB použitá metóda RT-PCR (Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction) [3,4]. Keďže PCR má mnoho obmedzení, neustále sa vyvíjajú nové techniky detekcie CNB [5]. Pred analýzou odobratých vzoriek sa používala imunomagnetická separácia intaktných CNB a mikro MTS. Obohatené frakcie separovaných buniek sa potom mohli použiť nielen na RT-PCR detekciu nádorových buniek, ale aj na ich imunohistochemickú či imunocytochemickú analýzu alebo pri rôznych in situ hybridizačných technikách. Využitie týchto metód vedie k presnejšej kvantifikácii a molekulovej charakterizácii CNB.

Cieľom tejto štúdie bolo zistiť, či je možné použiť expresiu génov pre uroplakín-II (UP-II) a receptor epidermálneho rastového faktora (EGFR) ako markerov pre detekciu CNB v periférnej krvi pacientov s TCC. Detekciu buniek u pacientov s TCC sme uskutočnili v separovaných vzorkách krvi pred a po operácii pomocou RT-PCR a imunohistochemickými metódami a výsledky sme porovnávali s histopatologickým vyšetrením vzoriek bioptického materiálu s určením grade a pTNM štádia, ako aj iných charakteristík, vrátane cytologického vyšetrenia moču.

Materiál a metódy

Do štúdie bolo zahrnutých 43 pacientov (33 mužov a 10 žien) TCC o vo veku 37–85 rokov s priemerom 65 ± 12 rokov. Z nich 40 (93 %) malo TCC močového mechúra, 2 (4,6 %) TCC obličkovej panvičky a 1 (2,3 %) TCC močového mechúra, močovodu a obličkovej panvičky. pTNM klasifikácia je uvedená v tab. 1 a spôsob liečby v tab. 2. Pred operáciou a po jej ukončení do jednej hodiny bola odobraná z periférnej žily krv po 10 ml. Okrem toho bol odobratý z TCC bio­ptický materiál na histologické vyšetrenie s určením grade, endolymfatickej, intravaskulárnej a perineurálnej invázie. Pri imunohistochemickej analýze bioptického materiálu sa určovala expresia cytokeratínu 7 (CK 7) metódou OV-TL12/30 Biogenex; cytokeratínu 20 (CK 20) pomocou IT-Ks20.8 Biogenex; Ki-67 pomocou MIB-1 DAKO; MMP-11 (Stromelysin 3) SL3.05 NeoMarkers; p53 pomocou CB 11 Biogenex. V separovaných bunkách z odberu krvi pred a po operácii sa okrem expresie EGFR, UP-II imunohistochemicky vyšetrili HE, PAP, CK 7 opäť pomocou OV-TLT 12/30 a CK 20 testom IT-Ks20.8 Biogenex. 

Imunomagnetická separácia buniek

Päť  ml periférnej krvi bolo použitých na imunomagnetickú separáciu buniek pomocou CELLection™ Epithelial Enrich kit (Invitrogen Dynal AS, Oslo, Norway) podľa návodu od výrobcu. Obohatené vzorky boli použité na detekciu epitelových nádorových buniek a imunocytochemické vyšetrenia. 400 µl bunkovej suspenzie bolo centrifugovaných na sklenených doštičkách pokrytých poly-L-lyzínom počas 3 min pri 1 000 otáčkach za minútu. Po odstránení väčšiny supernatantu boli doštičky znova centrifugované počas 1 min pri 2 500 otáčkach za min. Po vyschnutí pri izbovej teplote, ktoré trvalo 30–60 min, boli doštičky vystavené pôsobeniu konjugovanej protilátky – AE1/AE3. Potom boli nádorové bunky vizualizované v reakcii s alkalickou fosfatázou.

Izolácia RNA

Na genetickú analýzu bolo použitých 2 ml periférnej krvi odobratej pred a do jednej hodiny po operačnom zákroku, imunomagneticky separované bunky a nádorové tkanivo odobraté počas samotného chirurgického zákroku. Krvné vzorky (2 ml), separované bunky (celý výťažok separácie) a nádorové tkanivo (75 mg) boli ihneď použité na izoláciu RNA s pomocou RNAgents^® Total RNA Isolation System (Promega Corp., Madison, WI, USA) podľa návodu od výrobcu.

RT-PCR

Celková RNA (100 ng) izolovaná z krvi zo separovaných buniek a nádorového tkaniva bola reverzne prepísaná do cDNA s pomocou ImProm-II™ Reverse Transcription System (Promega Corp. Madison, WI, USA). RT prebiehala v reakčnom objeme 20 µl s nasledovným zložením: 1x ImProm-II™ Reaction Buffer, 0,5 µg Random Primer, 6 mM MgCl2, 0,5 mM dNTP, 20 U rekombinantného RNasin^® Ribonuclease Inhibitor a 1 µl ImProm-II™ Reverznej Transkriptázy. Na odhalenie prípadnej DNA kontaminácie vzoriek bola pri RT vždy použitá negatívna kontrola bez reverznej transkriptázy.

V získanej cDNA sme kvalitatívne analyzovali expresiu génov pre UP-II a EGFR pomocou metodiky PCR. Expresia prevádzkového génu (houskeeping gene) β-aktínu bola použitá ako interná kontrola úspešnosti prepisu RNA a následnej výťažnosti PCR. PCR prebiehala v reakčnom objeme 50 µl s nasledovným zložením: 1x PCR buffer, 0,2 mM dNTP (Jena Bioscience), 0,1 µM každého priméru a 4 U DyNAzyme II polymerázy (Finnzymes, Espoo, Finland). Na detekciu expresie jednotlivých génov sme použili dvojice primérov, ako boli popísané v práci Gazzaniga et al [6]: (a) β-aktín upstream, 5’-TTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTC-3’ a β-aktín downstream, 5’-GTCGGATTGATGAAACCCAGACACA-3’; (b) EGFR upstream, 5’-CTTCTTGCAGCGATACAGCTC-3’ a EGFR downstream 5’-ATGCTCCAATAAATTCACTGC-3’; (c) UP-II upstream 5’-AACATCTCAAGCCTCTCTGGTCTG-3’ a UP-II downstream 5’-TGTGGACATTGGGATCTCTCTGCTG-3’. Teplotný profil PCR bol: počiatočná denaturácia 95 °C na 2 min nasledovaná 35 cyklami 94 °C na 1,5 min, 62 °C na 30 s a 72 °C na 2 min. Konečná elongácia bola pri 72 °C predĺžená na 4 min. Produkty PCR boli elektroforeticky analyzované na 2 % agarózovom géli. Veľkosti PCR produktov jednotlivých génov boli nasledovné: β-aktín 168 bp, UP-II 322 bp a EGFR 441 bp.

Štatistická analýza

Demografické údaje sú uvádzané v tvare priemer ± smerodajná odchýlka. Na porovnanie výsledkov expresie jednotlivých génov vo vzorkách pred a po operačnom zákroku sme použili párový test podľa Liddella.

Štatistickým programom na vyhodnotenie bol balík Arcus QuickStat Biomedical Version 1.1, build 137 (StatsDirect Ltd., UK). Za signifikantné bolo považované P < 0,05.

Zo 43 pacientov boli 35 pacienti sledovaní v období 2–117 mesiacov s priemerom 30 mesiacov. Ostatní sa nezúčastňovali na kontrolnom vyšetrení na našom pracovisku. Bez recidívy TTC bolo 15 pacientov a recidívu malo 20 pacientov.

Štúdia sa uskutočnila so súhlasom etickej komisie a od každého pacienta bol pred odberom vzoriek, krvi a tkaniva, získaný informovaný súhlas.

Časť biologického materiálu bola znehodnotená transportom, preto bola vyradená z vyšetrenia a z tohto dôvodu sa porovnávali nerovnaké skupiny vzoriek pacientov. Z finančných dôvodov chýbalo použitie pozitívnych a negatívnych kontrol. Metodicky išlo o jednoduché vyhodnotenie daného klinického súboru postupne liečených pacientov s TTC nádormi tak, ako prichádzali na urologickú kliniku.

Výsledky

Expresia β-aktínu bola zistená vo všetkých vyšetrených vzorkách TCC tkaniva s použitím RT-PCR metódy detekcie expresie génov, čo svedčí o 100 % úspešnosti použitej metódy. EGFR a UP-II boli exprimované u 24 z 35 (68,6 %), resp. u 19 z 35 (54,3 %) vzoriek TCC. V našom prípade testy nepreukázali významné zmeny expresie génov pre EGFR a UP-II v periférnej krvi a v imuno-separovaných bunkách pacientov pred a po operačnom zákroku. EGFR nebol exprimovaný v žiadnej vzorke krvi ani u imuno-separovaných buniek. UP-II bol exprimovaný v 1 z 19 (5,3 %) vzoriek imuno-separovaných buniek získaných pred operáciou, ale v žiadnej vzorke zo vzoriek imuno-separovaných buniek získaných po operácii (P < 0,9999). Expresia UP-II bola detegovaná u 2 z 32 (6,3 %) vzoriek krvi odobratých pred operáciou a v 3 z 32 (9,4 %) vzoriek krvi odobratých do jednej hodiny po operačnom zákroku (P < 0,9999) (tab. 3). U 11 zo 43 (25,6 %) pacientov sa pri histopatologickom vyšetrení zistila invázia TCC, z toho: u 1 intravaskulárna, u 6 endolymfatická, u 1 intravaskulárna a endolymfatická a u 3 intravaskulárna, endolymfatická a perineurálna (tab. 4). Vyšetrenie separovanej krvi pred a po operácii farbením HE a PAP a na CK-7, CK-20 bolo takmer vo všetkých vzorkách negatívne (tab. 5). Signifikantný vzťah medzi grade a expresiou p53 v nádorovom tkanive svedčiacom o agresivite a malígnom potenciáli nádoru sa nenašiel (graf 2). Expresia Ki-67 (graf 3) bola u pacientov s G3 (31,15%) signifikantne vyššia ako u pacientov s G1 (7,53 %) (p < 0,01). Tab. 6 dokumentuje vyšetrenie bioptického materiálu pri histopatologickom vyšetrení TCC na CK-7, CK-20 a stromelysin s pozitivitou v 97,7 %, 74,4 % a 97,7 % (graf 1). V tab. 7 je cytologické vyšetrenie moču s pozitívnym alebo suspektným nálezom u 19 z 38 (50 %) pa­cientov, čo koreluje s vyšším grade G3 u 20 zo 43 (46,5 %) pacientov.

Diskusia

Pretože UP, špecifické transmembránové proteíny, sú prítomné len v bunkách urotelu, detekcia génovej expresie UP v krvi pomocou RT-PCR môže predstavovať dôležitú informáciu pre diagnostiku a terapiu TCC [7,8]. Vďaka tomu, že UP sú vysoko konzervované a dobre exprimované v normálnych aj TCC bunkách, sú vhodným kandidátom pre použitie ako diagnostický marker na detekciu CNB u pacientov s TCC [9–11]. Metódu RT-PCR možno využiť k stanoveniu expresie CK-20 v bunkách separovaných z moču pacientov s TTC močového mechúra [12–14], ako aj z tkaniva tumoru, normálneho urotelu, z výplachu mechúra [15,16] či z periférnej krvi, kostnej drene a lymfatických uzlín [17–19]. Podobne ako u našich pacientov, aj iní autori potvrdili, že detekcia EGFR pozitívnych buniek samotných alebo v kombinácii s UP mala nižšiu hodnotu ako pri kombinácii UP Ia/UP II [20]. Detekcia CNB u pacientov s MTS TCC a non MTS TCC pomocou metódy CellSearch Assay bola u 8 zo 14 (57,1 %) pacientov so vzdialenými MTS, ale u žiadneho z pacientov s non MTS TCC [21]. V inej štúdii pacientov s MTS TCC boli CNB detekované u 14 z 33 (44 %, 95 %, CI od 27–59 %). Väčšia záchytnosť CNB bola pozorovaná u pacientov s väčším počtom MTS. Metóda by mohla byť využitá na monitorovanie odpovede na chemoterapiu [22]. Napriek tomu pozitívny výsledok detekcie CNB u pacientov neznamená automaticky prítomnosť vzdialených MTS, avšak prítomnosť týchto buniek v krvnom obehu môže naznačovať buď nekompletnú eradikáciu nádorového tkaniva, alebo možnú existenciu vzdialených MTS aj u pacientov s klinicky nepreukázaným reziduálnym nádorom [23]. Predpokladali sme, že množstvo CNB v periférnej krvi sa zvyšuje u pacientov s pokročilejším pTNM štádiom, najmä pri infiltrujúcich a MTS nádoroch, pri vyššom stupni dediferenciácie nádorových buniek (grade) s pozitívnou cytológiou v moči alebo pri histopatologicky dokázanej endolymfatickej, intravaskulárnej, perineurálnej invázii, či pri dôkaze niektorých antigénov, ktoré svedčia o malignom potenciáli nádoru. Guzzo et al [24] vyšetrili 43 pacientov s TCC močového mechúra pred radikálnou cystektómiou a detegovali CNB v periférnej krvi iba u 9 (21 %) pacientov. Prítomnosť CNB v periférnej krvi spoľahlivo nepredpovedala extravezikálne šírenie nádoru alebo MTS postihnutie lymfatických uzlín (≥ pT3 alebo +LU: p = 0,576) s tým, že senzitivita (27 %), špecificita (88 %) a pozitívna predpovedaná hodnota (78 %) boli nízke. Preto sa CNB nezdali byť klinicky užitočným parametrom pre usmernenie terapeutického rozhodnutia u pacientov s menej pokročilými TTC nádormi močového mechúra ako cT2 (≤ cT2).

Zistenie, že pacient má pozitívny výsledok analýzy CNB v periférnej krvi pred operáciou môže ovplyvniť rozhodnutie, ktoré sa bude týkať samotného operačného výkonu, jeho modality a výberu a niekedy aj indikácie systémovej chemoterapie. V našej klinickej praxi sme sa stretli s prípadmi, keď u pacienta s predoperačne klinicky nepreukázanými MTS sa do šiestich mesiacov objavili vzdialené MTS, pričom rozsiahla operácia nepredĺžila život pacienta. Informácia o prítomnosti či neprítomnosti CNB u pacientov by mohla byť včasným indikátorom systémovej liečby.

V našej štúdii sme mali minimálne 7 pacientov v štádiu pT3-4 a 20 pacientov s grade G3 (tab. 1), s endolymfatickou a intravaskulárnou inváziou (tab. 4) a s dôkazom CK-7, CK-20 a stromelysinu či Ki-67 alebo p53 v nádorovom tkanive, u ktorých sme eventuálnu prítomnosť CNB v periférnej krvi oprávnene predpokladali. U väčšiny pacientov sme urobili TUR (29–67,4 %) tumoru s definitívnym ošetrením a iba u 10 radikálnejší výkon (tab. 2). Analyzovali sme expresiu potenciálnych markerov (UP-II a EGFR) CNB u pacientov s TCC. Skúmali sme, či by chirurgický zákrok so sebou mohol priniesť riziko výsevu nádorových buniek. Preto sme využili analýzu CNB v periférnej krvi pred a po operačnom výkone na zistenie tejto eventuality. V skupine našich pacientov sme však nezistili signifikantné rozdiely v expresii UP-II a EGFR a ani pri ostatných ukazovateľoch pred operáciou a po operácii a ani v imuno-separovaných bunkách, ani v krvných vzorkách. Aj iní autori na menšej skupine vyšetrených pacientov usúdili, že prítomnosť CNB korelovala s pokročilým štádiom ochorenia, ale u žiadneho pacienta, u ktorého nenašli CNB pred operáciou sa CNB neobjavili v priebehu operácie – cystektómie [25]. V našej zostave pacientov s prevažne nižším pTNM štádiom ochorenia sme neboli schopní zachytiť CNB, vrátane pacientov s pT4 a ani chirurgické výkony neviedli k rozsevu nádorových buniek.

Záver

Výsledky našej pilotnej štúdie ukazujú, že u pacientov s nižšou pTNM klasifikáciou bolo praktické použitie monitoringu CNB problematické a využitie detekcie CNB v praxi si vyžaduje ďalšie systematické štúdium v homogénnejšej skupine pacientov.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

The authors declare they have no potential conflicts of interest concerning drugs, products, or services used in the study.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do bi omedicínských časopisů.

The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE “uniform requirements” for biomedical papers.

doc. MUDr. Vincent Nagy, PhD.

Urologická klinika

Univerzita P. J. Šafárika

Lekárska fakulta a Univerzitná nemocnica L. Pasteura

Trieda SNP 1

040 11 Košice

Slovenská republika

e-mail: vincent.nagy@upjs.sk

Obdrženo/Submitted: 7. 7. 2010

Přijato/Accepted: 6. 12. 2010