Aktivita fosfomanomutázy 2 u pacientů s podezřením na dědičnou poruchu glykosylace

Cíl studie:
Cílem studie bylo zavést metodu pro stanovení aktivity fosfomanomutázy 2 (PMM2) a kontrolního enzymu fosfomanoizomerázy (PMI) v izolovaných lymfocytech a kultivovaných kožních fibroblastech a využít ji jako diferenciální diagnostický krok v souboru 18 pacientů s podezřením na CDG syndrom typu I.

Typ studie:
Původní práce.

Název a sídlo pracoviště:
Klinika dětského a dorostového lékařství, 1. lékařská fakulta Univerzity Karlovy a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze.

Materiál a metody:
Analyzovaný soubor představuje 16 vzorků lymfocytů a 8 linií kultivovaných kožních fibroblastů od 18 pacientů z 15 nepříbuzných rodin, u kterých lékaři vyslovili vysoké podezření na CDG syndrom typu I. Kontrolní skupinu tvořilo 59 vzorků lymfocytů a 29 linií fibroblastů od pacientů, u kterých nebylo prokázáno podezření na metabolickou poruchu. Aktivity PMM2 a PMI byly měřeny spektrofotometricky při 37 °C jako redukce NADP⁺ na NADPH při 340 nm.

Výsledky:
U PMM2 a PMI nebyly v lymfocytech ani kultivovaných fibroblastech nalezeny statisticky významné rozdíly aktivit v závislosti na věku či pohlaví. Aktivita PMM2 v lymfocytech u kontrolního souboru byla 0,34–2,58 nmol/min/mg (2,5% až 97,5% percentil) a ve fibroblastech 0,44–9,0 nmol/min/mg. Aktivita PMM2 v lymfocytech byla v souboru pacientů nízká (0,02–0,18 nmol/min/mg, mezikvartilové rozpětí, kontroly 0,73-1,42, p<0,001). Aktivita PMM2 ve fibroblastech od pacientů byla také nízká (0,2–0,66 nmol/min/mg; kontroly 1,06–3,17, p<0,001). Poměr PMM2/PMI byl u pacientů významně snížený v obou tkáních (p<0,001). U všech 18 pacientů byla diagnóza PMM2-CDG potvrzena i nálezem mutací v PMM2 genu.

Závěr:
Měření aktivity PMM2 v lymfocytech nebo kultivovaných fibroblastech umožňuje rychlé stanovení diagnózy PMM2-CDG, nejčastější dědičné poruchy glykosylace typu I.

Klíčová slova:
dědičné poruchy glykosylace (CDG), fosfomanomutáza (PMM2), fosfomanoizomeráza (PMI).

Úvod

Glykosylace je nejrozšířenější posttranslační modifikace proteinů a zahrnuje kovalentní vazbu cukerných řetězců na amidovou skupinu asparaginu (N-glykoprotein) nebo na hydroxylovou skupinu serinu nebo threoninu peptidového řetězce (O-glykoprotein) [1]. Narušení glykosylačních procesů vede ke skupině závažných onemocnění, které se souhrnně označují jako CDG syndrom (Congenital Disorders of Glycosylation, CDG, dědičné poruchy glykosylace proteinů). Na molekulární úrovni již bylo identifikováno >100 různých CDG, více než polovina z nich se týká poruch glykosylace N-glykoproteinů [2].

Biochemický screening je založen na analýze profilu sialovaných forem transferinu v séru pomocí izoelektrické fokusace (IEF), která umožňuje zachytit pacienty s některými typy poruch na úrovni syntézy (CDG typu I) nebo úpravy N-glykoproteinů (CDG typu II) [3]. Vzhledem k všudypřítomnému výskytu N-glykoproteinů v organismu, vedou poruchy na úrovni jejich biosyntézy k širokému spektru závažných klinických příznaků. Nejčastějším typem CDG syndromu je PMM2-CDG (podle starší nomenklatury CDG Ia) s autosomálně recesivním typem dědičnosti, který tvoří 80 % případů v této skupině onemocnění. V literatuře již bylo popsáno >800 pacientů a výskyt v populaci se odhaduje na cca 1: 20 000 [4].

Fosfomanomutáza (PMM2) je cytosolární enzym, který katalyzuje reverzibilní přeměnu manózy-6-fosfátu na manózu-1-fosfát (Man-1-P). Snížení enzymové aktivity vede k depleci v zásobách GDP-manózy a dolichol-P-manózy, a tím k hypoglykosylaci řady N-vázaných glykoproteinů. Porucha PMM2 vede k onemocnění, které se nazývá PMM2-CDG. Je způsobena přítomností mutací v PMM2 genu lokalizovaném v oblasti 16p13.3.-p13.2, má 8 exonů a bylo v něm již nalezeno >110 patogenních mutací [5].

Klinicky se PMM2-CDG manifestuje již v kojeneckém věku jako multisystémové onemocnění s heterogenními klinickými příznaky. Mezi univerzální klinické a laboratorní nálezy patří neprospívání, atypické rozložení podkožního tuku v gluteální oblasti, invertované mammily, kraniofaciální dysmorfie, strabismus, hypotonický syndrom, porucha až zástava psychomotorického vývoje, hypoplázie mozečku, hepatopatie a smíšená koagulopatie [6,7]. Prognóza není příznivá, mortalita dětí s nízkou reziduální aktivitou PMM2 dosahuje až 20 % [8]. Esenciální úlohu PMM2 pro vývoj organismu podporuje i zjištění, že inaktivace genu PMM2 u myší je embryonálně letální [9]. Léčba pacientů s PMM2-CDG není známá a ani experimentální terapie pomocí Man-1-P nebyla terapeuticky úspěšná [10].

Dosud bylo stanovení aktivity PMM2 dostupné pouze v několika specializovaných centrech ve světě zaměřených na diagnostiku poruch glykosylace, kde u pacientů s podezřením na CDG typu I je v prvním kroku obecně uznávaným a doporučovaným diagnostickým standardem měření aktivity PMM2 v izolovaných lymfocytech nebo kultivovaných kožních fibroblastech, a to z důvodu, že tento typ CDG je nejčastější.

Cílem studie byla snaha zavést metodu pro stanovení aktivity fosfomanomutázy (PMM2) a kontrolního enzymu fosfomanoizomerázy (PMI) v izolovaných lymfocytech a kultivovaných fibroblastech a využít ji jako diferenciálně-diagnostický krok v našem souboru 18 pacientů s podezřením na CDG syndrom typu I.

Materiál

Analyzovaný soubor reprezentovalo 16 vzorků izolovaných lymfocytů a 8 linií kultivovaných kožních fibroblastů od 18 pacientů (0,5-18 let), u kterých bylo na základě klinických příznaků vysloveno podezření na CDG syndrom typu I. U všech pacientů byl pomocí IEF sérového transferinu nalezen patologický profil CDG typu I (Obr 1.). Zároveň bylo analyzováno i 9 vzorků lymfocytů od rodičů vyšetřovaných probandů (obligatorních heterozygotů) ve věku 22-41 let. Kontrolní skupinu tvořilo 59 vzorků lymfocytů a 29 linií kultivovaných fibroblastů od osob ve věku 0,5-48 let, resp. 0,5-18 let bez klinických projevů CDG syndromu.

Chemikálie

Histopaque^®1077, Hepes, DTT, KCl, leupeptin a pepstatin, fosfomanoizomeráza, MgCl₂, manóza-1-P, manóza-6-P (Sigma), glukóza-6-P-dehydrogenáza, fosfoglukózaizomeráza, NADP (dvojsodná sůl) (Roche), manóza-1,6-di-P byla připravena podle Van Schaftingen [11].

Metody

Lymfocyty byly izolovány ze 7 ml periferní krve s přídavkem EDTA gradientovou centrifugací (Histopaque^®1077, Sigma). Kožní fibroblasty byly kultivovány v D-MEM mediu s 10% obsahem fetálního bovinního séra v 5% CO₂. Fibroblasty v množství 2x 75 cm² o konfluenci 80 % byly sklizeny trypsinizací. Peleta obou typů buněk byla zamražena a uchovávána při -80 °C.

Příprava vzorku

Peleta lymfocytů nebo fibroblastů byla rozmražena a homogenizována při 4 °C v 300 µl homogenizačního pufru (20 mmol/l Hepes pH 7,1, 1 mmol/l DTT, 25 mmol/l KCl, leupeptin a pepstatin 10 mg/l) v homogenizátoru sklo-sklo. Poté byl homogenát sonikován (3x8 s, amplituda 20, při 4 °C) a směs byla centrifugována při 1550 g, 8 min, při 4 °C. Supernatant byl uschován při -80 °C přes noc. Druhý den byla rozmražená suspenze centrifugována při 9000 g, 5 min, 4 °C a výsledný supernatant byl použit pro stanovení aktivity enzymu. Na jedno měření bylo používáno 50 µl supernatantu (koncentrace proteinu se pohybovala okolo 3-5 g/l).

Enzymové aktivity

Aktivita PMM2 a PMI byla měřena spektrofotometricky jako přeměna NADP⁺ na NADPH při 340 nm po dobu 5 min při 37 °C v kyvetách o optické dráze 1 cm v celkovém objemu 0,5 ml. Každé měření bylo provedeno 2x. Aktivita byla vyjádřena jako nmol/min/mg proteinu s použitím molárního extinkčního koeficientu ε₃₄₀=6,22 (l/mmol/cm). Měření bylo provedeno podle Van Schaftingen (11) s mírnými úpravami uvedenými níže.

Reakční směs pro spektrofotometrické stanovení PMM2 obsahovala: 50 mmol/l Hepes pH 7,1, fosfoglukózaizomeráza (10 g/l), fosfomanoizomeráza (3,5 g/l), glukóza-6-P-dehydrogenáza (10 g/l), 1 mmol/l manóza-1,6-di-P, 0,25 mmol/l NADP, 50 mmol/l MgCl₂, 3 mmol/l manóza-1-P. Reakce byla startována přídavkem 50 µl vzorku. Referenční kyveta neobsahovala manózu-1-P.

Reakční směs pro spektrofotometrické stanovení aktivity PMI obsahovala: 50 mmol/l Hepes pH 7,1, fosfoglukózaizomeráza (10 g/l), glukóza-6-P-dehydrogenáza 4 g/l, 15 mmol/l NADP, 50 mmol/l MgCl₂, 5 mmol/l manóza-6-P, reakce byla startována přídavkem 50 µl vzorku. Referenční kyveta neobsahovala substrát - manózu-6-P. Aktivita PMI sloužila jako kontrolní enzym k vypočítání poměru PMM2/PMI.

Koncentrace proteinu ve vzorku byla stanovena dle Lowryho [12].

Molekulárně-genetická analýza

Celková DNA byla izolována metodou fenolové extrakce. Všechny exony genu PMM2 (ENSG00000140650, ENST00000268261) a jejich přilehlé intronové oblasti byly analyzovány metodou přímého sekvenování na genetickém analyzátoru ABI 3500xL (Applied Biosystems). Mutace zjištěné u probanda byly vždy potvrzeny i u obou rodičů analýzou jejich DNA.

Statistická analýza

Vzhledem k tomu, že pozorovaná data nemají normální rozdělení, byly použity neparametrické statistické metody. Rozdíly mezi pacienty a kontrolami (resp. mezi heterozygoty a kontrolami) byly testovány Wilcoxonovým dvouvýběrovým testem. Za statisticky významné byly považovány dosažené hladiny testů nižší než 5 %. Analýzy byly provedeny ve statistickém software R verze 3.1.2, R Core Team (2014).

Etika

Všechny odběry a biochemické i molekulární analýzy byly prováděny po informovaném souhlasu rodičů. Studie byla provedena v souladu s Helsinskou deklarací Světové lékařské asociace a byla schválena etickou komisí Všeobecné fakultní nemocnice v Praze.

Výsledky

U PMM2 a PMI nebyly v lymfocytech a v kultivovaných fibroblastech nalezeny statisticky významné rozdíly v aktivitách v závislosti na věku či pohlaví. Rozmezí kontrolních hodnot (2,5 % až 97,5 % kvantil) pro PMM2 v lymfocytech a fibroblastech uvádí obr. 2 a 3. Aktivity kontrolního enzymu PMI v lymfocytech a fibroblastech jsou uvedeny na obr. 4.

Průměrná aktivita PMM2 a poměr PMM2/PMI v lymfocytech a fibroblastech pacientů byly významně snížené (p<0,001) ve srovnání s kontrolním souborem (obr. 2, 3). Medián pro aktivitu PMM2 v lymfocytech vyšetřovaných pacientů odpovídal 6 % mediánu kontrol (p<0,001) (obr. 2, 3). Významně snížená aktivita PMM2 v lymfocytech pod 10 % mediánu kontrolní skupiny byla nalezena u 10 pacientů, středně snížená aktivita mezi 10-30 % u tří pacientů a u tří pacientů byla aktivita PMM2 do hodnoty 71 % mediánu kontrol (Tabulka 1). Nebyl nalezen významný rozdíl mezi skupinou heterozygotů a kontrolním souborem. Medián pro aktivitu PMM2 ve fibroblastech odpovídal 30 % mediánu kontrol (p<0,001). Významně snížená aktivita PMM2 pod 10 % mediánu kontrolní skupiny byla ve fibroblastech nalezena u tří pacientů, středně snížená mezi 10-30 % u jednoho pacienta a u tří byla aktivita PMM2 do hodnoty 69  % mediánu kontrol (Tabulka 1).

Aktivita kontrolního enzymu PMI byla v lymfocytech pacientů vyšší než u kontrolního souboru, zatímco ve fibroblastech nebyly rozdíly statisticky významné (obr. 4).

Posléze byla u všech 18 pacientů diagnóza PMM2-CDG potvrzena i na molekulárně genetické úrovni. Nalezené mutace v PMM2 jsou uvedeny v Tabulce 1. Všichni pacienti jsou složení heterozygoti, přičemž nejčastějšími mutacemi jsou mutace c.422G>A a c.338C>T, které vedou k záměně aminokyseliny R141H a P113L, respektive.

Diskuse

V naší studii jsme v souboru 18 pacientů s klinickým podezřením na CDG syndrom analyzovali aktivitu PMM2, jejíž porucha podporuje diagnózu PMM2-CDG, nejčastějšího typu CDG syndromu. Ačkoliv až u 18 % publikovaných pacientů s PMM2-CDG byla v izolovaných lymfocytech a/nebo kultivovaných fibroblastech nalezena normální aktivita PMM2 [13,14], u většiny našich pacientů jsme prokázali významně sníženou aktivitu PMM2 pod 10 % kontrolních hodnot nebo alespoň středně sníženou aktivitu PMM2 na úroveň 10 až 30 % kontrolních hodnot. Pouze u jednoho pacienta z našeho souboru (P13) dosahovala aktivita PMM2 v lymfocytech 71 % mediánu kontrolních hodnot. Diagnózu PMM2-CDG u pacienta 13 potvrdilo molekulární vyšetření PMM2 genu, které ukázalo přítomnost dvou mutací c.[24delC]+[338C>T]. Delece nukleotidu na jedné alele vede ke vzniku předčasného stop-kodónu, zatímco „missence“ mutace na druhé alele vede k záměně prolinu za lysin na pozici 113, která sice ovlivňuje stabilitu diméru nativního proteinu, ale přímo nezasahuje do aktivního místa PMM2, takže patří mezi mutace s mírnějším dopadem na funkci enzymu [15]. Ve prospěch enzymatické diagnostiky u pacienta 13 svědčí i snížený poměr mezi PMM2 a kontrolním enzymem PMI.

Ve fibroblastech jsme závažné snížení aktivity PMM2 pod 10 % zaznamenali pouze u tří z osmi námi testovaných pacientů. Také literární údaje uvádějí poměrně vysokou residuální aktivitu PMM2 ve fibroblastech pacientů, což při enzymatickém vyšetření zvyšuje riziko falešně negativního výsledku [16].

Nesoulad mezi residuální aktivitou PMM2 v lymfocytech a fibroblastech ukazuje na tkáňově specifické rozdíly. Studie na mutantních proteinech prokázaly narušenou kinetiku enzymu a sníženou stabilitu mutantního proteinu ve srovnání s kontrolním vzorkem [17]. Residuální aktivita je vyšší ve fibroblastech také díky tomu, že fibroblast je rychle se dělící buňka s aktivní proteosyntézou ve srovnání s lymfocyty. Navíc tento fakt může být doprovázen i možností selektivní výhody podmínek kultivace u fibroblastů [16].

V souladu s literárními údaji jsme u našich pacientů s PMM2-CDG nezjistili významnější korelaci mezi jejich fenotypem, genotypem a residuální aktivitou PMM2 v obou tkáních. Většina pacientů s PMM2-CDG jsou složení heterozygoti, přičemž nejfrekventovanější mutace R141H, která se vyskytuje cca u 40 % pacientů, ovlivňuje vazbu Man-1-P do aktivního místa enzymu. Její dopad na aktivitu PMM2 je natolik zásadní, že dosud nebyla nalezena v homozygotní formě [15]. Deset z 16 pacientů našeho souboru má mutaci P113L, která ovlivňuje stabilitu diméru nativního enzymu a patří k mutacím s mírnějším dopadem [15].

Vzhledem k tomu, že je již známo vice než 50 různých dědičných poruch glykosylace na úrovni syntézy N-glykoproteinů a že již byli popsáni i PMM2-CDG pacienti s normálním profilem transferinu při IEF [18], je stanovení aktivity PMM2 v izolovaných lymfocytech nebo kultivovaných fibroblastech i přes řadu svých omezení významným přínosem při diferenciální diagnostice poruch glykosylace.

Závěr

Byla zavedena metoda měření aktivity PMM2 v izolovaných lymfocytech a kultivovaných fibroblastech a bylo stanoveno rozmezí hodnot u kontrol pro tyto dva typy tkání. Metoda je úspěšně využívána v diferenciální diagnostice při podezření na PMM2-CDG.

Zkratky

PMM2 fosfomanomutáza

PMI fosfomanoizomeráza

IEF izoelektrická fokusace

Man-1-P manóza-1-fosfát

Práce byla podporována IGA MZ NT12166-5/2011.

Do redakce došlo 25. 1. 2016

Adresa pro korespondenci:

RNDr. Hana Hansíková, CSc.

1. LF UK a VFN v Praze

Laboratoř pro studium mitochondriálních poruch

Klinika dětského a dorostového lékařství

Ke Karlovu 2

128 08 Praha 2

email: hana.hansikova@lf1.cuni.cz