Stanovení železa a mědi v jaterní bioptické tkáni pacientů s různou jaterní patologií: diagnostický význam a vztah k sérovým parametrům železa a mědi.

Overview

Cílem naší práce bylo vyhodnotit výsledky kvantitativního stanovení obsahu železa a mědi metodou AAS ve vzorcích jaterní tkáně získaných perkutánní jaterní biopsií v rámci diferenciální diagnostiky nejasných klinických a laboratorních případů hepatopatie, případně pro potvrzení diagnózy hemochromatózy a Wilsonovy choroby.

Pacienti:
Soubor 83 pacientů byl podle histologického nálezu rozdělen do čtyř skupin. Skupina I (normální histologický obraz; n=31), skupina II (chronická hepatitida; n=33), skupina III (cirhóza; n=9), skupina IV (hemochromatóza; n=10) a tři případy Wilsonovy choroby.

Výsledky:
Podle očekávání jsme zjistili ve skupině IV (hemochromatóza) signifikantně zvýšený obsah železa v jaterní tkáni (3,73 ± 1,93 mg/g) a koncentraci feritinu v séru (966 ± 560 µg/l); (p < 0,001) spolu se zvýšenou hodnotou saturace transferinu (0,66 ±0,20); (p < 0,05) proti skupině I. Zjistili jsme statisticky významnou korelaci (Pearson) mezi obsahem železa v jaterní tkáni a sérovou koncentrací feritinu (r = 0,6573; p < 0,001) a saturací transferinu (r = 0,6878; p < 0,001).

Obsah mědi v játrech se ve skupině I, II a IV signifikantně nelišil. Signifikantně zvýšenou hodnotu jaterní mědi stejně jako mědi v séru (p < 0,001) jsme zjistili ve skupině pacientů s jaterní cirhózou (skupina III). U tří případů Wilsonovy choroby jsme zjistili typické hodnoty všech sledovaných parametrů. V souvislosti s nálezem zvýšeného obsahu mědi ve skupině III (cirhóza) jsme zaznamenali také signifikantně zvýšenou aktivitu ALP (p < 0,05).

Závěr:
Ze sérových parametrů metabolismu železa, které vykazují korelaci s jeho obsahem v játrech, má největší použitelnost feritin a saturace transferinu. Indikaci stanovení obsahu mědi v jaterní tkáni tvoří jednoznačně diagnostika Wilsonovy choroby. Tento postup není nahraditelný histochemickým průkazem mědi v bioptickém vzorku jaterní tkáně. Hodnoty kolem 250 µg/g suché jaterní tkáně je však třeba hodnotit opatrně a myslet i na možné jiné příčiny.

Klíčová slova:
železo, měď, jaterní biopsie, feritin, saturace transferinu.

Úvod

Železo a měď patří mezi životně důležité esenciální stopové prvky, které plní nesčetné funkce na orgánové, tkáňové, buněčné a molekulární úrovni v organismu. V klinické praxi se setkáváme jak s projevy jejich deficitu, tak i s toxickým působením při jejich nadbytku. Mechanismus toxicity nadbytku železa a mědi při vzniku orgánové dysfunkce spočívá v účinku nadprodukce reaktivních kyslíkových radikálů [1-3].

Kvantitativní stanovení obsahu mědi v sušině jaterní tkáně patří do souboru diagnostických laboratorních markerů Wilsonovy choroby, vedle sérové mědi, ceruloplasminu, vylučování mědi močí a průkazu přítomnosti mutace genu ATP7B na 13. chromozomu [4-9].

Stavy spojené s akumulací železa v jaterní tkáni z různých příčin jsou indikací rovněž k jeho kvantitativnímu stanovení vzhledem ke známému vztahu jeho zvýšeného obsahu k procesu fibrotizace jaterního parenchymu, který často přechází do stadia cirhotické přestavby [10-13].

Jedná se především o různé typy hemochromatózy, ale i o stavy spojené s kumulací železa v organismu z jiných příčin. Mezi nimi dominují hematologické stavy inefektivní hematopoézy a zvláště nutné opakované transfuze krve při onemocnění talasémie major. Přínos stanovení je nejenom diagnostický, ale i prognostický pro odhad rizika vzniku rozvoje jaterní cirhózy [14-16].

I když je většinou považováno kvantitativní stanovení mědi a železa v sušině bioptické jaterní tkáně za „zlatý standard“, jsou zmiňovány i slabiny (invazivnost, bolest, možnost krvácení, reprodukovatelnost hodnot odebraných z různých míst atd.). V této souvislosti jsou zkoumány další méně invazivní diagnostické postupy, jako např. sérové hodnoty parametrů metabolismu mědi a železa nebo kvantifikace obsahu železa v různých orgánech pomocí speciální magnetické rezonance [17-20].

V naší práci uvádíme výsledky rutinního stanovení obsahu mědi a železa ve vzorcích bioptické jaterní tkáně odebrané v rámci diagnostiky nejasných klinických a laboratorních případů hepatopatie, případně pro potvrzení diagnózy v rámci diferenciálně diagnostického procesu.

Vedle histologické klasifikace jsou k dispozici rovněž sérové hodnoty mědi, ceruloplasminu, železa, feritinu a saturace transferinu.

Pacienti, materiál a metody

V předložené práci jsou zpracovány biologické vzorky (bioptická jaterní tkáň a krevní sérum) 38 mužů ve věku 20-60 let a 45 žen ve věku 21-65 let, u kterých byla v letech 2012-2013 provedena diagnostická necílená perkutánní jaterní biopsie s následnou histologickou klasifikací a kvantitativním stanovením obsahu železa a mědi v sušině jaterní tkáně.

Podle histologického nálezu soubor tvořilo 27 pa-cientů (normální histologický obraz; skupina I), 33 pa-cientů (chronická hepatitida; skupina II), 10 pacientů (cirhóza; skupina III); na základě ostatních klinických, laboratorních a genetických vyšetření byla u 10 případů diagnostikována hemochromatóza; skupina IV a u tří případů Wilsonova choroba.

Perkutánní necílená jaterní biopsie pro histologické vyšetření byla provedena standardně setem Hepafix (17G/1,4 mm), B. Braun Germany po znecitlivění kůže v pátém mezižebří. Přibližně 0,5-1,0 cm získaného vzorku jaterní tkáně byl přenesen do předem zvážené skleněné zkumavky připravené pro stopovou analýzu prvků.

Zkumavka s bioptickým vzorkem k vysušení byla zahřáta na 110 °C po dobu 2 hodin a bezprostředně po vychladnutí opět zvážena. Hmotnost vysušeného bioptického vzorku se pohybovala mezi 1,0-3,0 mg. Vzorky s hmotností menší než 1,0 mg nebyly na obsah železa a mědi analyzovány.

K vysušenému vzorku jaterní tkáně bylo přidáno 0,5 ml koncentrované kyseliny dusičné. Mineralizace probíhala 12 hodin při teplotě 60 °C v temperovaném kovovém bloku.

Čirý mineralizát byl před analýzou naředěn 10x pro železo a 3x pro měď ultračistou vodou.

K analýze stopových prvků byla použita metoda atomové absorpční spektrometrie s elektrotermickou atomizací v grafitové kyvetě se Zeemanovou korekcí pozadí (Cu) a s použitím plamenové techniky acetylén/vzduch (Fe) na přístroji AAS SOLAAR, Thermo Elemental. S použitím stejného přístroje byla stanovena koncentrace mědi v séru (AAS; grafitová kyveta).

Správnost stanovení železa a mědi v mineralizovaném bioptickém jaterním vzorku byla ověřena certifikovaným kontrolním materiálem bovinních jater (Standard Reference Material SRM 1577b; bovine liver; National Institute of Standards&Technology).

Pro cílové hodnoty při stanovení mědi 160 µg/g a železa 184 µg/l bylo recovery 98 % a 103 %.

Ceruloplasmin v séru byl stanoven imunonefelometricky na přístroji Immage Beckmann za použití originálního setu Beckman.

Prováděné kontrolní analýzy splňovaly u všech stanovovaných parametrů kriteria interní i externí kontroly kvality platné pro Oddělení klinické biochemie FN Brno, akreditované podle normy ISO 15189; 2013 Českým institutem pro akreditaci.

Studie byla projednána a schválena etickou komisí FN Brno.

Statistické metody

Ke zjištění normality rozložení naměřených hodnot byl použit Kolmogorov-Smirnovův test.

Pro zjištění statistické významnosti (p<0,05) rozdílu průměrů naměřených hodnot v jednotlivých skupinách byl použit Studentův t test.

Korelace hodnot měřených parametrů byla testována pomocí Pearsonovy korelační analýzy.

Statistické testy byly provedeny pomocí statistického softwaru MedCalc verze 12.2.00.

Výsledky

Zjištěné hodnoty obsahu železa a mědi v sušině bioptické jaterní tkáně včetně souvisejících sérových parametrů pacientů skupiny I – IV a tří případů Wilsonovy choroby jsou uvedeny v Tabulce 1.

Podle očekávání jsme zjistili ve skupině IV (hemochromatóza) signifikantně zvýšený obsah železa v jaterní tkáni a koncentraci feritinu v séru (p<0,001) spolu se zvýšenou hodnotou saturace transferinu (p<0,05). Koncentrace sérového železa byla u pacientů s hemochromatózou zvýšená pouze nesignifikantně.

Zjistili jsme statisticky významnou korelaci (Pearson) mezi obsahem železa v játerní tkáni a sérovou koncentrací feritinu (r=0,6573; p<0,001) a saturací transferinu (r=0,6878; p<0,001).

Obsah mědi v játrech se ve skupině I, II a IV signifikantně nelišil. Signifikantně zvýšenou hodnotu jaterní mědi, stejně jako mědi v séru (p<0,001), jsme zjistili ve skupině pacientů s jaterní cirhózou (skupina III). Koncentrace ceruloplasminu byla v této skupině zvýšená pouze nesignifikantně.

U tří případů Wilsonovy choroby jsme zjistili typické hodnoty všech sledovaných parametrů. Obsah železa v jaterní tkáni se nelišil od hodnot zjištěných ve skupině I-III. Ostatní hodnoty, související s metabolismem železa, jsme u těchto pacientů neměli k dispozici.

V souvislosti s nálezem zvýšeného obsahu mědi ve skupině III (cirhóza) jsme zaznamenali také signifikantně zvýšenou aktivitu ALP (p<0,05). Nález by mohl dokreslovat proces akumulace mědi v jaterní tkáni pacientů s cirhózou při možné cholestáze.

Diskuse

Histologické vyšetření bioptického vzorku jaterní tkáně získané necílenou jaterní biopsií může přinést cenné informace v diferenciální diagnostice jaterních chorob, zvláště v posouzení přítomnosti a stupně chronické zánětlivé reakce a fibrotického procesu.

Histochemické Pearlsovo barvení na železo poskytuje solidní semikvantitativní informaci o obsahu železa v jaterní tkáni, navíc se schopností určení jeho predilekční lokalizace v hepatocytech, což je typické pro hemochromatózu nebo v Kupferových buňkách např. po opakovaných krevních transfuzích. Mnohem méně spolehlivý je histochemický průkaz mědi v jaterní tkáni [21].

Pro diagnostické a prognosticky cenné kvantitativní stanovení obsahu železa v jaterní tkáni při hemochromatóze a jiných stavech spojených s ukládáním železa v játrech a pro diagnostiku Wilsonovy choroby je vhodné „obětovat“ část získaného bioptického vzorku pro kvantitativní stopovou analýzu těchto prvků [22]. Metoda AAS je použitelná a dostatečně citlivá pro stanovení obsahu železa a mědi, je-li k dispozici alespoň 1 mg vysušené jaterní tkáně.

V literatuře se uvádí, že hodnoty železa v jaterní tkáni přesahující 7 mg/g suché tkáně při hemochromatóze nebo talasémii s opakovanými krevními transfuzemi, jsou spojeny s vysokým rizikem rozvoje fibrotického procesu a vznikem jaterní cirhózy [23].

U žádného našeho pacienta s hemochromatózou a obsahem železa v játrech v rozsahu 2,2-6,3 mg/g suché tkáně nebyly zjištěny známky fibrotické přestavby jaterního parenchymu.

Přestože se při nadbytku železa v organismu jeho největší část ukládá v játrech, existují kritické názory v literatuře o spolehlivosti výpovědi kvantitativního stanovení jeho obsahu v játrech vzhledem k ostatním orgánům např. myokardu, pankreatu apod. Tyto studie vycházejí z použití speciální metody magnetické rezonance, která v mnohých publikacích dokládá použitelné, reprodukovatelné stanovení obsahu železa v různých orgánech těla, které někdy není v plném souladu s hodnotami přímého stanovení železa v bioptickém vzorku [24].

Znalost slabin a možných komplikací relativně invazivní metody perkutánní jaterní biopsie akcentuje snahu o posouzení přínosu a možného klinického využití sérových hodnot parametrů metabolismu železa k odhadu jeho obsahu v játrech [25].

Ze sérových parametrů dominuje feritin, saturace transferinu a v poslední době také tzv. volné, na transferin nevázané, železo (non-transferin-bound iron) [26].

Stanovení feritinu v souvislosti s diagnostikou a monitorováním různých patologických stavů spojených s kumulací železa v organismu, respektive v játrech, je v odborné literatuře věnována značná pozornost. Při jeho interpretaci je však třeba počítat s možností jeho zvýšení nejen v souvislosti s nadbytkem železa v organismu, ale i při chronickém alkoholismu, zánětech, infekcích, malignitě apod. Přesto je považován, zvláště při opakovaném stanovení v čase, za užitečný parametr ukazující na zásoby železa v organismu, diagnostiku a monitorování úspěšnosti léčby různých chorobných stavů spojených se střádáním železa v těle [15-19, 24].

Stanovení obsahu mědi v bioptickém vzorku jaterní tkáně zásadním způsobem doplňuje charakteristický pokles koncentrace ceruloplasminu a zvýšení exkrece mědi močí v kontextu rodinné a osobní anamnézy a ostatních diagnostických projevů různých forem Wilsonovy choroby. I když se hodnoty obsahu mědi v játrech u Wilsonovy choroby pohybují ve stovkách mikrogramů a více, u našich tří pacientů v rozmezí 440-1440 µg/g suché tkáně, může být užívaná cut-off hodnota pro Wilsonovu chorobu >250 µg/g suché tkáně zjištěna i u jiných jaterních patologií spojených s cholestázou [19].

Závěry

Správně indikovaná a lege artis provedená perkutánní jaterní biopsie skýtá možnost kvantitativního stanovení obsahu železa a mědi v jaterní tkáni. Metoda atomové absorpční spektrometrie přináší při zachování všech kautel nutných pro zabezpečení kvality stopové analýzy validní výsledky. Pro spolehlivou analýzu je potřeba minimálně 1 mg suché jaterní tkáně. Histochemické Pearlsovo barvení na železo je pouze semikvantitativní metodou, poskytuje však také informaci o lokalizaci železa v jaterní tkáni (hepatocyty, Kupferovy bb).

Stanovení obsahu železa má diagnostický a prognostický význam zvláště u hemochromatózy a ostatních chorobných stavů spojených s ukládáním železa v játrech (talasémie major, neefektivní hematopoéza, hemolytické stavy, potřeba opakovaných transfuzí krve). Prognóza spočívá v odhadu rizika rozvoje fibrotického procesu při vysokém obsahu železa.

Ze sérových parametrů metabolismu železa, které vykazují korelaci s jeho obsahem v játrech, má největší použitelnost feritin a saturace transferinu.

Indikaci stanovení obsahu mědi v jaterní tkáni tvoří jednoznačně diagnostika Wilsonovy choroby. Tento postup není nahraditelný histochemickým průkazem mědi v bioptickém vzorku jaterní tkáně. Hodnoty kolem 250 µg/g suché jaterní tkáně je však třeba hodnotit opatrně a myslet i na možné jiné příčiny.

Do redakce došlo 13. 6. 2014

Adresa pro korespondenci:

Doc. MUDr. Milan Dastych, CSc., MBA

Odd. klinické biochemie

Fakultní nemocnice Brno

Jihlavská 20

625 00 Brno

e-mail: mdast@fnbrno.cz