Vliv hemolýzy na stanovení celkového a přímého bilirubinu

Cíl studie:
Cílem studie bylo vlastním experimentem ověřit vliv různého stupně hemolýzy (indexu H) na stanovení koncentrace celkového a přímého bilirubinu a určit mezní úroveň hemolýzy, do které lze výsledek koncentrace bilirubinu vydat pouze s doplňujícím komentářem.

Materiál a metody:
K pacientským vzorkům sér s nízkou primární hemolýzou a rutinně stanovenou koncentrací bilirubinu celkového a přímého v rozsahu nízkých až vysoce patologických hodnot jsme přidali hemolyzát a vytvořili různé stupně hemolýzy. Následně jsme opakovaným měřením zjistili odchylku od původních hodnot koncentrace bilirubinu a výsledky statisticky (metodou nejmenších čtverců a metodou kontrastu v analýze rozptylu) zpracovali.

Výsledky:
Zjistili jsme negativní bias u celkového i přímého bilirubinu v závislosti na stoupajícím stupni hemolýzy. Ve vzorcích s vysokou hemolýzou se ale také projevil vzestup primární koncentrace bilirubinu, pravděpodobně způsobený zvýšením absorbance vlastního hemoglobinu, tedy přímou fotometrickou interferencí. Tento vzestup byl markantní především u přímého bilirubinu, ve vzorcích s nízkou primární koncentrací přímého bilirubinu. Odvodili jsme mezní stupeň hemolýzy pro stanovení jak celkového (H index 95), tak přímého bilirubinu (H index 53) metodou užívanou v naší laboratoři.

Závěr:
Experimentem vycházejícím z rutinní laboratorní praxe jsme ověřili vliv hemolýzy na koncentraci celkového a přímého bilirubinu a určili mezní stupeň hemolýzy, od kterého nelze výsledek koncentrace bilirubinu vydat.

Klíčová slova:
bilirubin, hemolýza, sérové indexy.

Úvod

Hemolýza je definována jako rozpad erytrocytů provázený uvolněním hemoglobinu a dalších intracelulárních látek do extracelulárního prostoru v krvi. Může vznikat přímo v organismu = in vivo (např. hemolytická anémie), nebo častěji, mimo organismus = in vitro (v průběhu všech částí preanalytické fáze, tzn. při odběru vzorku, transportu nebo skladování). Hemolýza různými mechanismy interferuje se stanovením některých analytů: vylití intracelulárních analytů do séra/plazmy a vzrůst jejich koncentrace (K, LD, AST, Mg a další); interference červeného zabarvení volného hemoglobinu při fotometrických analýzách zvýšením absorbance v oblasti vlnových délek viditelného spektra 300 - 500 nm, charakteristicky při 415 nm; působení hemoglobinu jako pufru, tj. změna pH činidla a ovlivnění průběhu reakce (ALP, albumin); dále může hemoglobin reagovat s některým činidlem, rozkládat ho, a tím snižovat výsledek měření (reakce s NO₂ u stanovení bilirubinu). Mechanismy výsledného ovlivnění výsledku se kombinují a závisí na stupni hemolýzy a koncentraci bilirubinu ve vzorku [1-8].

Měření koncentrace bilirubinu celkového a přímého patří k nejčastěji požadovaným rutinním biochemickým analýzám. Vzhledem k principu stanovení azokopulační diazoreakcí s následným fotometrickým měřením intenzity vzniklého zabarvení [7] může být výsledek výrazně ovlivněn hemolýzou předloženého vzorku krve. Od určitého stupně hemolýzy je vhodné výsledek měření koncentrace bilirubinu nevydávat a požádat o nový odběr, což je nepříjemné jak pro zdravotnický personál, tak především pro pacienta.

Pro kvantifikaci hemolýzy, chylozity a ikterity vzorku lze využít automatické semikvantitativní měření tzv. sérových indexů (H = hemolýzy, I = ikterity a L = lipémie), což je přesnější, než posuzování kvality vzorku pozorováním okem. Hemolýza je viditelná okem od koncentrace volného hemoglobinu cca 1,00 g/l, je obtížné rozlišit jednotlivé stupně hemolýzy, zatímco rozsah automatického semikvantitativního měření indexu hemolýzy je 5 až 1 200 (odpovídá koncentraci hemoglobinu 0,05 - 12,00 g/l) [1, 7].

Evropská směrnice pro in vitro diagnostiku (IVDD) stanovuje povinnost výrobců reagencií definovat odpovídající interference a omezení. Příbalový leták fy Roche pro přístroj Modular udává možnost stanovení celkového bilirubinu bez významné interference až do H indexu 1 000 (odpovídá 10,00 g/l nebo 621,0 µmol/l hemoglobinu), pro přístroj Cobas c501 ale pouze do H indexu 50 (odpovídá přibližně 0,50 g/l nebo 31,0 µmol/l hemoglobinu) při koncentraci bilirubinu do 17 µmol/l, u novorozeneckých sér při koncentraci bilirubinu 150 µmol/l do H indexu 400 (= 4,00 g/l nebo 248,4 µmol/l hemoglobinu). Pro bilirubin přímý je shodně u obou analyzátorů uvedena možnost stanovení bez významné interference do H indexu 25 (odpovídá přibližné koncentraci hemoglobinu 0,25 g/l nebo 15,6 µmol/l) [7].

V 1. pololetí 2012 byl na OKB Thomayerovy nemocnice v Praze změřen index hemolýzy celkem u 47 840 pacientských vzorků, koncentrace hemoglobinu ≤ 0,50 g/l byla zjištěna u 45 776 vzorků (95,7 %), koncentrace hemoglobinu v intervalu 0,5 - 3,00 g/l u 1 856 vzorků (3,9 %) a koncentrace hemoglobinu ≥ 3,01 g/l u 208 vzorků, což je 0,4 % celkového počtu. V následujícím období se stav mírně zlepšil, přesto je hemolýza bohužel velmi častým problémem kvality vzorku, se kterým se musíme v laboratoři potýkat, což koresponduje též s údaji z literatury [3-6, 8].

Vzhledem k nejednotnosti firemních údajů o přípustném stupni hemolýzy jsme se rozhodli vlastním experimentem ověřit vliv hemolýzy na stanovení bilirubinu celkového i přímého a určit mezní stupeň hemolýzy, od kterého nelze kvantitativní výsledek vydat.

Materiál a metody

Pro měření závislosti hodnoty celkového a přímého bilirubinu na hemolýze byly vybrány pacientské vzorky sér z rutinního provozu s vyžádaným vyšetřením bilirubinu (s koncentrací bilirubinu v rozsahu od nízkých do vysoce patologických koncentrací) a nízkou primární hemolýzou (index H méně než 18 = koncentrace hemoglobinu 0,18 g/l nebo 11,2 µmol/l). Podle koncentrace bilirubinu pak byly vytvořeny 4 skupiny pro celkový bilirubin a 3 skupiny pro bilirubin přímý – viz Tabulka 1 a 2.

Přídavkem 5 µl hemolyzátu (vhodným ředěním předem připraveného) k 100 µl séra bylo dosaženo 4 různých stupňů hemolýzy (H index cca 35, 90, 170 ≥ 500), což bylo ověřeno měřením.

Hemolyzát byl připraven zmrazením a následným rozmrazením pacientských vzorků plné krve. Pro přípravu různého stupně hemolýzy bylo pipetováno:

1. 1 000 µl fyziologického roztoku a 5 µl hemolyzátu plné krve pro přípravu vzorků s indexem hemolýzy cca 35,
2. 1000 µl fyziologického roztoku a 50 µl hemolyzátu plné krve pro přípravu vzorků s indexem hemolýzy cca 90,
3. 1000 µl fyziologického roztoku a 400 µl hemolyzátu plné krve pro přípravu vzorků s indexem hemolýzy cca 170,
4. 1000 µl fyziologického roztoku a 1500 µl hemolyzátu plné krve pro přípravu vzorků s indexem hemolýzy ≥ 500.

Vzorky byly na požadovanou hodnotu H indexu upraveny následným ředěním fyziologickým roztokem nebo přídavkem hemolyzátu. Vzhledem k tomu, že přídavek hemolyzátu nebo fyziologického roztoku činil pouze cca 4 - 5 % celkového objemu vzorku (minimální diluce), nebyla koncentrace bilirubinu původních pacientských vzorků znovu analyzována s přídavkem stejného množství fyziologického roztoku.

Měření koncentrace bilirubinu celkového a přímého bylo provedeno na biochemickém analyzátoru Cobas c501 (Roche) soupravami Roche Bilirubin Total DPD Gen. 2 (diazo-metoda: nepřímý bilirubin je uvolněn detergentem, celkový bilirubin pak reaguje přímo s 3,5-dichlorfenyldiazoniovou solí v prostředí kyselého pufru za vzniku červeného azobilirubinu; intenzita červeného zbarvení je přímo úměrná koncentraci celkového bilirubinu) a Bilirubin Direct (diazo-metoda: přímý bilirubin reaguje s 3,5-dichlorofenyldiazoniovou solí v prostředí kyselého pufru za vzniku červeného azobilirubinu; intenzita červeného zbarvení je přímo úměrná koncentraci celkového bilirubinu). Měření sérových indexů bylo provedeno na biochemickém analyzátoru Cobas c501 soupravou Serum Index Gen. 2. Principem testu je naředění vzorku pacienta fyziologickým roztokem (0,9% NaCl) a stanovení absorbance bichromatickým měřením pro hemolýzu při 570 a 600 nm s korekcí na překrývání interferenčního spektra. Hodnoty sérových indexů pro jednotlivé metody, od kterých může docházet k ovlivnění analýz, jsou uvedeny výrobcem v příbalových letácích k reagenciím.

Statistické zpracování: k odhadu křivek (obr. 2 a 4) byla použita metoda nejmenších čtverců, k testování shody křivek byla použita metoda kontrastu v analýze rozptylu.

Výsledky a diskuse

Výsledky měření koncentrace celkového bilirubinu při různých stupních hemolýzy jsou shrnuty v Tabulce 1 a na obr. 1 a 2.

Výsledky měření koncentrace přímého bilirubinu při různých stupních hemolýzy jsou shrnuty v Tabulce 2 a na obr. 3 a 4.

Provedeným experimentem jsme zjistili zřetelný pokles naměřených hodnot celkového i přímého bilirubinu v závislosti na zvyšujícím se stupni hemolýzy, což odpovídá principu interference hemoglobinu, uváděnému v literatuře [1, 3, 7-8]. Nicméně z obr. 2 je patrné, že cca u hemolýzy H 200 dochází k ohybu přímek (lineární závislosti koncentrace celkového bilirubinu na hemolýze) a postupnému vzestupu hodnot celkového bilirubinu.

Ještě zřetelnější je tento trend na obr. 4, kde ve skupině s nízkou koncentrací přímého bilirubinu (do 11,0 µmol/l) byla do indexu H cca 100 zjištěna rovněž při-bližně lineární závislost na hemolýze (pokles hodnot se vzrůstající hemolýzou), avšak s nárůstem indexu hemolýzy nad 100 dochází k ohybu křivky a postupnému vzestupu hodnot přímého bilirubinu, který je již velmi markantní u silné hemolýzy, tj. H indexu více než 500 (+ 174 %). Tento falešný nárůst koncentrace přímého i celkového bilirubinu je pravděpodobně způsobený přímou fotometrickou interferencí (nárůstem absorbance) vysoké koncentrace volného hemoglobinu v séru.

Z obr. 2 a 4 je také zřejmé, že stupeň interference hemolýzy je v závislosti nejen na velikosti hemolýzy (koncentraci volného hemoglobinu), ale též v závislosti na koncentraci bilirubinu. Při nízkých koncentracích bilirubinu působí hemolýza relativně velkou změnu výsledku, tzn., že koncentrace bilirubinu ve fyziologických mezích jsou nejvíce vulnerabilní vůči hemolýze. Z klinického hlediska by především vzorky s koncentrací bilirubinu kolem horní referenční meze neměly být hemolytické.

Jako klinicky významnou změnu koncentrace bilirubinu vlivem hemolýzy jsme určili změnu o 10 a více % (též s přihlédnutím k intraindividuální variabilitě bilirubinu a v neposlední řadě k analytické chybě systému). Z odhadnutých křivek jsme jednoduchým výpočtem určili jako mezní stupeň hemolýzy index H 94,5 ≈ 95 (= 0,95 g/l nebo 59,0 µmol/l hemoglobinu) pro stanovení celkového bilirubinu a index H 52,5 ≈ 53 (= 0,53 g/l nebo 32,9 µmol/l hemoglobinu) pro stanovení přímého bilirubinu. Při vyšší hemolýze nahrazujeme kvantitativní výsledek textem „hemolýza“. Při hodnotách H indexu nižších než mezní ke kvantitativnímu výsledku koncentrace bilirubinu připojujeme komentář „slabá hemolýza“ (od koncentrace H indexu 32 = 0,32 g/l = 19,9 µmol/l hemoglobinu) [3-4].

Závěr

Semikvantitativní měření sérových indexů včetně indexu hemolýzy pokládáme za nezbytné pro posouzení vhodnosti biologického materiálu ke zpracování. Po zhodnocení výsledků měření, vzhledem k vypočteným statistickým parametrům, jsme určili mezní stupeň hemolýzy pro stanovení celkového i přímého bilirubinu metodou užívanou v naší laboratoři. Při vyšší hemolýze by vzhledem k prokazatelně významnému ovlivnění neměl být kvantitativní výsledek koncentrace bilirubinu vydán. Primární snahou ale zůstává prevence problému a snížení množství hemolytických vzorků biologického materiálu předcházením chybám v preanalytické fázi.

Autoři sdělení děkují firmě Roche s.r.o. za laskavé poskytnutí podpory pro provedení prezentovaných experimentů.

Do redakce došlo 3. 7. 2013

Adresa pro korespondenci

Ing. Jaroslav Procházka

Nemocnice s poliklinikou Česká Lípa, a.s.

Purkyňova 1849

470 77 Česká Lípa

e-mail: jaroslav.prochazka@nemcl.cz