Asymetrický dimetylarginin - nový rizikový faktor kardiovaskulárních onemocnění

Souhrn

K nejvýznamnějším poznatkům minulých deseti let patří pochopení úlohy oxidu dusnatého (NO), signální molekuly uvolňované z buněk endotelu, na cévní systém: snižuje tonus cévní stěny, brání adhezi buněk k cévní stěně, působí proti aktivaci trombocytů a brání rozvoji aterosklerózy. Snížená biologická dostupnost NO je považována za jeden z patogenetických faktorů při vzniku kardiovaskulárních onemocnění. Asymetrický dimetylarginin (ADMA) je endogenní inhibitor syntázy oxidu dusnatého, enzymu katalyzujícího vznik NO z argininu. Tento článek předkládá stručný pohled na současný stav problematiky vztahu mezi ADMA a kardiovaskulárním onemocněním. Zvýšená hladina ADMA je spojena se sníženou produkcí NO způsobující vazokonstrikci. V několika prospektivních studiích byl ADMA prokázán jako marker kardiovaskulárního rizika. V prvých kapitolách je popsán dosavadní výzkum biosyntézy, degradace a vylučování ADMA ve vztahu k endotelové dysfunkci, koronárnímu onemocnění srdce, kardiovaskulárnímu riziku u hemodialyzovaných, k diabetes mellitus, hypertenzi, poruchám lipidového metabolizmu a prognóze nemocných v intenzivní péči. Další kapitoly stručně popisují metody detekce ADMA a frekvenci jejich využití. V závěru je diskutován klinický význam stanovení ADMA jako markeru endotelové dysfunkce. Budoucnost výzkumu úlohy ADMA zřejmě směřuje k prospektivním studiím různých skupin pacientů, jakož i běžné populace s výhledem na možnost farmakologického ovlivnění vysokých hladin ADMA.

Klíčová slova:
endotelová dysfunkce - oxid dusnatý - asymetrický dimetylarginin - prognóza - kardiovaskulární onemocnění

Úvod

Přítomností tradičních rizikových faktorů, jako je hypercholesterolemie, hypertenze, kouření a diabetes mellitus, se dá vysvětlit asi 80 % případů koronárních onemocnění. Přestože u zbývající části pacientů s koronárním onemocněním tyto rizikové faktory chybí, dochází k progresi choroby. V průběhu několika posledních let byly objeveny a popsány nové rizikové faktory aterosklerózy a vysvětleno jejich působení na molekulární úrovni. Jedním z míst, kde dochází k funkčním změnám, vedoucím později k rozvoji k aterosklerotického procesu, jsou buňky endotelu. Poškození endotelu je jedním z několika intenzivně zkoumaných parametrů předpovídajících riziko rozvoje aterosklerózy. Většina nových studií udává, že důležité prognostické informace o kardiovaskulárních komplikacích lze zjistit sledováním některých parametrů v periferním krevním oběhu. Jedním z nich je i oxid dusnatý, resp. jeho radikál (^·NO), který vzniká dvoustupňovou reakcí z L-argininu působením syntázy oxidu dusnatého (NO-synthasy, NOS), ale i bez jejího vlivu, a to působením superoxidu. Tyto reakce umožňují vznik NO i ve tkáních neobsahujících NOS. NO způsobuje vazodilataci a je klíčovým inhibitorem adheze a agregace trombocytů. Navíc tato molekula snižuje produkci superoxidového radikálu v cévách a působí jako inhibitor oxidace lipoproteinů o nízké hustotě (LDL). Inhibicí produkce tkáňového faktoru v monocytech brzdí NO iniciaci koagulační kaskády. Hojivé pochody a remodelace cévní stěny jsou rovněž kontrolovány NO. Vzhledem k významnému vlivu NO na cévní stěnu je jeho mezinárodní název „endogenous anti-atherosclerotic molecule“ více než výstižný.

ADMA - endogenní inhibitor NOS

Oxid dusnatý resp. jeho radikál (^·NO) způsobuje vazodilataci a je klíčovým inhibitorem adheze a agregace trombocytů [1]. Syntéza NO je selektivně inhibována kompetitivní blokádou aktivního centra NOS dvěma deriváty L-argininu: N^G-monometyl-L-argininem (L-NMMA) a N^G,N^G-dimetyl-L-argininem (asymetrický dimetylarginin - ADMA). Koncentrace ADMA v krvi je desetkrát vyšší než koncentrace druhého derivátu (L-NMMA) a tím je určena i jeho role hlavního inhibitoru NOS [2,3]. Valace et al byli první, kdo popsali ADMA jako hlavní endogenní inhibitor NOS v plazmě, ačkoli ještě neznali způsob interference metylargininů se signální transdukční cestou. Na rozdíl od ADMA, symetrický dimetylarginin (SDMA) nezpůsobuje inhibici NOS.

Data z experimentálních studií potvrzují patologickou koncentraci ADMA v rozmezí 3-15 µmol/l, kdy prokazatelně dochází k inhibici produkce NO endotelem [4-7]. Faraci et al [6] určili hodnotu 1,8 ± 0,1 µmol/l jako IC₅₀ pro inhibici syntázy NO molekulou ADMA v homogenátu krysích mozečků (IC₅₀ je taková koncentrace inhibitoru, která působí pokles aktivity příslušného enzymu, v našem případě NOS, na polovinu). U experimentů in vitro (aortální buňky endotelu hovězího dobytka) bylo nedávno prokázáno, že vysoká koncentrace ADMA (IC₅₀ = 3,9 µmol/l) inhibuje aktivitu jak endotelové tak neuronální NOS [24].

NOS je dimer složený ze dvou domén, oxidující a redukující. Za ideálních katalytických podmínek (je přítomen substrát L-arginin a kofaktory: tetrahydrobiopterin, kalmodulin, NADPH, flavinmononukleotid - FMN a flavinadenindinukleotid - FAD v optimální koncentraci) probíhá transfer elektronu z molekuly kyslíku přes kaskádu kofaktorů až k L-argininu. Produkty této reakce jsou NO a L-citrulin. Pokud dojde k porušení optimálních podmínek (deficit L-argininu, převaha LDL cholesterolu, přítomnost ADMA), cyklus přenosu elektronu je přerušen a dochází ke vzniku superoxidového radikálu (O₂^·-) jako důsledek přijetí elektronu molekulou kyslíku [8-10].

Biosyntéza, metabolizmus a vylučování ADMA

Biochemické cesty přeměny asymetrického dimetylargininu a jeho odbourávání jsou znázorněny na obr. 1. Působením enzymu proteinmetyltransferázy (PRMT) I a II dochází k metylaci zbytků argininu v molekulách proteinů. Při jejich degradaci vznikají dva stereoizomery, ADMA a SDMA. Lidské endotelové buňky jsou schopny syntetizovat ADMA i SDMA [11-15]. ADMA zde za určitých podmínek, např. za přítomnosti oxidovaných LDL, figuruje jako autokrinní regulátor aktivity entotelové NOS. Ito et al [16] prokázali, že po inkubaci oxidovaných LDL a TNF-α (tumor necrosis factor) s buňkami endotelu dochází na rozdíl od kontrolní skupiny ke zvýšení hodnot ADMA. Hladina dimetylargininů v cytoplazmě (nikoliv v extracelulárním prostoru) byla též zvýšena. Bogle et al [17] demonstrovali kompetitivní inhibici ADMA na vazebném místu pro L-arginin. Stejné výsledky popsali Azuma et al [14] u balónové angioplastiky. Prokázali, že regenerovaný endotel produkuje více ADMA než kontrolní buňky.

Jak ADMA, tak SDMA jsou eliminovány renální exkrecí. Je známo, že pacienti v terminální fázi renálního onemocnění (end stage renal disease - ESRD) mají hodnoty ADMA v plazmě až 5krát vyšší než zdravé kontroly. Velké skupiny pacientů s renálním selháním byla sledována jak v Evropě, tak v USA. Výsledky těchto prací shrnul Kielstein et al [18], a ačkoli se absolutní hodnoty koncentrací ADMA liší v závislosti na použité metodě měření, je z této práce patrné zvýšení ADMA i SDMA řádově 2krát až 10krát vůči zdravým kontrolám. U hemodialyzovaných pacientů lze nalézt vysokou hladinu jak ADMA tak SDMA na rozdíl od pacientů léčených peritoneální dialýzou, kde je zvýšen pouze SDMA a nikoli ADMA [19,20]. Lze tedy konstatovat, že eliminace SDMA probíhá pouze ledvinami, na rozdíl od ADMA, kde bylo nutné hledat další metabolickou dráhu pro jeho odbourání. Gross et al nalezli vztah koncentrace ADMA k vazodilataci závislé na endotelu, kdy při peritoneální dialýze hodnoty ADMA byly zvýšeny, nedocházelo k vazodilataci endotelu na rozdíl od hemodialyzovaných po hemodialýze s nízkou hodnotou ADMA, kde vazodilatace byla prokázána [21].

Metabolizmus ADMA, ale nikoli SDMA, probíhá hydrolytickou degradací na citrulin a dimetylamin pomocí enzymu dimetylarginin-diaminohydrolázy (DDAH) [22].

Inhibice DDAH způsobuje vazokonstrikci, která je reverzibilní za přítomnosti L-argininu [15]. Jsou známy dvě izoformy DDAH: DDAH-1 a DDAH-2. První z nich lze nalézt v tkáni syntetizující neuronální NOS a druhou v tkáních zodpovědných za syntézu endotelové NOS [23]. Aktivita tohoto enzymu je závislá na komplexu regulačních mechanizmů, které ještě nejsou zcela detailně popsány. Bylo prokázáno, že oxidační stres indukovaný oxidovanými LDL nebo TNF-α snižuje aktivitu DDAH, ale nikoli expresi jejího proteinu v buňkách endotelu in vitro [16]. Aktivita DDAH je blokována zvýšenou koncentrací homocysteinu (Hcy) v buňce jednak pomocí redox přenašečů a zároveň přímou interferencí Hcy se samotnou DDAH. Oba mechanizmy vedou ke zvýšení koncentrace ADMA [24]. Dále je DDAH inaktivována S-nitrosylací [25], což vede k předpokladu zpětné regulace hladiny ADMA při zvýšené hladině NO. Exprese genu DDAH je indukována tzv. all-trans retinovou kyselinou [26]. Závěrem lze tedy konstatovat, že ADMA je produkován zcela běžně v důsledku přeměny proteinů a k jejímu hromadění dochází zejména v závislosti na aktivitě DDAH.

ADMA u jednotlivých klinických stavů

Endotelová dysfunkce je někdy považována za časné stadium aterosklerózy. Dochází ke snížené syntéze oxidu dusnatého (NO) v cévní stěně (hlavní vazodilatační látka) a naopak ke zvýšené produkci látek s vazokonstričními účinky (endotelin-1, tromboxan A2, prostaglandin H2 aj.). Přehled onemocnění souvisejících se zvýšenou hladinou ADMA udává tab. 1.

ADMA a kardiovaskulární onemocnění

Zvýšená hodnota ADMA v lidské plazmě u nemocných s hypercholesterolemií s aterosklerózou byla prokázána již v roce 1998. Koncentrace ADMA (u zdravých jedinců 1,0 µmol/l) dosáhla hodnoty 2,2 µmol/l u mladých, klinicky asymptomatických jedinců s hypercholesterolemií [27]. U starších pacientů s onemocněním periferních arterií a generalizovanou aterosklerózou byly změřeny hladiny ADMA od 2,5 do 3,5 µmol/l; jejich výše odpovídala stadiu poškození cévního systému [28]. Multicentrická studie CARDIAC, provedená v Německu a zahrnující 400 pacientů s koronárním onemocněním srdce (CAD) a více než 400 zdravých jedinců, potvrdila signifikantně zvýšené hodnoty ADMA u pacientů s CAD na rozdíl od věkem a pohlavím srovnatelných zdravých jedinců [29].

Pacienti s chronickou srdeční nedostatečností mají vyšší koncentraci ADMA než zdraví jedinci [34]. Echokardiografické parametry ukazující funkci levé srdeční komory u 198 pacientů s ESRD jevily významný vztah k hladině ADMA: pozitivní byla korelace mezi koncentrací ADMA a tloušťkou stěny levé komory myokardu, významný inverzní vztah byl nalezen mezi ADMA a hodnotou ejekční frakce [35]. Další z poznatků souvisejících se zvýšenou hladinou ADMA je inverzní vztah mezi ADMA a maximální spotřebou kyslíku během fyzické zátěže [34].

ADMA u hemodialyzovaných pacientů

Pacienti s chronickou renální insuficiencí byli první skupinou s vysokou hladinou ADMA, získané výsledky byly publikovány a potvrzeny mnoha dalšími studiemi [30,31,32]. Zvýšení hladiny ADMA u hemodialyzovaných pacientů je částečně způsobeno zhoršenou eliminací ADMA během dialýzy [20]. Takto chronicky zvýšená hladina ADMA může částečně souviset s vysokým výskytem kardiovaskulární morbidity a mortality u pacientů s chronickou renální insuficiencí [30]. Vzhledem k výše uvedeným výsledkům byla provedena prognostická studie s 224 hemodialyzovanými pacienty: pacienti s hodnotou ADMA v nejvyšším kvartilu vykazovali nejvyšší celkovou úmrtnost a nejvíce kardiovaskulárních příhod během dalších tří let, kdy byli sledováni (graf 1). Např. celková úmrtnost pacientů během 33 měsíců sledování byla o 72 % vyšší u pacientů s hodnotou ADMA nad mediánem (2,52 µmol/l) ve srovnání s těmi, jejichž koncentrace ADMA byla nižší než medián [33]. Přestože je díky omezené glomerulární filtraci vysoká hladina ADMA u hemodialyzovaných obvyklá, lze tyto nemocné podle koncentrace ADMA rozdělit na skupiny s vysokým a nízkým rizikem.

ADMA a diabetes mellitus

ADMA může též hrát důležitou roli jako ukazatel rizika kardiovaskulárních komplikací u diabetických pacientů. V sérii studií různých autorů je popsána zvýšená hladina ADMA u diabetiků 2. typu [36-38]. Molekulární mechanizmus zvýšení ADMA v plazmě u diabetiků lze objasnit například oxidačním stresem, který porušuje aktivací PRMT rovnováhu mezi tvorbou ADMA a jeho odbouráváním účinkem DDAH [41] nebo mechanizmem závislým na angiotenzimu II [40].

ADMA a metabolizmus lipidů

Existuje zřejmě vztah mezi přítomností tradičních rizikových faktorů aterosklerózy (dyslipidemie) a endotelovou dysfunkcí. Jedním z mechanizmů, spojujících poruchy lipidového metabolizmu s endotelem, je aminokyselina ADMA. Ta působí jako inhibitor základního enzymu, potřebného pro tvorbu oxidu dusnatého - NOS. Bylo například zjištěno, že u zdravých osob s hypercholesterolemií dochází asi k dvojnásobnému zvýšení koncentrace ADMA ve srovnání s osobami s normální hladinou cholesterolu. Jednalo se o mladé jedince bez klinické manifestace aterosklerózy. Zvýšení koncentrace ADMA bylo navíc doprovázeno zhoršenou schopností vazodilatace a sníženou hladinou metabolitů NO v moči [27]. Podobné změny byly pozorovány i v některých pokusech na zvířecích modelech [41]. Dále bylo prokázáno, že rovněž hypertriacylglycerolemie, další významný rizikový faktor aterogeneze, je asociována se zvýšenou koncentrací ADMA [31]. Patofyziologie zvýšené koncentrace ADMA u poruch lipidového metabolizmu je však zatím neznámá [42] a lze pouze předpokládat vliv léčby fibráty na zvýšení hladiny Hcy, a tím nepřímo i na ADMA.

Intenzivní péče

V holandské studii s 52 pacienty léčenými na jednotkách intenzivní péče byl ADMA při použití mnohorozměrné analýzy jedním ze silných prediktorů přežití [43]. Pacienti s hodnotou ADMA v nejvyšším kvartilu byli 17krát více ohroženi rizikem selhání životních funkcí. Také bylo prokázáno, že hladina ADMA v plazmě je kontrolována z velké části funkcí ledvin a jater [43,44]. Některé studie hovoří v této souvislosti o zvýšení ADMA u pacientů se selháním jaterních funkcí [45].

Metody detekce ADMA

První metoda měření ADMA byla založena na vysokorozlišovací kapalinové chromatografii (HPLC). Tato metoda umožňuje kvantitativně rozdělit dva velmi podobné stereoizomery, ADMA a SDMA (symetrický dimetylarginin). Metoda je založena na separaci vzorku pomocí chromatografie na reverzní fázi na koloně C18 izokratickým způsobem. Po preanalytické fázi (deproteinace a následná derivatizace všech homologů L-argininu) následuje nástřik na kolonu a fluorescenční detekce [46,47].

V současné době je tato metoda nahrazována jinou, časově i finančně méně náročnou enzymatickou imunoanalýzou (enzyme-linked immunosorbent assay - ELISA). Tato nová metoda využívá vysoké specifity polyklonálních protilátek (kompetitivní princip, odlišení dvou stereoizomerů ADMA a SDMA se děje acylací) a byla srovnána s metodami kapalinové (LC-MS, Liquid Chromatography-Mass Spectrometry) a plynové chromatografie (GC-MS, Gas Chromatography-Mass Spectrometry). Výsledkem byla dobrá korelace těchto dvou metod, daná korelačním koeficientem r = 0,424 [48].

Klinický význam stanovení ADMA

Výsledky výše zmíněných studií naznačují, že by zvýšená koncentrace ADMA mohla sloužit jako marker endotelové dysfunkce a časných stadií aterogeneze. Její monitorování by tedy mohlo být prospěšné zejména v primární prevenci těchto poruch. Skutečnost, že významné zvýšení rizika bylo zjištěno pouze u pacientů s hodnotou ADMA v nejvyšším kvartilu, ukazuje, že existuje nějaká „kritická koncentrace“ ADMA v plazmě, která je důležitá při uplatnění jeho patologického vlivu.

S rostoucími poznatky o metabolizmu ADMA lze dále diskutovat možná terapeutická řešení, z nichž nejjednodušší se jeví suplementace L-argininem. Schopnost exogenního L-argininu zlepšovat funkci a strukturu cév byla prověřena několika experimentálními a klinickými studiemi. Tyto studie prokázaly, že L-arginin zlepšuje funkci endotelu a zároveň redukuje klinické symptomy prodělaných kardiovaskulárních onemocnění [49-53]. Mechanizmus působení je jasný - přirozený substrát L-arginin vytěsňuje s aktivního centra NOS kompetitivní inhibitor tohoto enzymu, ADMA. Některé prameny rovněž uvádějí snížení hladiny ADMA v důsledku podávání ACE inhibitorů nebo blokátorů angiotenzinových receptorů [54] a pod vlivem substituce folátem [55]. Další možností snížení koncentrace ADMA představuje podání statinů [56,57], i když naopak Jing et al ve své studii popírají vliv simvastatinu na aktivitu DDAH či snížení koncentrace ADMA [58]. Další možností je ovlivnění oxidačního stresu podáváním antioxidantů - superoxid totiž zvyšuje aktivitu metylačních enzymů a tedy následně i produkci ADMA [59]. Zdá se, že pomůže i snížení hmotnosti - u morbidně obézních pacientek (BMI = 49) byla plazmatická koncentrace ADMA vyšší než u kontrol (BMI < 25) a při poklesu hmotnosti na BMI 34 koncentrace ADMA signifikantně klesla [60].

Závěr

Objev a popsání metabolizmu ADMA a dalších metabolitů z cyklu homocysteinu představuje další pokrok v prevenci a léčbě onemocnění souvisejících s oxidačním stresem. Na základě dnešních poznatků se zdá, že ADMA je významným prediktorem rozvoje aterosklerózy a onemocnění endotelu (endotelové dysfunkce). Je známo, že dosud sledované rizikové faktory nevysvětlují zcela vznik všech akutních koronárních příhod. Sledování ADMA by mohlo tuto situaci alespoň u některých pacientů zlepšit. Je nutné pokračovat v dalších multicentrických studiích s cílem detailněji popsat vliv ADMA na regeneraci endotelu a ev. i určení tzv. kritické hladiny u rizikových skupin pacientů.

Tato práce vznikla za podpory grantu GA UK 78/2005/C/LFP.

Mgr. Romana Široká

www.fnplzen.cz

e-mail: sirokar@fnplzen.cz

Doručeno do redakce: 24. 11. 2005

Přijato po recenzi: 2. 1. 2006