Imunohematologie

025

ERYTROCYTÁRNÍ ALOIMUNIZACE V TĚHOTENSTVÍ – POHLEDEM IMUNOHEMATOLOGA

Holusková I., Sláviková M., Andrýsková A., Galuszková D.

Transfuzní oddělení FN v Olomouci

– POHLEDEM PERINATOLOGA

Ľubušký M.

Gynekologicko-porodnická klinika a Ústav lékařské genetiky a fetální medicíny LF UP v Olomouci

Úvod: Erytrocytární aloimunizace v těhotenství představuje i v dnešní době mnohdy závažný interdisciplinární problém. Antierytrocytární aloprotilátky vznikají jako reakce mateřského imunitního systému na kontakt s antigeny erytrocytů plodu. Po prostupu placentou do fetálního krevního řečiště následuje destrukce fetálních erytrocytů v retikulo-endoteliálním systému plodu se závažnými klinickými důsledky pro plod.

Metodika: V letech 2000–2008 jsme na našem transfuzním oddělení vyšetřili 33 818 těhotných žen a sledovali výskyt jednotlivých antierytrocytárních aloprotilátek. U všech těhotných žen byl většinou v prvním trimestru gravidity proveden screening nepravidelných tepelných antierytrocytárních protilátek v nepřímém antiglobulinovém (LISS/NAT) a enzymovém (papain) testu s jejich následnou identifikací pomocí panelu typových erytrocytů metodou sloupcové aglutinace DiaMed.

Výsledky: Během posledních 8 let jsme detekovali celkem 482 klinicky významných aloprotilátek. Nejčastější příčinou erytrocytární aloimunizace v graviditě byl antigen E (172/33818), antigen D (127/33818), dále pak M (46/33818), C (44/33818), K (41/33818), c (20/33818), S (15/33818), Jk^a (7/33818), Fy^a (2/33818). V 886 případech byly detekovány nespecifické protilátky, a to zejména v enzymovém (papain) testu. V období  2005–2008 jsme se zaměřili na záchyt aloprotilátek v jednotlivých testech. V enzymovém (papain) testu bylo detekováno 170 specifických antierytrocytárních aloprotilátek, v LISS/NAT 40 specifických antierytrocytárních aloprotilátek a současně v obou prostředích 121 antierytrocytárních aloprotilátek.

Závěr: Jak vyplývá z uvedených výsledků, nejčastější příčinou aloimunizace těhotných byl antigen E. Na snížení četnosti výskytu anti-D protilátky se zcela jistě významnou měrou podílí anti-D imunoprofylaxe. Další antigeny se na vzniku HON podílely s menší četností, avšak zajištění adekvátní hemoterapie novorozence v některých případech může být mnohdy velmi obtížné. 

026

PREVALENCE HLA PROTILÁTEK U DÁRKYŇ KRVE S GRAVIDITOU V ANAMNÉZE

Bolcková HT.¹, Matějková E.¹, Gašová Z.¹, Žlabová J.¹, Vlachová A.²

¹ÚHKT Praha, ¹TO FNKV Praha

Mezi dárci krve se vyskytují také ženy s jednou nebo více graviditami v anamnéze. V průběhu těhotenství může dojít, zejména u multipar, k  aloimunizaci paternálními antigeny plodu. Vzniklé protilátky pak mohou být příčinou potransfuzních reakcí. Mezi nejzávažnější potransfuzní reakce způsobené pasivním přenosem protilátky v transfuzním přípravku patří TRALI (Transfusion Related Acute Lung Injury). Tato vzácná reakce bývá velmi těžká a může být i fatální. Za hlavní příčinu TRALI jsou považovány antileukocytární protilátky, jak specifické granulocytární, tak i HLA protilátky I. a/nebo II. třídy. Vyšetřování HLA protilátek u dárců s imunizačním podnětem v anamnéze by mohlo být jednou z cest, jak riziko TRALI snížit.

V období od srpna do prosince 2008 jsme prováděli vyšetřování HLA protilátek u dárkyň ÚHKT a TO FNKV, které měly v anamnéze alespoň jednu graviditu.

Pro detekci HLA protilátek jsme použili LCT test a ELISA kity firmy GTI: QuikScreen [GTI] pro detekci HLA protilátek I. třídy a B-Screen [GTI] pro detekci HLA protilátek II. třídy.

Celkem jsme takto vyšetřili 105 dárkyň.

Prevalence HLA protilátek v této skupině byla 15,24 % (16/105 případů) detekovaných pomocí ELISA kitů versus 4,76 % (5/105 případů) detekovaných pomocí LCT testu. Z 16 ELISA pozitivních vzorků bylo 9 (56,25 %) anti-HLA protilátek I. třídy, 2 (12,5 %) byly II. třídy a v 5 případech (31,25 %) byla detekována směs HLA protilátek I. i II. třídy.

Mezi 16 pozitivními ženami 4 měly v anamnéze jednu graviditu, 12 jich bylo gravidních vícekrát (2–7x).

Dárkyně s pozitivními HLA protilátkami byly dočasně vyloučeny z dárcovství, hladina jejich HLA protilátek bude dále sledována.

Tato práce vznikla za podpory grantu CEZ 237360001 ÚHKT 

027

IMUNOHEMATOLOGICKÝ NÁLEZ PRI AB0 INKOMPATIBILNÝCH TRANSPLANTÁCIÁCH KRVOTVORNÝCH BUNIEK

Pavlíková D., Bobáková A., Skraková M., Zwiewka M., Mistrík M.

Fakultná nemocnica Bratislava, Klinika hematológie a transfuziológie, Slovenská republika

Úvod: Na rozdiel od orgánových transplantácií nepredstavuje AB0 inkompatibilita medzi darcom a príjemcom krvotvorných buniek (KB) prekážku pre úspešné zvládnutie transplantácie. Pri veľkej (maior) inkompatibilite môžu protilátky prítomné v krvi príjemcu spôsobiť okamžitú alebo oneskorenú hemolýzu, štep sa môže prihojiť oneskorene, prípadne môže vzniknúť izolovaný útlm erytropoezy. Pri malej (minor) inkompatibilite sa vyskytuje oneskorená hemolýza a je zvýšené riziko GVHD. Obojsmerná (maior a minor) inkompatibilita je kombináciou oboch aj s dôsledkami, ktoré z toho vyplývajú.

Cieľ: Autori retrospektívne vyhodnotili imunohematologický nález pri všetkých AB0 inkompatibilných transplantáciách KB, ktoré sa vykonali na pracovisku od augusta. 2003 do apríla 2009 s cieľom poukázať na zmeny krvnej skupiny.

Výsledky: V období od augusta 2003 do konca apríla 2009 sa na KHaT v Bratislave vykonalo 92 transplantácií KB, z toho 34 AB0 inkompatibilných (maior: 14 x, minor: 16 x, obojsmer.: 4 x).Vyhodnotiť bolo možné nálezy u 21/34 pacientov, 13 mužov a 8 žien. Priemerný vek vyhodnotených pacientov bol 35 rokov. Priemerný čas do objavenia sa krvnej skupiny darcu bol 48 dní po transplantácii KB (maior: 60 dní, minor: 52 dní, obojsmer.: 33 dní). Typickým nálezom pri minor AB0 inkompatibilite je vymiznutie krvnej skupiny pacienta, objavenie sa krvnej skupiny darcu, ale bez korešpondujúceho aglutinínu. Pri maior AB0 inkompatibilite spolu s objavením sa krvnej skupiny darcu vymizne korešpondujúci aglutinín, hoci dovtedy bol prítomný. Podobný je aj nález pri obojsmernej inkompatibilite.

Záver: Rešpektovanie aktuálneho imunohematologického nálezu pri AB0 inkompatibilných transplantáciách KB je nevyhnutné pre správne zvolenú stratégiu hemoterapie. Reziduálna krvotvorba príjemcu a imunokompetentné bunky v štepe darcu môžu byť príčinou imunohematologických problémov, vedúcich k náročnej hemoterapii a prípadne aj k neskoršiemu prihojeniu štepu. 

028

HEMOLYTICKÁ ANÉMIE INDUKOVANÁ CLARITHROMYCINEM – KAZUISTIKA

Kořístka M.^1,3, Křižáková L.², Čermáková Z.^1,3

¹Krevní centrum, Fakultní nemocnice Ostrava, ²Klinika dětského lékařství, Fakultní nemocnice Ostrava, ³Fakulta Zdravotnických studií, KVM a LB, Ostravská univerzita

Úvod: Léky indukované hemolytické anémie (HA) zprostředkované autoimunitními mechanismy představují literárně až 12 % všech AIHA. Incidence klinicky významných HA je však poměrně vzácná.

Cíl: Sdělení popisuje kazuistiku klinicky významné akutní hemolýzy indukované clarithromycinem.

Metoda: 4letá pacientka, 19 kg, 110 cm, s akutní tonzilitidou a bronchitidou léčena cefalosporiny (cefprozilum, CEFZIL plv. por. sus. ^®Bristol-Myers Squibb, 20 mg/kg/den ve 2 dávkách po dobu 3,5 dne) a poté makrolidy (clarithromycinum, KLACID por. gra. sus. ^®Abbott, 15 mg/kg/den ve 2 dávkách). Po 2 dnech léčby clarithromycinem hospitalizace pro ikterus kůže a sklér, v laboratorních nálezech celkový bilirubin 188 μmol/l, Hb 98 g/l, hemolytické sérum, v moči krev na 4 a bílkovina na 3. Provedeno 2x imunohematologické vyšetření – vstupní a kontrolní.

Výsledky: Vstupní imunohematologické vyšetření – PAT titr 16, erytrocyty senzibilizovány jen komplementem (anti-C3d 3+). Autoprotilátková reakce v NAT pozitivní 3+. Identifikace nepravidelných antierytrocytárních protilátek negativní. Kontrolní imunohematologické vyšetření 4 dny po vysazení clarithromycinu – PAT titr 4, jinak nález beze změny.

Závěr: Případ ukazuje na nutnost včasného imunohematologického vyšetření a objasnění příčiny akutní hemolýzy za účelem kauzální léčby. Předpokladem úspěšného řešení je i dobrá spolupráce klinika s pracovníkem imunohematologické laboratoře. 

029

GENOTYPOVÁNÍ KREVNÍCH SKUPIN U PŘÍJEMCŮ KREVNÍ TRANSFUZE

Štolba P., Váchová K., Masopust J.

Transfuzní oddělení Masarykovy nemocnice v Ústí nad Labem

Rozvoj technologií molekulární genetiky rozšiřuje možnosti testování krevních skupin. Více než deset let jsou známy postupy pro určování genotypu RHD genu a průběžně jsou doplňovány další geny, v současné době je možné genotypovat desítky krevně skupinových systémů včetně jejich variant. Na našem oddělení se provádí genotypování krevních skupin u pacientů s AIHA, s pozitivním přímým antiglobulinovým testem a u polytransfundovaných pacientů, u kterých nelze provést fenotypické vyšetření. Výhodou testování konkrétních genů (alel) je vysoká specifita. Nevýhodou genotypování je možná diskrepance s fenotypem (nízká míra exprese, mutace atd.), protože zachycujeme přímo gen, ale již nikoli jeho produkt.

V naší DNA laboratoři se testují krevní skupiny – Rh systému, MNS, Kidd, Duffy, Kell pomocí „in-house“ metody SSP-PCR s detekcí v agarózovém gelu. „In-house“ metodika byla validována na fenotypicky otestovaných dárcích krve. Za více než tři roky bylo statimově vyšetřeno čtrnáct pacientů z toho jeden plod. Po otestovaní byla pacientům podána transfuze erytrocytů s nejvyšší možnou shodou krevních skupin. 

030

ANTI-VEL PROTILÁTKA NEZACHYCENÁ V TESTU NA PEVNÉ FÁZI

Písačka M.¹, Králová M.¹, Kučeraková M.²

¹ÚHKT Praha, ²NTS Žilina

Úvod: Vel antigen patří mezi antigeny s vysokou frekvencí výskytu (série 901: No. 901001) s frekvencí od 0,9992 do 0,9999 v různých populací kavkazské rasy (o jiných etnických skupinách je málo informací). Síla exprese antigenu má velkou intraindividuální variabilitu, u některých osob může být velice slabá. Opracováním proteolytickými enzymy se zvyšuje detekovatelnost Vel antigenu. Molekulární podklad dosud nebyl popsán. Anti-Vel protilátky patří mezi „nebezpečné“ specificity – v první popsané kazuistice a v několika dalších byly zaznamenány těžké akutní potransfuzní reakce; naopak nebyly popsány případy HON. Anti-Vel protilátky bývají převážně třídy IgM a mají schopnost aktivovat komplement. Velké diference v síle antigenu a charakteristické vlastnosti protilátek mohou být zdrojem diagnostických problémů, které mohou být nebezpečím pro příjemce (nezachycení protilátky v předtransfuzním vyšetření a/nebo nedetekování slabých antigenů na dárcovských krvinkách).

Kazuistika: Ve vzorku krve těžce anemické pacientky s lymfadenopatií (věk 65, 7 transfuzí, 4 těhotenství) byla v 01/2009 zachycena protilátka s nejasnou specifitou. V gelových LISS/-/Coombs kartách reagovalo cca 50 % identifikačních erytrocytů na 1+ až 3+. Enzymově opracované erytrocyty (v gelových Neutral kartách) měly 100 % pozitivních reakcí (3+ až 4+). Titr enzymového testu byl 512 (v Neutral kartách) zatímco v LISS/Coombs kartách reagovalo jen neředěné sérum. Erytrocyty (testováno po transfuzích) byly PAT pozitivní (anti-IgG 1+, ale negativní po mikrohematokritové kapilárové separaci; na rozdíl od anti-C3d 4+ pozitivity, která trvala i po separaci). V Referenční laboratoři pro imunohematologii byly erytrocyty pacientky otypovány jako Vel- pomocí 3 SCARF anti-Vel (v anti-IgG Coombs kartě, pozitivní ctl. 2+). Šest rozmražených Vel-SCARF erytrocytů reagovalo negativně se sérem pacientky Coombsově i enzymovém gelovém testu. Na jedny ze silněji reagujících Vel+ panelových erytrocytů byla provedena adsorbce (1 hodina 37 °C) s následným průkazem stop IgG, 1+ IgA a 3+ IgM reakcí v monospecifické DAT kartě. Všech 14 reakcí Capture-R Ready ID Extend I panelu na přístroji Galileo ECHO bylo kompletně negativních.

Závěr: Anti-Vel protilátka byla převážně třídy IgM se stopami IgA a minimem IgG. Variabilita reakcí LISS/COOMBS gelových karet (od negativních po 3+) komplikovala identifikaci. Pacientka dostala během několika měsíců 7 TU v.s. Vel+ erytrocytů se slabou  antigenní expresí, s následným nízkým vzestupem hodnot ČKO a s objevením se C3d senzibilizace transfundovaných i vlastních erytrocytů. Naštěstí nebyly žádné známky akutní hemolýzy (možná díky současně podávané kortikoterapii). Po identifikaci anti-Vel by následující transfuze měly raději být Vel negativní (RDP – Mezinárodní registr). Kompletně negativní reakce Capture-R jsou potenciálně nebezpečné pro příjemce, vyšetřované pouze tímto systémem – to by mělo vést k diskusi, jak toto riziko eliminovat: přidat test detekující IgM anti-HFA? Do budoucna (po identifikaci molekulárního podkladu) zařadit Vel do kitů pro multiparametrové genotypování (identifikace rizikových příjemců a možný záchyt potenciálních dárců)? 

031

IMUNOHEMATOLOGICKÁ EXTERNÍ KONTROLA  (SEKK 2008–9): VÝSLEDKY, NOVINKY, KOMENTÁŘE

Písačka M.¹, Králová M.¹, Flídrová H.¹, Budina M.²

¹ÚHKT Praha, ²SEKK Pardubice

Úvod: Externí kontrola je součástí opatření k zajištění kvalitní laboratorní práce. Účast imunohematologických laboratoří v externí kontrole kvality je doporučována dokumenty Rady Evropy (Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components) i dalšími autoritami (SÚKL, NASKL, zdravotní pojišťovny). Pro ČR (a SR event. i další země) zajišťuje externí kontrolu SEKK Pardubice ve spolupráci s Referenční laboratoří pro imunohematologii na ÚHKT Praha a tato kontrola má již více než patnáctiletou tradici.

Výsledky: V roce 2008 došlo k významné změně, a to ke sloučení dvou různě obsáhlých kontrolních cyklů /„Základní imunohematologie“ (cykly IH, obsahující stanovení AB0 RhD, přimý Coombs a screening protilátek) a „Speciální imunohematologie“ (cykly IHS, obsahující kromě vyšetření shodných s IH ještě určování dalších antigenů erytrocytů, identifikaci protilátek, titraci protilátek a zkoušku kompatibility/ do jednoho celku.

Důvodem byla reakce na přání více účastníků kontroly, aby byly rozšířeny možnosti kombinování prováděných kontrol tak, aby lépe odpovídaly spektru prováděných vyšetření. Účastníci si nyní mohou objednávat ze tří skupin kontrolních materiálů (skupina 1 – vzorky E a S po 2 ml, skupina 2 – vzorky E a S po 3 ml a skupina 3 – segmenty K pro zkoušku kompatibility).

Výsledky z roku 2008 a prvních dvou cyklů 2009 potvrzují trendy posledních let – dobrou úspěšnost AB0 RhD určení, zvyšující se úspěšnost screeningu (úměrnou zvyšování počtu laboratoří, pracujících citlivějšími a spolehlivějšími technikami sloupcové aglutinace nebo pevné fáze) a ojedinělé problémy při identifikaci protilátek a křížové zkoušce. Titrace protilátek jeví poměrně velký rozptyl výsledků, související s používanými metodami a krvinkami. Pro zbývající cykly byl upraven číselník metod pro titraci a pro zkoušku kompatibility tak, aby bylo hodnocení jednoznačnější. Trvají chyby administrativního charakteru. Do budoucna zvažujeme formální úpravy v zápisu screeningu (u těhotenského screeningu již nebude povinnou součástí enzymový test, proto by současné kategorie byly zavádějící). Kromě kontrolní funkce plní IH cykly externí kontroly i úlohu edukační.