Cirkulující matrixové metaloproteinázy jako biomarkery u kolorektálního karcinomu

Souhrn

Cílem této rešerše je přinést ucelený pohled na perspektivní nádorové markery, a to matrixové metaloproteinázy a jejich přirozené tkáňové inhibitory. Jedná se o markery potenciálně využitelné zejména v pooperačním follow-up u pacientů s kolorektálním karcinomem.

Klíčová slova:

matrixové metaloproteinázy – kolorektální karcinom – sérové biomarkery

Úvod

V České republice bylo v roce 2017 nově diagnostikováno 7334 pacientů s kolorektálním karcinomem a 3646 pacientů na něj zemřelo [1]. Pětileté relativní přežití u tohoto onemocnění závisí na klinickém stadiu v době diagnózy: zatímco u pacientů, kde je nemoc zachycena v klinickém stadiu I, dosahuje pětileté relativní přežití téměř 91 %, u metastatického onemocnění − stadium IV – je to necelých 16 % [2]. Navzdory značnému pokroku v diagnostice, screeningu a léčbě tohoto onemocnění zůstává i nadále téměř 60 % pacientů s kolorektálním karcinomem diagnostikováno v klinickém stadiu III nebo vyšším [1]. Včasná diagnostika spolu s odhadem prognózy pacienta by mohla podstatně zvýšit šanci pacientů na dlouhodobé přežití.

Významným pomocníkem v klinickém rozhodování jsou vedle klinicko-patologických faktorů sérové biomarkery (CEA, CA 19-9 aj.), a to zejména pro follow up nádoru a monitoraci léčby. Jen v omezené míře jsou však tyto biomarkery použitelné pro odhad agresivity nádoru a prognózu. Předpokládá se, že biomolekuly spojené přímo s nádorem, jeho růstem, invazivitou a metastatickým procesem, ke kterým patří matrixové metaloproteinázy, by mohly být vhodnými doplňkovými biomarkery pro odhad agresivity nádoru a prognózu pacienta.

Matrixové metaloproteinázy – klasifikace a struktura

Matrixové metaloproteinázy (MMPs) jsou velkou skupinou Zn2+ dependentních endopeptidáz. Patří do rodiny metzincinových proteáz a hrají důležitou roli v remodelaci tkání a degradaci proteinových komponent extracelulární matrix (ECM).

U obratlovců bylo identifikováno 28 různých typů MMPs, z nichž 23 typů je exprimováno v lidských tkáních. Klasické třídění MMPs je založeno především na in vivo substrátové specificitě a struktuře jednotlivých MMPs (Tab. 1).

MMPs se rozdělují do šesti skupin: kolagenázy, gelatinázy, stromelysiny, matrilysiny, membránové MMPs a jiné MMPs. Kolagenázy štěpí celou řadu proteinů ECM, ale jejich hlavní význam spočívá ve schopnosti štěpit fibrilární kolageny. Gelatinázy obsahují ve struktuře navíc tři fibronektinové domény, umožňující vázat se na gelatin, kolagen a laminin. Mohou se chovat i jako kolagenázy. Aktivita gelatináz je klíčová v metastatickém procesu (migrace buněk a jejich růst ve vzdáleném místě), vyšší exprese byla popsána u různých typů nádorů. Stromelysiny mají stejnou strukturu jako kolagenázy, ale neumějí štěpit intersticiální kolagen. Matrilysiny jako jediná skupina neobsahují hemopexinovou doménu, nezbytnou pro štěpení kolagenů. Metaloproteinázy membránového typu obsahují v prodoméně furinu podobnou oblast, umožňující aktivaci proenzymu proteolytickým odstraněním prodomény. Jsou aktivované intracelulárně a aktivní enzymy jsou exprimovány na buněčném povrchu. Dělí se na trans­membránové MT-MMPs a MT-MMP spojené GPI (glykosyl-fosfatidyl-inositol).

Proteinová struktura metaloproteináz určuje jejich funkci. Je tvořena několika charakteristickými společnými oblastmi (Schéma 1).

Rozeznáváme následující charakteristické oblasti:

• Signální N-terminální peptidová oblast – směruje peptid k jeho sekreční dráze. Všechny MMPs jsou syntetizovány s touto doménou, která je posléze odštěpena v endoplazmatickém retikulu za vzniku propeptidu.
• Prodoména – je zodpovědná za to, že MMP je neaktivní, prostřednictvím vazby cysteinu s kationtem Zn2+ katalytické domény mechanismem tzv. „cysteinového přepínače“, a je odstraněna během proteolytické aktivace.
• Katalytická oblast obsahující kationty zinku – podílí se na štěpení nekolagenových substrátů; její struktura je odpovědná za rozdílnou selektivitu jednotlivých MMPs.
• Spojka (hinge region), spojující katalytickou doménu a hemopexinovou doménu. Toto pojítko je důležité pro aktivitu příslušné MMP.
• Hemopexinová oblast − nezbytná pro štěpení kolagenů, zejména nativních fibrilárních kolagenů; důležitá pro substrátovou specifitu. MMP-23 má namísto hemopexinové domény unikátní cysteinovou doménu a imunoglobulinovou doménu; její propeptid naopak nemá cysteinový přepínač.
• Transmembránová oblast a GPI oblast – slouží k ukotvení MMP do buněčné membrány.

Regulace MMP

Proteolytická aktivita MMPs může být regulována na různých úrovních: na úrovni genové exprese, buněčné kompartmentalizace, konverzí zymogenu na aktivní enzym a konečně prostřednictvím specifických inhibitorů [4].

MMPs jsou syntetizovány jako pre-proMMPs; během translace je odštěpen signální peptid a vzniknou inaktivní proMMPs neboli zymogeny. Klíčovým krokem regulace aktivity MMPs je jejich extracelulární přeměna z neaktivního zymogenu na aktivní enzym. Děje se tak proteolytickým odstraněním prodomény pomocí endopeptidáz (např. jiných MMPs, serinových proteáz, plazminu či furinu). K aktivaci může také dojít prostřednictvím fyzikálně chemických dějů, které způsobí přerušení vazby cystein-Zn2+: teplo, nízké pH či chaotropické a další agens. Aktivované MMPs mohou vyvolat negativní zpětnou vazbu, např. prostřednictvím štěpení plazminogenu a znemožnění konverze plazminogenu na plazmin, a tím pádem blokaci aktivace dalších molekul MMPs.

Proenzymy a aktivní MMPs jsou dále regulovány specifickými stereochemickými vazbami tkáňových inhibitorů metaloproteináz (TIMPs) a nespecifickými proteázovými inhibitory jako α1-proteinázový inhibitor a α2-makroglobulin.

Funkce matrixových metaloproteináz v tumorogenezi

Matrixové metaloproteinázy se podílejí na invazivitě nádoru proteolýzou komponent extracelulární matrix. Jsou schopné rozložit všechny komponenty extracelulární matrix, pojivové tkáně a bazální membrány v bezprostředním okolí nádoru. Adheze mezi jednotlivými buňkami a extracelulární matrix je ve zdravé tkáni regulována a udržována v rovnováze, zatímco v nádorové tkáni je tento systém dysregulován. MMPs působí na receptorová místa na povrchu nádorových buněk, jako jsou integriny a E-cadherin, a tím rozrušují rovnováhu v adhezivitě mezi buňkami navzájem a buňkami a ECM. Tímto způsobem nejen usnadňují migraci nádorových buněk, ale rovněž ovlivňují celou řadu buněčných signálních drah [5]. Nedávné výzkumy [6,7] však dokazují, že funkce MMPs jsou mnohem komplexnější. MMPs jsou důležité pro vytvoření a udržení vhodného mikroprostředí, pro růst a angiogenezi jak primárního nádoru, tak i lokálních nebo vzdálených metastáz [7]. Děje specifické pro nádorové buňky, jako je nekontrolovaná angiogeneze či přeměna epitelových buněk v buňky mezenchymální, jsou provázeny zvýšenou expresí MMPs, která vede k poruše rovnováhy mezi MMPs a TIMPs v mikroprostředí kolem nádoru, což opět napomáhá jeho šíření [8]. Angiogenezi MMPs regulují pomocí aktivace vaskulárního endoteliálního růstového faktoru (VEGF), (MMPs-3,7,9). Zpočátku je overexprese MMPs v maligní tkáni inhibována zvýšením sekrece TIMPs, postupně však exprese MMPs nad sekrecí TIMPs převládne a dochází k dysregulaci. Během nekontrolovaného dělení a šíření nádorových buněk také dochází v místě nádoru k hypoxii a uvolňování více proangiogenních růstových faktorů a tím opět rychlejší angiogenezi [9].

Kromě výše uvedeného MMPs ovlivňují rovnováhu mezi prorůstovými faktory a faktory inhibujícími růst (např. aktivací receptoru epidermálního růstového faktoru (EGF) a modulací signální dráhy transformujícího růstového faktoru-β (TGF-β)), regulují indukci apoptózy prostřednictvím štěpení Fas ligandu (MMP-7), regulují zánětlivý proces (MMP-2,3,7,8,9,12), podílejí se na tvorbě metastatické „niche“ (MMP-3,9,10) a na lokální invazivitě nádoru (MMP-1,2,7,9,13,14) [10,11].

Funkce MMPs klíčových pro progresi nádoru spolu s jejich aktivitou a účinkem jsou uvedeny v Tab. 2.

Význam MMPs u nádorů gastrointestinálního traktu

Bylo zjištěno, že MMPs jsou exprimovány buňkami různých typů karcinomů včetně karcinomů gastrointestinálního traktu: dlaždicobuněčného karcinomu dutiny ústní [13], dlaždicobuněčného karcinomu a adenokarcinomu jícnu [14], karcinomu žaludku [15], karcinomu pankreatu [16] a hepatocelulárního karcinomu [17]. Studie, která měřila hladiny MMP-9 pomocí imunohistochemické analýzy u pacientů s refluxní ezofagitidou, prokázala jeho signifikantně zvýšené hladiny u pacientů s refluxní ezofagitidou, na jejímž podkladě se vyvinul tzv. Barettův jícen s dysplastickými změnami, z nichž poté vznikl adenokarcinom jícnu, v porovnání s pacienty s metaplazií v této oblasti, avšak bez dysplastických změn a následného vzniku karcinomu. Z tohoto lze usuzovat na souvislost mezi expresí MMPs a tumorogenezí a využít hladiny MMPs jako prediktivního faktoru pro riziko vzniku karcinomu na podkladě těchto typických zánětlivých změn v jícnu [18].

Studie ukázaly, že u kolorektálního karcinomu je zvýšená produkce MMPs i TIMPs [8,9]. Jde zejména o MMPs-1,2,7,13, ale nejsignifikantnější spojení s CRC vykazuje MMP-9. Imunohistochemická studie dokázala, že tkáňová exprese MMP-9 byla signifikantně vyšší u středně (G2) a špatně (G3) diferencovaných typů nádorů než u nádorů dobře diferencovaných (G1). Exprese MMP-9 jak z nádorových buněk, tak z buněk okolního stromatu je u těchto skupin (G2 a G3) extrémně zvýšená [19]. S těmito závěry se MMP-9 jeví jako vhodný nezávislý prognostický marker a mohl by být využíván k vyhledání pacientů s vysokým rizikem rekurence nádoru nebo jeho generalizace [20]. Zvýšená exprese MMP-9 úzce koreluje s hloubkou invaze tumoru, časností regionálních i vzdálených metastáz, a tím i s horší prognózou a kratším přežíváním pacientů ve stejném klinickém stadiu onemocnění než u pacientů, u kterých byly hladiny MMP-9 nízké [21]. Další studie studující hladiny MMPs ve zdravé tkáni v rozsahu 5−10 cm od nádoru prokázala, že pacienti se zvýšenou expresí zejména MMP-9 a MMP-2 v této lokalizaci měli vyšší rekurenci nádorového onemocnění a horší pětiletou prognózu než pacienti, u kterých byla exprese MMPs v okolní zdravé tkáni nízká [22].

Studie zaměřená na šíření nádoru a jeho generalizaci ukázala, že dysregulace MMPs a TIMPs ve zdravé tkáni hraje důležitou roli i v sekvenci adenom – karcinom, která je u kolorektálního karcinomu markantní [23]. V sekvenci „normální sliznice tlustého střeva – adenom (tubulární, vilózní) – LG dysplazie – HG dysplazie – adenokarcinom“ bylo pozorováno kontinuální zvyšování hladin MMP-2, MMP-9, TIMP-1 a TIMP-2 od hodnot zcela zanedbatelných u normální sliznice přes zvýšené hodnoty u LG adenomů až po extrémně vysoké hodnoty u HG dysplastických změn v adenomech a v adenokarcinomech. S tímto závěrem lze MMPs a TIMPs považovat za vhodné prognostické markery potenciálního vzniku CRC u pacientů, u nichž zatím nebyla prokázána malignita.

Diagnostická hodnota MMPs

Diagnostická senzitivita MMP-9 a TIMP-1 by u CRC podle výsledků různých studií mohla být vyšší než u konvenčně využívaných nádorových markerů (CEA, CA 19-9), když jsou tyto měřeny jako součást standardně nabíraných nádorových biomarkerů [24]. V nedávné studii Wilson et al. prokázali, že ze 748 zdravých pacientů bylo u 46 z nich pomocí měření hladiny MMP-9 zachyceno a poté kolonoskopicky a histologicky prokázáno onemocnění kolorektálním karcinomem [25]. Studie prováděná v Dánsku zaměřená na sledování hladiny CEA a TIMP-1, do které bylo zahrnuto 4509 pacientů podstupujících kolonoskopické vyšetření, prokázala, že hladiny CEA i TIMP-1 byly signifikantně vyšší u 184 pacientů, u nichž byl posléze diagnostikován CRC. Z toho se dá usuzovat o vhodnosti využití TIMP-1 jako nádorového marketu vhodného k brzké detekci CRC minimálně na úrovni srovnatelné s využíváním CEA [26].

V dnešní době se jako nejjednodušší a nejlevnější screeningová metoda pro CRC využívá test okultního krvácení ve stolici (TOK), ten však vykazuje vysoké falešně pozitivní i negativní výsledky. Oproti němu se dle náběrů prováděných ve Velké Británii jeví sledování hladin MMP-9 jako screeningová metoda s vyšší senzitivitou (77,9 %) i specificitou (77,1 %), a MMP-9 by tedy mohl být využíván jako biomarker v sekundárním screeningu u pacientů suspektních z onemocnění CRC, zvýšil by tak výtěžnost primární screeningové metody TOK a snížil počty falešně pozitivních výsledků [27].

Prognostická a prediktivní hodnota MMPs

Bylo zjištěno, že sérové hladiny MMP-2, MMP-7 a MMP-9 sledované ve studiích prováděných nezávisle na sobě na různých skupinách pacientů s kolorektálním karcinomem jsou signifikantně vyšší než u populace zdravé a než u pacientů s adenomem bez HG dysplazie [28]. Hladiny MMPs a TIMPs také korelují s klinickým stadiem stanoveným na základě TNM klasifikace. MMPs a TIMPs se ukázaly být vhodnými biomarkery jak pro sledování průběhu onemocnění, zjištění rizika rekurence nádoru nebo jeho generalizace, tak jako vhodné markery pro sledování v diagnostice a pro předpověď chování nádorového onemocnění v předoperačním období, které by teoreticky mohly ovlivnit rozhodnutí o rozsahu chystané operace [29]. Nedávná studie (Min et. al.) sledovala pacienty v pooperačním období a prokázala, že vysoké pooperační hodnoty TIMP-1 se vyskytovaly u pacientů s metastázami v játrech, proto by TIMP-1 mohlo sloužit v pooperačním období ke sledování možné rekurence a generalizace nádorového onemocnění [30].

Podle recentní studie (Boeckelman et al., 2018) (330 pacientů, follow up 13 let) vysoké hladiny MMP-8 a TIMP-1 korelovaly s horší prognózou. Naopak u MMP-9 nebyla korelace nalezena. K podobným výsledkům (vysoké hladiny MMP-8 – kratší přežití) došla studie Sirnio et al., 2018.

Sledování hladin TIMPs by mohlo být markerem predikce odpovědi pacienta na chemoterapii. Podle studie (Sorensen et al.), která zahrnovala 90 pacientů s metastatickým rozšířeným CRC, u nichž se v průběhu léčby měřila hladina TIMP-1 a CEA, se ukázalo, že sérové hladiny TIMP-1 v porovnání s CEA mnohem více korelují s odpovědí na léčbu, z hlediska doby do progrese nádorového onemocnění (time to progresion, TTP) a celkového přežití pacientů (overallsurvival, OS). Pacienti v této studii dostávali jako adjuvantní chemoterapii irinotecan, 5-florouracil (5-FU) a kyselinu listovou [31]. Jak již bylo zmíněno, TIMP-1 má antiapoptotický efekt, zvyšuje tedy rezistenci nádorových buněk k chemoterapii a mohl by být proto farmakologickým cílem. Tyto studie jsou však zatím v počátku, a je tudíž příliš brzy považovat je za směrodatné [32]. Jiná studie na pacientech ve III. stadiu CRC, u kterých byla proveditelná R0 resekce a kteří podstoupili 10 až 12 cyklů FOLFOX 6 chemoterapie, sledovala hladiny TIMP-1 a CEA se stejným závěrem, jak zmíněno výše. TIMP-1 hladina vykazovala mnohem větší dynamiku ve smyslu zvýšení sérových hladin TIMP-1 během prvních dvou cyklů a postupným poklesem až na normální hladiny po ukončení chemoterapeutické léčby v porovnání s ne příliš se měnící hladinou CEA v průběhu celé léčby. Vzhledem k tomuto nálezu by TIMP-1 mohlo sloužit k pozorování odpovědi na adjuvantní onkologickou léčbu u pacientů s CRC. Počáteční zvýšení hladin TIMP-1 je přisuzováno rozpadu velkého množství nádorových a okolních stromálních buněk obsahujících v cytoplazmě rozpustné TIMP-1, který v následujících cyklech není již tak velký. Druhá možná teorie vysvětlující tento počáteční nárůst hladiny TIMP-1 je zvýšené uvolňování TIMP-1 jako reakce na apoptózu nádorových buněk způsobenou podanou chemoterapií [33].

Stanovení MMPs v krevním séru a plazmě

V současnosti je pro stanovení cirkulujících matrixových metaloproteináz dostupná celá řada imunochemických metod, např. ELISA či SimplePlex, a multiplexové metody (technologie xMAP).

Studie hladin MMPs nejsou jednotné, pokud jde o používání krevního séra či plazmy, a tento fakt může mít vliv na nekonzistenci výsledků. Stanovení MMPs v séru bylo kritizováno, neboť matrixové metaloproteinázy jsou během procesu srážení krve uvolňovány z leukocytů, což způsobuje, že jejich koncentrace v séru je falešně pozitivní a ovlivněna dobou srážení. Jonsson et al. porovnávali hladiny MMPs v 65 vzorcích séra a citrátové plazmy a nalezli signifikantně vyšší (p<0,01) koncentrace všech studovaných MMPs (MMP-1,2,7,8,9) v séru oproti plazmě. Autoři doporučují, aby se pro stanovení cirkulujících MMPs namísto séra používala plazma, kde koncentrace MMPs není procesem srážení ovlivněna [34].

V jiné studii Jonsson et al. sledovali stabilitu MMP-9 ve vzorcích citrátové plazmy a extraktech tkání (nádorové i zdravé) při dlouhodobém skladování (9 let pro vzorky plazmy, 12 let pro vzorky tkání) při teplotě -80 ⁰C. Hladina MMP-9 v citrátové plazmě se po 9 letech signifikantně nelišila od původní koncentrace (medián 9,9 ng/ml vs. medián 9,7 ng/ml), zatímco v extraktu nádorových i zdravých tkání byla hladina po 12 letech signifikantně vyšší než původní (nádorová tkáň 89,9 ng/ml vs 133,5 ng/ml, p<0,01) [35]. Výsledky této studie jsou příznivé pro dlouhodobé uchovávání tekutých vzorků v biobankách biologických vzorků pro účely pozdějších výzkumů.

Závěr

Matrixové metaloproteinázy jsou nejdůležitějšími enzymy pro stabilitu extracelulární matrix a jsou klíčové pro mnoho fyziologických i patologických procesů včetně karcinogeneze. Na podkladě uvedených biochemických funkcí MMPs a výsledků studií (na zvířecích modelech i na skupinách pacientů) probíhajících paralelně po celém světě se předpokládá, že by cirkulující MMPs mohly být využívány jako diag­nostické či prognostické biomarkery u mnoha typů a klinických stadií různých nádorových onemocnění. Výsledky dosavadních studií však nejsou jednotné. Důležitým faktorem je zřejmě preanalytická fáze stanovení cirkulujících metaloproteináz, a to zejména povaha materiálu – sérum či plazma. Většina publikovaných studií uvádí stanovení MMPs v krevním séru, kde však hladiny mohou být ovlivněny procesem srážení, a tedy zatíženy chybou. Studie MMPs stanovovaných v krevní plazmě by podstatně přispěly ke znalostem, zda by mohly MMP soužit jako diagnostické či prognostické biomarkery a pomoci v klinickém rozhodování.

Konflikt zájmů

Autoři článku prohlašují, že nejsou v souvislosti se vznikem tohoto článku ve střetu zájmů a že tento článek nebyl publikován v žádném jiném časopise, s výjimkou kongresových abstrakt a doporučených postupů.

MUDr. Magda Čurillová,

CHIRO, FN Plzeň

e-mail: curillovam@fnplzen.cz