Přínos masivního paralelního sekvenování pro diagnostiku dědičných forem nádorů ovaria v České republice

Souhrn

Východiska: Karcinom ovaria, závažné nádorové onemocnění s vysokou mortalitou, je v České republice diagnostikováno každým rokem přibližně u 1 000 žen. Riziko vzniku onemocnění je zvýšeno u nosiček mutací v některých nádorových predispozičních genech. S vysokým relativním rizikem (RR > 5) jsou spojeny mutace v genech BRCA1, BRCA2, BRIP1, geny Lynchova syndromu, RAD51C, RAD51D, STK11; s možným zvýšením rizika mutace v genech ATM, CHEK2, NBN, PALB2, BARD1. Cílem práce bylo určit frekvenci mutací v nádorových predispozičních genech v naší populaci.

Metody a výsledky: Celkem 1 057 pacientek s karcinomem ovaria a 617 nenádorových kontrol bylo vyšetřeno pomocí panelového sekvenování nové generace na platformě Illumina. Patogenní mutace ve vysoko rizikových genech, vč. velkých genomových přestaveb, byly v našem souboru zachyceny u 30,6 % pacientek; u neselektovaných pacientek byla frekvence mutací téměř 25 %, u pacientek s negativní rodinnou anamnézou 18 %. Nejčastěji mutovanými predispozičními geny byly BRCA1 a BRCA2, součet frekvence mutací v ostatních ovariálních predispozičních genech odpovídal frekvenci mutací v genu BRCA2. Záchyt mutací u pacientek starších 70 let byl více než třikrát vyšší v porovnání s pacientkami ve věku pod 30 let.

Závěr: Karcinom ovaria je heterogenní onemocnění s vysokým podílem dědičné formy onemocnění. Vzhledem k nedostatku adekvátních screeningových modalit pro včasnou diagnostiku onemocnění je identifikace nosiček mutací v ovariálních predispozičních genech klíčová, s vysokým potenciálem k celkovému snížení mortality z důvodu karcinomu ovaria.

Klíčová slova:

karcinom ovaria – nádorové geny – mutace – masivní paralelní sekvenování – sekvenování nové generace – panel genů

Úvod

Karcinom ovaria patří mezi závažná nádorová onemocnění žen v ČR. Každým rokem je diagnostikován u přibližně 1 000 žen a zhruba 700 žen tomuto onemocnění podlehne [1]. Incidence ovariálního karcinomu stoupá s věkem a nejvyšší prevalence dosahuje mezi 6. a 7. dekádou. Celoživotní riziko rozvoje ovariálního karcinomu v běžné populaci se u žen pohybuje kolem 1,5 %, avšak je významně zvýšeno u nosiček zárodečných mutací v některých nádorových predispozičních genech.

Dědičná forma karcinomu ovaria představuje přibližně 20 % případů, tedy významně více než u jiných běžných typů nádorů. V současné době jsou proto ke genetickému vyšetření indikovány všechny pacientky s karcinomem ovaria (ale i vejcovodů a primárního peritoneálního karcinomu) bez ohledu na věk. Identifikace mutací predisponujících ke vzniku karcinomu ovaria umožňuje nabídnout nosičkám odpovídající léčebnou strategii a genetické poradenství a je podmínkou cílené preventivní péče o asymptomatické osoby s mutací.

Hlavními genetickými faktory dědičné formy karcinomu ovaria jsou, podobně jako u hereditární formy karcinomu prsu, mutace v genech BRCA1 a BRCA2. Celoživotní riziko rozvoje karcinomu ovaria se pohybuje u nosiček mutací v genu BRCA1 mezi 35–60 %, u nosiček mutací v BRCA2 mezi 12–25 % [2,3]. Ačkoliv je klinický význam mutací v BRCA1/2 vysoký, nevysvětluje všechny případy familiárních forem onemocnění. Zvýšené riziko vzniku karcinomu ovaria bylo prokázáno i u nosiček mutací v dalších genech kódujících proteiny, které se podobně jako BRCA1 a BRCA2 podílejí na reparaci dvouřetězcových zlomů DNA cestou homologní rekombinace. V současné době existují klinická doporučení zohledňující zvýšené riziko vzniku karcinomu ovaria u nosiček mutací v 10 genech (BRCA1, BRCA2, BRIP1, EPCAM, MSH2, MLH1, MSH6, RAD51C, RAD51D, STK11) a zvýšené riziko vzniku karcinomu prsu pro 12 genů (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, CDH1, CHEK2, NBN, NF1, PALB2, PTEN, STK11, TP53) [4].

V porovnání s četností mutací v genech BRCA1/2 je frekvence mutací v dalších predispozičních genech výrazně (často řádově) nižší a významně se liší mezi populacemi. Postupná analýza jednotlivých genů je z důvodu značné finanční a časové náročnosti v praxi nepoužitelná. K dramatické změně možností diagnostiky došlo s rozvojem sekvenování nové generace (next generation sequencing – NGS), jež umožnilo vyšetření většího počtu genů v krátké době při příznivých ekonomických nákladech [5].

Pro diagnostické účely identifikace nádorové predispozice jsme zkonstruovali a validovali univerzální panel CZECANCA (CZEch CAncer paNel for Clinical Application) [6] pro komplexní, rentabilní a rychlou analýzu germinálních mutací vč. velkých přestaveb v hlavních predispozičních genech, ale i v kandidátních genech asociovaných se zvýšeným rizikem vzniku nejčastějších solidních nádorů v naší populaci [7].

Metody

Pomocí panelu CZECANCA v1.0, který obsahuje sondy cílící na kódující sekvence 219 genů, jsme analyzovali 1 057 pacientek s karcinomem ovaria. Analýza probíhala v laboratořích Ústavu biochemie a experimentální onkologie 1. LF UK v Praze, Masarykova onkologického ústavu v Brně, v laboratořích Gennet v Praze a Agel v Novém Jičíně. Medián věku v době diagnózy byl 52,6 roku (14,8–86,2). Klinické charakteristiky pacientek jsou uvedeny v tab. 1.

Abychom mohli odlišit vzácné patogenní a populačně specifické mutace, vyšetřili jsme pomocí stejného panelu genů skupinu 617 zdravých kontrol (jedinci starší 60 let bez osobní a rodinné nádorové anamnézy u přímých příbuzných).

Vzorky genomové DNA izolované z leukocytů periferní krve od pacientů indikovaných ke genetickému vyšetření byly analyzovány podle jednotného protokolu, který zahrnoval i následné bioinformatické zpracování dat [6].

Identifikované zárodečné varianty v genech spojených se syndromem dědičného karcinomu prsu a ovaria byly prioritizovány na základě frekvence výskytu varianty u méně než 1 % vzorků v projektu 1 000 Genomes [8] a současně u méně než 1 % vzorků našich populačních kontrol. Zbývající raritní varianty byly klasifikovány do 5 tříd dle IARC (International Agency for Research on Cancer): 1 – benigní, 2 – pravděpodobně benigní, 3 – varianta nejasného významu (variant of unknown signifikance – VUS), 4 – pravděpodobně patogenní, 5 – patogenní. Jako patogenní nebo pravděpodobně patogenní byly dle doporučení ENIGMA (Evidence-based Network for the Interpretation of Germline Mutant Alleles) konsorcia [9] označeny varianty vedoucí k předčasnému zkrácení proteinu (nonsense a posunové mutace, velké genomové přestavby, pokud nejsou klasifikovány jinak), mutace postihující konzervativní sestřihová místa a missense mutace klasifikované jako patogenní v databázi ClinVar [10].

V analyzovaném souboru jsme se zaměřili na hodnocení prokazatelně patogenních alterací v genech, ke kterým v současnosti existují klinická doporučení péče o nosičky mutací zohledňující riziko vzniku karcinomu ovaria (BRCA1, BRCA2, BRIP1, EPCAM, MSH2, MLH1, MSH6, RAD51C, RAD51D, STK11) a prsu (ATM, BARD1, CHEK2, NBN, PALB2) [4].

Výsledky

Mutace v genech predisponujících ke vzniku dědičné formy karcinomu ovaria (BRCA1, BRCA2, BRIP1, EPCAM, MSH2, MLH1, MSH6, RAD51C, RAD51D, STK11)

Patogenní dědičnou mutaci v některém z genů predisponujících ke karcinomu ovaria jsme identifikovali celkem u 323 z 1 057 (30,6 %) analyzovaných pacientek s karcinomem ovaria (tab. 2). Nejvíce patogenních mutací jsme zachytili v hlavních predispozičních genech BRCA1 (210/1 057; 19,9 %) a BRCA2 (75/1 057; 7,1 %). Mutace v genech způsobujících Lynchův syndrom byly nalezeny u 9 z 1 057 (0,9 %) pacientek. Zbývající 3 % nalezených mutací se rovnoměrně rozdělila mezi 29 nosiček mutací v genech RAD51C, RAD51D, BRIP1. Ve skupině kontrol byly v uvedených genech s prokázanou asociací s karcinomem ovaria zachyceny patogenní mutace pouze u 4 z 617 osob (0,7 %; tab. 2).

Klinické a histopatologické charakteristiky ovlivňující pravděpodobnost výskytu germinálních mutací

S ohledem na osobní onkologickou anamnézu (tab. 3) je nejvyšší pravděpodobnost výskytu mutací u pacientek s duplicitou karcinomu prsu a ovaria, kde mutaci nacházíme u téměř dvou třetin vyšetřovaných (107/180; 59,4 %). U čtvrtiny vyšetřovaných se dědičné mutace vyskytovaly u pacientek se solitární diagnózou karcinomu ovaria (203/817; 24,8 %) nebo u pacientek, které kromě karcinomu ovaria vyvinuly i jiné nádorové onemocnění (15/60; 25,0 %). Mutace v genech RAD51C, RAD51D a BRIP1 převažovaly u pacientek s diagnózou solitárního ovariálního karcinomu (25/29; 86 %).

Vzhledem k rodinné anamnéze (tab. 3) jsme nalezli nejvyšší procento mutací u pacientek z rodin, ve kterých se vyskytoval pouze karcinom ovaria (55/102; 53,9 %), přičemž mutace téměř výhradně postihovaly geny BRCA1 (43/55; 78 %) a BRCA2 (10/55; 18 %). Vysoký výskyt mutací v predispozičních genech jsme zaznamenali i u pacientek s rodinným výskytem karcinomu ovaria a prsu (129/288; 44,8 %) a u pacientek s rodinným výskytem karcinomu ovaria a dalších typů nádorů (45/143; 31,5 %). Mutace však byla zachycena i u 18,2 % pacientek s negativní rodinnou anamnézou (90/495), což ve výsledku znamená, že tato skupina zahrnovala více než čtvrtinu nosiček patogenních mutací (90/323; 27,9 %).

Zastoupení histologických typů ovariálních tumorů u nosiček mutací v predispozičních genech ukazuje, že serózní nádory tvoří přibližně dvě třetiny ovariálních karcinomů ve skupinách nosiček s mutacemi v genech predisponujících ke vzniku hereditárního karcinomu ovaria (graf 1). Výjimkou byla malá skupina devíti nosiček mutací v genech Lynchova syndromu, ve které jsme zaznamenali vyšší zastoupení endometroidních nádorů a nádorů ze světlých buněk.

Nejnižší průměrný věk v době diagnózy karcinomu ovaria byl u nosiček vzácných mutací v genu MSH2 (42,2 roku), následovaly geny RAD51C (49,2 roku), MLH1 (49,9 roku), BRCA1 (50,3 roku), RAD51D (53,9 roku), BRIP1 (54,4 roku), BRCA2 (57,6 roku) a MSH6 (62,0 roku). Výskyt patogenních mutací v uvedených genech byl překvapivě více než trojnásobný u pacientek starších 70 let (14/68; 21,0 %) v porovnání s pacientkami mladšími 30 let (4/75; 6,7 %; p = 0,01).

Mutace v genech predisponujících ke vzniku dědičné formy karcinomu prsu (ATM, BARD1, CHEK2, NBN, PALB2)

V dalších genech, jejichž mutace jsou spojeny se zvýšeným rizikem vzniku karcinomu prsu a kde bychom mohli předpokládat rovněž zvýšení rizika rozvoje karcinomu ovaria, jsme zachytili patogenní mutace celkem u 36/1 057 (3,4 %) pacientek a 7/617 (1,1 %) kontrol (celkem p = 0,0037; tab. 4).

Nejvyšší frekvence mutací v těchto genech jsme nalezli ve skupině pacientek s diagnózou karcinomu prsu a ovaria v osobní anamnéze (11/180; 6,1 %) a u pacientek z rodin s výskytem pouze karcinomu ovaria (6/102; 5,9 %) (tab. 3). Nejnižší věk v době diagnózy karcinomu ovaria byl u pacientek s mutacemi v genu CHEK2 (41,8 roku), následován geny ATM (49,6 roku), NBN (51,1 roku), BARD1 (54,7 roku) a PALB2 (61,4 roku).

V dalších genech spojovaných se syndromem dědičného karcinomu prsu a ovaria – NF1, PTEN, STK11, TP53, CDH1 – jsme v našem souboru nezachytili žádnou patogenní alteraci.

Více než jedna patogenní mutace v genech spojených se syndromem dědičného karcinomu prsu a ovaria byla nalezena u 7 pacientek (0,66 %, což zahrnovalo heterozygotní nosičky mutací v BRCA1 a BRCA2 (2×), BRCA1 a NBN (2×), BRCA1 a CHEK2, BRCA1 a ATM, BRCA1 a MLH1).

Diskuze a závěr

Rozvoj NGS umožňuje paralelní analýzu germinálních mutací řady nádorových predispozičních genů. U karcinomu ovaria jsou s prokázaným vysokým rizikem onemocnění (relativní riziko (RR) > 5) v současné době spojeny mutace v genech BRCA1, BRCA2, BRIP1, RAD51C, RAD51D, STK11, MSH2 a MLH1. Analýza může být provedena zároveň u několika desítek pacientů, což vede ke zrychlení diagnostického procesu. Vyšetření rozsáhlých populací indikovaných pacientů umožňuje získat dostatečné informace o frekvenci výskytu příčinných mutací v populaci, které jsou nezbytným předpokladem k postupnému zpřesňování rizik spojených se vznikem dědičných nádorů u nosičů mutací v nádorových predispozičních genech. Výskyt mutací v některých nově identifikovaných predispozičních genech (BRIP1, RAD51C, RAD51D a geny Lynchova syndromu) je však velmi vzácný a k vyhodnocení jejich podílu na vzniku karcinomu ovaria je nezbytná spolupráce diagnostických týmů v ČR i zahraničí. Na základě takto získaných poznatků se dynamicky vyvíjejí nejen indikační kritéria ke genetickému vyšetření, ale i klinická doporučení péče o nosiče patogenních mutací [11].

Z provedených analýz u pacientek s ovariálním karcinomem v ČR vyplývá, že mezi nosiči příčinných mutací v genech s jasně prokázanou asociací se zvýšeným rizikem vzniku ovariálního karcinomu dominují nosičky mutací BRCA1 a BRCA2 (88 %). Zbývajících nezanedbatelných 12 % případů v naší populaci představují nosičky mutací v dalších ovariálních predispozičních genech (BRIP1, RAD51C, RAD51D a geny Lynchova syndromu). Z výsledků naší analýzy vyplývají určitá populační specifika v zastoupení mutací v těchto nových predispozičních genech v ČR. Zatímco v naší populaci bylo zastoupení mutací v těchto genech rovnoměrné, práce Norquista et al (USA) popisuje dvojnásobnou frekvenci mutací v genu BRIP1 (26/1 915; 1,3 %) v porovnání s četností mutací v genech RAD51C a RAD51D (každý 11/1 915; 0,6 %) [12]. V německé populaci byla popsána frekvence mutací v genu BRIP1 u pacientek s karcinomem ovaria dokonce 2,6 %, přestože v této studii nebyly hodnoceny velké genomové přestavby [13]. Ve skupině genů spojených s Lynchovým syndromem jsme nejvíce mutací nalezli v genu MLH1 (gen PMS2 nebyl vyšetřován), podobně jako je tomu u pacientů s kolorektálním karcinomem, zatímco v některých pracích jsou u pacientek s karcinomem ovaria popisovány mutace především v genu MSH6 a PMS2 [12]. Porovnání výsledků našich analýz s výsledky zahraničních studií však komplikuje skutečnost, že některé studie neanalyzují přítomnost velkých genomových přestaveb v zárodečném genomu, protože jejich identifikace pomocí NGS může být obtížná. V naší práci jsme tyto důležité (a v případě delecí v naprosté většině i patogenní) genetické aberace potvrdili z vyšetření CZECANCA panelem, který byl optimalizován na detekci velkých přestaveb [6], u 3,1 % (33/1 057) pacientek, a to v genech BRCA1 (22), BRIP1 (4), MLH1 (2), CHEK2 (4) a PALB2 (1). V genu BRIP1 představovaly rozsáhlé delece dokonce polovinu všech nalezených mutací. Četnost velkých genomových přestaveb ukazuje, že jejich analýza musí být nepostradatelnou součástí genetického testování nádorových predispozičních genů.

Podíl alterací v dalších kandidátních predispozičních genech s možným podílem na vzniku karcinomu ovaria (ATM, BARD1, CHEK2, NBN, PALB2) je srovnatelný s celkovou frekvencí mutací v genech BRIP1, RAD51C, RAD51D a genů Lynchova syndromu.

Záchyt sedmi vícenásobných nosičů patogenních variant v našem souboru ukazuje důležitost genetické konzultace a v indikovaných případech opodstatňuje nové testování pacientek pomocí NGS (u probandů z rodin se závažnou rodinnou onkologickou anamnézou či u pacientek s nádorovými multiplicitami negativně testovaných dříve použitými metodami). Genetická konzultace a následné vyšetření hlavních predispozičních genů jsou indikovány dle současných kritérií pro každou pacientku s karcinomem ovaria, bez ohledu na věk, osobní či rodinnou anamnézu či histologický typ nádoru. Toto doporučení podporují i výsledky naší práce, která analyzuje 1 057 pacientek s karcinomem ovaria, což přibližně odpovídá roční incidenci tohoto onemocnění v ČR (998 případů v roce 2016). Patogenní mutace v genech s jasným klinickým významem pro karcinom ovaria jsme zachytili u 323/1 057 (30,6 %) vyšetřovaných pacientek. Srovnatelnou frekvenci mutací (24 %) popsal Walsh et al [14], avšak v některých studiích byla nalezená frekvence mutací v ovariálních predispozičních genech značně nižší (např. Carter et al 13 %) [15]. Rozdíly ve frekvenci mutací u pacientek s karcinomem ovaria mezi jednotlivými pracemi ilustrují nejen odlišnosti ve výskytu patogenních mutací mezi populacemi, ale i ve výběru analyzovaných pacientek, vyšetřovaných predispozičních genů či typu hodnocených mutací. Náš soubor byl obohacen o mladé pacientky a pacientky s pozitivní rodinnou anamnézou. Zatímco frekvence mutací u nemocných před rokem 2010 přesahovala 40 %, po rozšíření indikačních kritérií v roce 2015 [16–19] bylo u 334 pacientek analyzovaných na 1. LF UK zachyceno 83 nosiček mutací (25 %). U neselektovaných, prospektivně testovaných vzorků analyzovaných ve spolupracujících laboratořích zahrnutých v našem souboru pacientek byly zachyceny patogenní mutace u 33/156 (21,2 %) nemocných. Lze tedy obecně konstatovat, že přibližně každá čtvrtá pacientka s karcinomem ovaria v naší populaci je nosičkou patogenní mutace v klinicky významném genu s prokázaným vysokým rizikem vzniku ovariálního karcinomu. U pacientek s negativní rodinnou anamnézou je to přibližně každá pátá. Vysoký podíl pacientek s karcinomem ovaria s hereditární formou onemocnění se do budoucna díky identifikaci mutací v dalších genech s predispozicí ke karcinomu ovaria patrně ještě mírně zvýší. Frekvence mutací je u pacientek starších 70 let více než třikrát vyšší v porovnání s velmi mladými pacientkami (s diagnózou ve věku pod 30 let). Nižší frekvenci patogenních mutací u velmi mladých pacientek lze částečně vysvětlit vyšším zastoupením histologických typů, především low-grade serózních a mucinózních karcinomů, pro které je typická nižší frekvence mutací v predisponujících genech, zatímco u pacientek starších 70 let převažovaly high-grade serózní karcinomy. Přesto byla nízká frekvence mutací ve sledovaných predispozičních genech u velmi mladých pacientek překvapivá a ukazuje na možnou úlohu dalších genů při vzniku onemocnění.

Vzhledem k omezeným možnostem časné diagnostiky karcinomu ovaria je pro nosičky mutací v genech spojených s vysokým rizikem onemocnění (RR > 5) doporučena preventivní salpingooforektomie (risk-reducing salpingo-ophorectomy – RRSO). RRSO je spojena s řadou vedlejších účinků, proto je nutné její vhodné načasování, které se odvíjí od průměrného věku v době diagnózy u nosiček mutací či podle věku onemocnění v rodině (tab. 5). S ohledem na frekvenci mutací v genech vysokého rizika u pacientek s ovariálním karcinomem v ČR může racionální indikace RRSO přispět ke snížení mortality z důvodu karcinomu ovaria v ČR.

Serózní adenokarcinomy představují 60–80 % ze všech histopatologických typů ovariálních tumorů [20]. V našem souboru jsme high-grade serózní karcinom ovaria nalezli u dvou třetin pacientek s identifikovanou zárodečnou mutací v některém z ovariálních predispozičních genů, s výjimkou genů Lynchova syndromu. Frekvence mutací u žen s nádory jiného histologického typu však byla také významná a opodstatňuje genetické testování bez ohledu na histologický typ nádoru.

Se vzrůstajícím množstvím poznatků o nádorové predispozici se rozšiřuje spektrum klinicky relevantních genů. Použití větších panelů genů v rutinní diagnostické praxi umožňuje nejen pružně reagovat na rostoucí požadavky onkologů a klinických genetiků, ale v případě rozšíření počtu genů s klinickou utilitou umožňuje vyhodnotit tyto geny zpětně bez nutnosti nového sekvenování, a tedy dodatečných finančních nákladů. Identifikace hereditárních alterací v genech BRCA1 a BRCA2 (a pravděpodobně i dalších predispozičních genech, jejichž proteinové produkty se spolupodílejí na reparaci genomové DNA) umožňuje využít genetické analýzy jako prognostického ukazatele pro konvenční chemoterapii (genotoxickými chemoterapeutiky) i cílenou a specifickou léčbu (PARP inhibitory) [21].

Tato práce byla podpořena grantem AZV 15-27695A, SVV2019/260367, PROGRES Q28/LF1.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

RNDr. Jana Soukupová, Ph.D.

Ústav biochemie a experimentální onkologie

1. LF UK v Praze

U Nemocnice 5

128 53 Praha 2

e-mail: jproko@lf1.cuni.cz

Obdrženo: 7. 3. 2019

Přijato: 24. 4. 2019