Cirkulující nádorová DNA v krvi a její využití jako potenciálního bio­markeru nádorových onemocnění

Souhrn

Nalezení dostatečně citlivé metody pro detekci a monitorování onkologických onemocnění, která by zároveň nepředstavovala zbytečnou zátěž pro pacienta, je dlouholetou výzvou v nádorové diagnostice. Ideálním cílem jsou neinvazivní biomarkery –  biologické molekuly, které by bylo možné detekovat z krve, a které by podaly co nejpřesnější obraz o stavu a vývoji onemocnění. V podstatě všechny typy nádorových buněk obsahují somatické mutace, které jim umožňují neregulovaně růst a vyvíjet se. Tyto mutace jsou přítomny pouze v DNA nádorových buněk a představují tedy vhodný biomarker. Genotypizace nádorových tkání se stává v klinické onkologii běžným postupem, má však své limity. Biopsie tkáně podává informaci jen o velmi malé lokalitě nádoru v konkrétním čase odběru a v některých případech je obtížné nebo téměř nemožné vzorek vůbec odebrat. Navíc, jako každá invazivní metoda, představuje zátěž pro pacienty. Řešením by se mohla stát analýza cirkulující nádorové DNA odebrané přímo z krve –  tzv. tekuté biopsie. Umírající nádorové buňky uvolňují fragmenty své DNA do krevního oběhu, odkud mohou být izolovány, a díky novým citlivým a přesným metodám podrobeny analýze genomových změn. Tyto změny se navíc v čase vyvíjejí, protože nádorové onemocnění je charakterizováno postupnou evolucí a schopností selektovat nové mutace přinášející růstové výhody či rezistenci k aplikované léčbě. Nezachycení těchto změn je přitom častou příčinou neúspěchu léčby. Současné technologické pokroky v detekci a charakterizaci cirkulující nádorové DNA by mohly umožnit monitorování vývoje nádoru v reálném čase a stát se vodítkem pro včasné a přesné rozhodnutí o nejvhodnější léčbě.

Klíčová slova:
cirkulující nádorová DNA – nádorové biomarkery – biopsie – tekutá biopsie – krev – mutace

Úvod

Biomarkery využívané v současné době při dia­gnostice a monitorování odpovědi na léčbu jsou většinou proteiny, jejichž hladina v krvi může být snadno detekována a změna exprese je spojena s určitým typem nádorového onemocnění. V poslední době se však díky rozvoji citlivějších technologií detekce stává také DNA cirkulující v krevním oběhu alternativním zdrojem informací o nádorovém onemocnění.

První nález DNA cirkulující v lidské krvi byl popsán již v roce 1948 [1] a její zvýšená hladina v krvi onkologických pa­cientů potom o 29 let později [2]. V roce 1994 se u pa­cientů trpících mye­lodysplastickým syndromem nebo akutní myelogenní leukemií poprvé podařilo prokázat, že tato DNA obsahuje mutace typické pro nádorové buňky, konkrétně mutovaný gen N‑ ras [3]. DNA vyskytující se v krvi je souhrnně označována jako cell‑free DNA (cfDNA), cirkulující nádorová DNA potom konkrétně ctDNA (circulating tumor DNA). V krvi zdravých jedinců byla detekována cfDNA v průměrné koncentraci 13 ng/ ml, zatímco u pa­cientů s různými typy rakoviny dosahovala průměrné koncentrace 180 ng/ ml [2]. Fragmenty DNA detekovatelné v krvi mohou být velmi krátké (70– 200 bp) nebo dlouhé až 21 kb, za jejich původce byly proto považovány apoptotické či nekrotické buňky [4]. Ně­kte­ré studie navíc naznačují i možnost, že je cfDNA buňkami aktivně sekretována [5]. Zbytky mrtvých buněk a jejich DNA jsou běžně odstraňovány buňkami imunitního systému, např. makrofágy. Přesto ale v krvi zůstává v mnoha případech dostatečné množství genetického materiálu umožňujícího analýzu, obzvláště u pa­cientů s rozvinutým nádorovým onemocněním v pozdějších stadiích (obr. 1). V těchto případech může být nádorová DNA dokonce převažujícím typem DNA detekovatelné v krvi. Množství detekovatelné ctDNA se liší také v závislosti na typu nádorového onemocnění. Její podíl může např. představovat přibližně 0,01– 5 % cfDNA u melanomu [6], méně než 1 % u nemetastazujících kolorektálních nádorů nebo naopak převažujícím typem DNA v plazmě u rozvinutých metastazujících nádorů [7]. Poměr cfDNA/ ctDNA se liší také v průběhu léčby, jak je detailně ukázáno na příkladu rakoviny žaludku [8]. ctDNA se může stát přesným dia­gnostickým nástrojem, protože při její analýze jsou určeny konkrétní genetické a epigenetické změny. Tyto změny zahrnují mutace v DNA, ztrátu heterozygozity, integraci virových genomů, hypermetylaci tumor‑ supresorových genů či změny v mitochondriální DNA [9]. Navíc je životnost ctDNA v krevním oběhu mnohem kratší než u proteinů (řádově jen několik hodin), takže podává i přesnější obraz o momentálním stavu a vývoji onemocnění [10].

V tomto přehledovém článku shrneme výhody a nevýhody dia­gnostiky založené na detekci ctDNA, příklady, kdy byla úspěšně využita při monitorování nebo dia­gnostice nádorových onemocnění a metodiku, která je k detekci ctDNA používána.

Tkáňová vs. tekutá bio­psie

Biopsie a histologické vyšetření tkáně jsou ústředním postupem při dia­gnostice (nejen) nádorových onemocnění. Její limity ale velmi dobře ukázala nedávná studie heterogenity nádorových tkání, konkrétně nádoru ledvin. Po provedení sekvenace DNA získané odběrem vzorků tkáně z různých oblastí téhož nádoru vědci zjistili, že genetická diverzita je větší, než se dosud předpokládalo. Pouze třetina mutací byla shodná ve všech odebraných vzorcích, jinak se od sebe části nádoru podstatně lišily a ještě větší odlišnosti pak vykazovaly sekundární nádory v jiných částech těla pa­cienta [11]. Při provedení jediné bio­psie je tedy pravděpodobné, že vzorek zdaleka nepostihne všechny podstatné mutace, které mohou ovlivňovat odpověď na léčbu a prognózu onemocnění. Biopsie jsou však invazivní a potenciálně rizikové, mnohdy i obtížně proveditelné v případě nedostupných nebo křehkých tkání, jako jsou např. plíce. Navíc opakované provádění tkáňových bio­psií je pro pa­cienty náročné, a proto jsou lékaři ve své dia­gnostice a plánování léčby často odkázáni na informace, které rychle zastarávají v kontextu toho, jak se nádor dále vyvíjí.

Nadějnou alternativou se tedy stávají tzv. tekuté bio­psie –  odběry krve, z níž lze izolovat ctDNA či sekretované proteiny. V klinické praxi je detekce proteinových markerů v krvi běžně používána při dia­gnostice rakoviny prostaty (prostate‑ specific antigen –  PSA), jater (α‑ fetoprotein), střeva (carcinoembryonic antigen –  CEA), prsu (CA 15.3, cancer antigen) [12] a dalších. V ně­kte­rých případech však dia­gnóza založená na těchto markerech vede k falešně pozitivním nálezům, protože jejich hladina v krvi může být zvýšena i z jiných důvodů [13]. U většiny nádorů navíc nejsou známy žádné vhodné sekretované proteinové bio­markery, které by bylo možno stanovovat přímo z krevních odběrů.

U většiny pa­cientů však lze v krvi detekovat ctDNA a pomocí stále přesnějších technik zaměřených na analýzu DNA sestavovat důkladnější obraz mutačních změn v nádorových buňkách, než by umožnila tkáňová bio­psie. Protože odběr krve lze provádět v podstatě kdykoliv, otevírá se možnost rychlého testování, zda je zvolená léčba vhodná či zda nedošlo v důsledku terapie k selekci a dalšímu růstu rezistentní populace nádorových buněk. Nevýhodou prozatím zůstává to, že jde o metodu novou a zaváděnou, takže dosud publikované studie jsou provedeny na poměrně malém počtu pa­cientů a jen u ně­kte­rých typů nádorů. Hladina ctDNA v krvi se liší případ od případu a může být obtížně detekovatelná, obzvlášť u malých nádorů v raných stadiích. Metody pro zpřesnění detekce i malého množství ctDNA se ale stále vyvíjejí a jsou čím dál citlivější, takže lze očekávat, že se tento dia­gnostický postup časem stane běžným a pro pa­cienty přínosným.

Využití ctDNA při dia­gnostice a monitorování nádorových onemocnění

DNA obsahující somatické mutace je vysoce specifická po nádorové buňky, a může se tedy stát optimálním markerem. V solidních nádorech, jako jsou např. kolorektální či prsní tumory, bylo zjištěno až 80 mutovaných genů, které jsou detekovatelné prakticky v každé nádorové buňce, ale nejsou přítomny v DNA zdravých buněk [14].

Velmi obsáhlý vzorek pa­cientů byl analyzován skupinou dr. Diaze [7]. Technologií založenou na digitální PCR (polymerace chain reaction) zhodnotili využitelnost ctDNA k detekci nádorů u 640 pa­cientů s různými typy rakoviny. Detekovatelnou hladinu ctDNA zachytili u > 75 % pa­cientů s rozvinutou rakovinou hlavy a krku, močového měchýře, slinivky, vaječníku, prsu, melanomu, hepatocelulárních buněk, ale u < 50 % pa­cientů s nádorem v mozku, ledvinách, prostatě nebo thyroidních buňkách. To ukazuje, že množství ctDNA není závislé jen na stupni rozvinutosti nádorového onemocnění, ale i na tom, v jaké tkáni se vyskytuje. Po srovnání hladiny ctDNA a cirkulujících nádorových buněk v této studii se také mj. ukázalo, že tyto dva ukazatele jsou vzájemně nezávislé a že cirkulující nádorové buňky nejsou hlavním zdrojem ctDNA [7].

Modifikace metody zvané BEAMing(beads, emulsion, amplification and magnetics) zvýšila citlivost detekce ctDNA a umožnila studii na 18 pa­cientech s rakovinou střeva. Hladina ctDNA byla sledována po operaci, kdy poklesla o 99 %, ale v mnoha případech nezmizela zcela. V případech, kdy zůstala ctDNA detekovatelná i po chirurgickém odstranění nádoru, došlo až na jednu výjimku k relapsu onemocnění. Naopak návrat onemocnění nebyl zaznamenán u žádného pa­cienta, u kterého nebyla ctDNA detekována [15]. Tento výsledek ukázal, že ctDNA může indikovat, zda bude pa­cient po chirurgickém odstranění nádoru potřebovat i následnou chemoterapii.

Studie srovnávající citlivost proteinových markerů CEA a CA19- 9 s metodou založenou na analýze ctDNA byla provedena u sedmi pa­cientů s kolorektálním karcinomem. V DNA izolované z krve bylo detekováno několik nejčastěji mutovaných genů (APC, KRAS, TP53, PIK3CA a BRAF). Hladina ctDNA byla sledována po operaci v několika časových intervalech, vždy úzce korelovala s aktuálním klinickým stavem pa­cienta a projevila se jako univerzálnější marker pro monitorování klinického vývoje nemoci než běžně používané CEA a CA19- 9 [16].

Na signální dráhy KRAS, BRAF, EGFR a TP53 je zacíleno mnoho chemoterapeutik [17,18]. Pro predikci léčebné odpovědi je tedy důležité znát a průběžně monitorovat případný vznik mutací v těchto genech a sledovat tak evoluci v genomu nádorových buněk způsobenou selekčním tlakem chemoterapeutik [19]. U kolorektálních nádorů s nemutovaným KRAS se často indikuje léčba cílená na EGFR, ale téměř vždy se během několika měsíců objeví rezistence k této terapii. Analýza ctDNA 24 pa­cientů ukázala, že během 5– 6 měsíců od zahájení léčby byla u devíti pa­cientů, jejichž nádorové onemocnění bylo původně wild-type KRAS, detekována mutace v tomto genu, a tedy že lze metodu monitorování ctDNA využít k predikci odpovědi na léčbu [20]. Podobně, detekce EGFR mutací v ctDNA může být využita k předpovědi vývoje onemocnění a rezistence k chemoterapii u pa­cientů s rakovinou plic. Ve studii provedené Mackem et al byl analyzován efekt aktivujících mutací v genu pro EGFR detekovaných v ctDNA u nemalobuněčných nádorů plic. U všech pa­cientů (6 ze 49), u kterých byl tento typ mutace detekován, byl pozorován prodloužený medián OS [21].

Při analýze ctDNA u pa­cientek s rakovinou prsu, založené na detekci PIK3CA mutace, byla tato ctDNA v krvi nalezena pouze u rozvinutějších metastatických stadií onemocnění, ale v žádném z 30 vzorků s dia­gnostikovaným lokalizovaným nádorem. Tento výsledek naznačuje, že ctDNA‑ PIK3CA detekce je využitelná až u pokročilejších stadií nemoci [22]. Podobně se analýza mutací v genech TP53, PIK3CA, PTEN, AKT1, IDH2 a SMAD4 v ctDNA z plazmy osvědčila jako rovnocenná metoda s tkáňovou bio­psií ve studii srovnávající vzorky 17 pa­cientek s metastatickými karcinomy prsu [23]. Rovněž u nemalobuněčného karcinomu plic se metodika založená na sekvenaci ctDNA osvědčila jako slibná neinvazivní metoda. Hladina ctDNA v plazmě u 13 pa­cientů korelovala s velikostí nádoru a ukázala se být citlivější při vyhodnocování brzké odpovědi na léčbu v porovnání s konvenčním radiografickým přístupem [24]. U pa­cientů s metastatickým melanomem (studie zahrnující 12 pa­cientů) byly v ctDNA detekovány mutace v genech BRAF, cKIT, NRAS a TERT. Hladina ctDNA korelovala s klinickými a radiologickými výsledky a v jednom případě její snížení předcházelo pozdější regresi nádoru [6]. Přehled studií detekujících ctDNA u pa­cientů s různými typy nádorů je shrnut v tab. 1.

Metodika

Pro širší využití a zavedení testování ctDNA do klinické praxe je potřeba nastavit metodiku uchování a zpracování krevních vzorků, stejně jako zvolit nejvhodnější metodu pro následnou detekci a analýzu ctDNA. DNA může být izolována z plazmy nebo séra, přičemž je potřeba při zpracování vzorků zabránit popraskání membrány krevních buněk a kontaminaci jejich DNA. Plazma je preferována před sérem právě díky nižší pravděpodobnosti kontaminace DNA z bílých krvinek, navíc koncentrace cfDNA v čerstvé plazmě, ač nižší než v séru, přesněji odpovídá koncentraci cfDNA v krevním oběhu [25,26]. cfDNA z ní může být izolována pomocí komerčně dostupných kitů. cfDNA pocházející z nádorových i nenádorových buněk může být kvantifikována pomocí PCR v reálném čase (qPCR) založené na amplifikaci ALU sekvencí nebo jiných markerů (β‑ globin, β‑ actin) [27]. Protože však, jak již bylo uvedeno dříve, je DNA pocházející z nádorových buněk většinou ve výrazné menšině, výzvou se stává následná analýza nádorově‑specifických mutací v ctDNA. V tab. 2 jsou uvedeny používané metody, včetně srovnání jejich senzitivity a specificity.

Pro detekci mutací v omezeném počtu genů se jako nejvhodnější jeví různé varianty digitální PCR –  na mikročipech či mikrokapkách [28,29] nejlépe v kombinaci s metodou BEAMing, která je založena na zachycení DNA na magnetické kuličky a následné analýze pomocí digitální PCR. ctDNA může být s její pomocí detekována i v případech, kdy ji DNA ze zdravých buněk přečísluje v poměru 10 000 : 1 [30]. Technologie sekvenování nové generace (next-generation sequencing – NGS) jsou aplikovatelné na analýzu DNA v plazmě a umožňují podrobnější detekci mutací v rozsáhlejších oblastech genomu. Jako příklad lze uvést nedávnou studii provedenou na 107 vzorcích plazmy odebraných od pa­cientů s rakovinou plic. Při analýze DNA z primárního nádoru bylo detekováno 50 mutací v různých genech, z nichž 26 se podařilo detekovat také v krevních vzorcích, se senzitivitou 58 % a specificitou 87 % [31]. Pro detailní analýzu byla NGS technologie využita např. při dlouhodobém sledování pa­cientky s nádorem prsu, u které bylo analyzováno 300 genů v primárním nádoru, v metastázách a v ctDNA. Sekvenování ctDNA umožnilo sledovat vývoj nádorových buněk při vznikající rezistenci k terapii a bylo využito k identifikaci de novo mutací vznikajících v důsledku aplikované protinádorové terapie [32].

Na sekvenování specifických genomových oblastí v plazmové DNA byly využity varianty cíleného hloubkového sekvenování: TAM‑ seq (tagged‑ amplicon deep sequencing) [33], Safe‑ Seq [34]nebo CAPP‑ Seq (capture‑based se­quenc­ing) [24]. Detekovat lze v ctDNA také chromozomální přestavby, jako jsou translokace nebo ztráta či získání chromozomálních regionů, což představuje vysoce specifickou a senzitivní metodu pro detekci nádorové DNA [35]. V ně­kte­rých případech byla metoda celogenomového sekvenování aplikována přímo na analýzu DNA obsažené v plazmě a poskytla informace o somatických mutacích a změnách v počtu kopií cílových genů v rámci celého genomu [36,37].

S dalším zvyšováním citlivosti metod založených na analýze celého genomu budou technologie NGS hrát zřejmě klíčovou roli v analýze ctDNA a jejím využitím v klinické praxi.

Závěr

Analýzy nádorového onemocnění založené na tkáňové bio­psii a zobrazovacích metodách by mohly být v dohledné době vhodně doplňovány také analýzou ctDNA. Tato metoda přináší řadu výhod, např. možnost častého odběru vzorků, detekce mutací v buňkách pocházejících z různých oblastí primárního nádoru i metastáz, monitorování vývoje a predikce odpovědi na léčbu. Před jejím zavedením do klinické praxe však musí být ještě optimalizovány a zavedeny standardizované postupy odběru a uchování krevních vzorků, stejně tak zvoleny nejvhodnější metody pro izolaci ctDNA a analýzu vyskytujících se mutací. Zintenzivnění výzkumu a rostoucí počet pub­likací v posledních letech naznačuje, že je tato metoda považována za nadějnou a přínosnou, a snad se tedy stane dalším nástrojem zvyšujícím šance pa­cientů v boji proti nádorovému onemocnění.

Práce byla podpořena Evropským fondem pro regionální rozvoj a státním rozpočtem České republiky (RECAMO, CZ.1.05/2.1.00/03.0101), projekty MŠMT – NPU I – LO1413, GAČR 13-00­956S, MZ ČR – RVO (MOÚ, 00209805) a BBMRI_CZ (LM2010004).

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Mgr. Eva Ondroušková, Ph.D.

Regionální centrum aplikované molekulární onkologie

Masarykův onkologický ústav

Žlutý kopec 7

656 53 Brno

e-mail: eva.ondrouskova@mou.cz

Obdrženo/Submitted: 7. 4. 2015

Přijato/Accepted: 3. 7. 2015