Problematika stanovení monoklonálního imunoglobulinu u nemocných s AL amyloidózou

Souhrn

Úvod:
AL amyloidóza je vzácné onemocnění patřící do skupiny monoklonálních gamapatií, přičemž podkladem choroby je depozice fibril tvořených molekulami monoklonálních lehkých řetězců imunoglobulinů ve formě amyloidu – amorfního bílkovinného materiálu. Detekce a kvantifikace monoklonálního imunoglobulinu (MIg), resp. lehkých řetězců imunoglobulinu představuje stěžejní aspekt v diagnostice a sledování nemocných s AL amyloidózou.

Cíl:
Náplní předloženého sdělení jsou vlastní zkušenosti se stanovením MIg u pacientů s AL amyloidózou.

Soubor a metody:
Soubor zahrnoval 27 nemocných se systémovou AL amyloidózou. U všech nemocných byla provedena detekce a kvantifikace monoklonálního imunoglobulinu v séru a v moči užitím elektroforézy a imunofixace, hladiny volných lehkých řetězců byly stanovovány systémem FreeLite^TM. U 13 nemocných bylo provedeno stanovení párů těžkých/lehkých řetězců (HLC) imunoglobulinu v séru systémem HevyLite^TM.

Výsledky:
Elektroforetické a imunofixační vyšetření séra prokázalo přítomnost molekul MIg u 17/27 (63 %) nemocných, medián koncentrací byl 3,8 g/l (0,3 – 14,2 g/l). Typizačně se jednalo v pěti případech o kompletní molekuly izotypu IgG (1x IgG-κ, 4x IgG-λ), ve čtyřech případech IgA-λ a v jednom případě IgD-λ. U sedmi nemocných byla v séru zjištěna přítomnost pouze lehkých řetězců λ. Při analýze moči byla exkrece Bence - Jonesovy bílkoviny zjištěna u 15 (56 %) nemocných, ve všech případech v kvantitě nad 200 mg/24 hodin, přičemž u tří nemocných byla navíc prokázána přítomnost kompletních molekul MIg v moči (1x IgA-λ, 2x IgG-λ). Analýza sérových hladin volných lehkých řetězců prokázala u všech nemocných abnormální hodnoty s mediánem 310 mg/l (53,6 – 1562 mg/l), patologie indexu κ/λ byla zjištěna u 25 nemocných (92,5 %). Analýza hladin HLC byla provedena u 13 nemocných. V případě IgA izotypu byla zjištěna patologie hladin IgA-λ HLC spolu se změnou HLC indexu u 3/4 nemocných. V případě IgG izotypu byla zjištěna patologie hladin IgG-λ HLC i indexu u 2/2 nemocných. V případě λ a imunofixačně negativních sér nebyla zjištěna elevace HLC hladin v jednotlivých izotypech. Naopak u 5/7 nemocných byla zjištěna suprese hladin HLC IgG-κ spolu se změnou HLC indexu. Ve třídách IgA a IgM suprese izotypových párů zjištěna nebyla.

Závěr:
Detekce, kvantifikace a komplexní analýza monoklonálního imunoglobulinu patří mezi stěžejní aspekty péče o nemocné s AL amyloidózou. Kombinace standardních technik elektroforézy a imunofixace spolu se stanovením hladin VLŘ umožňuje monitorování naprosté většiny nemocných s AL amyloidózou. Pro objasnění významu HLC analýzy je potřeba dalších výsledků na obsáhlejších souborech nemocných.

Klíčová slova:
AL amyloidóza, monoklonální imunoglobulin, volné lehké řetězce imunoglobulinu, páry těžkých/lehkých řetězců imunoglobulinu.

Úvod

Amyloidózy představují heterogenní skupinu onemocnění, jejichž společným rysem je depozice insolubilních fibril patologického či fyzikálně-chemicky pozměněného fyziologického proteinu ve formě amyloidových depozit, zaujímajících strukturu β – skládaného listu. Doposud bylo identifikováno přibližně 30 amyloidogenních proteinů [1]. AL amyloidóza (light chain amyloidosis) je systémové nebo orgánově limitované onemocnění patřící do skupiny monoklonálních gamapatií. Jedná se o vzácné onemocnění, přičemž incidence představuje přibližně 5-12 nemocných na milion obyvatel za rok. U části nemocných (10-20 %) bývá onemocnění asociováno s mnohočetným myelomem nebo Waldenströmovou makroglobulinémií [2 - 5]. AL amyloidóza je charakterizovaná extracelulární depozicí amyloidových mas tvořených fragmenty nebo kompletními molekulami monoklonálních lehkých řetězců imunoglobulinů produkovaných klonálními plazmocyty. Imbibice tkání amyloidem vede k úbytku buněčných elementů, tkáňové dezorganizaci a následné poruše funkce postižených orgánů – nejčastěji ledvin, srdce, jater a periferního nervového systému [6, 7]. Kromě detailní typizace amyloidových mas, identifikace plazmocytárního klonu a posouzení funkce postižených orgánů, patří mezi stěžejní vyšetření stanovení monoklonálního imunoglobulinu (MIg), jako sekrečního produktu klonálních plazmocytů. Identicky jako u ostatních monoklonálních gamapatií, slouží stanovení MIg nejen k diagnostice, ale i pro sledování nemocných s AL amyloidózou [2 – 4, 8]. Náplní předloženého sdělení jsou vlastní zkušenosti se stanovením hladin MIg u nemocných s AL amyloidózou.

Soubor a metody

Vyšetřený soubor zahrnoval 27 nemocných s biopticky verifikovanou a typizovanou systémovou AL amyloidózou, u kterých byla vyloučena asociace s jiným hematologickým onemocněním (mnohočetný myelom, Waldenströmova makroglobulinémie) a kteří byli diagnostikováni a léčeni ve Fakultní Nemocnici Olomouc v letech 2004 – 2014. Věkový medián činil 62 let (48 – 92 let), poměr mužů a žen činil 18:9, zastoupení amyloidogenního lehkého řetězce kappa:lambda bylo 4:23. Stanovení hladin MIg bylo prováděno elektroforeticky na přístroji Sebia Hydrasys s užitím souprav Sebia Hydragel 30 Protein(e) s následnou denzitometrickou kvantifikací monoklonálního gradientu pomocí skeneru Epson 1680 Pro a softwarového vybavení Phoresis. Pro typizaci MIg imunofixační analýzou bylo užito souprav Hydragel 4 IF na identické platformě. K detekci a kvantifikaci odpadu monoklonálního imunoglobulinu, resp. Bence-Jonesovy bílkoviny v moči bylo použito stejného vyšetřovacího postupu a souprav, kdy byla moč pacienta vyšetřena pomocí elektroforézy s následnou imunofixací paralelně s jeho sérem. Hodnoty celkových bílkovin v séru, resp. v moči pro výpočet kvantitativního zastoupení frakcí se stanovily na analytické lince Cobas 8000 firmy Roche pomocí souprav TP2, resp. TPUC3. Sérové hladiny volných lehkých řetězců (VLŘ) byly stanovovány systémem FreeLite^TM (The Binding Site) s užitím platformy nefelometru Radim Delta (Radim Diagnostics) a od roku 2010 turbidimetru SPAplus (The Binding Site). Normální rozmezí sérových hladin bylo 3,3 – 19,4 mg/l v případě lehkého řetězce kappa (κ), v případě lambda (λ) pak 5,7 – 26,3 mg/l. Vzájemný poměr lehkých řetězců kappa/lambda (index κ/λ) byl určen výpočtem s normálním rozmezím 0,26 – 1,65, v případě renální nedostatečnosti pak 0,37 – 3,1. Pro analýzu hladin párů těžkých/lehkých řetězců imunoglobulinu (HLC) u 13 nemocných bylo užito souprav HevyLite Human IgG kappa (NR: 3,84 – 12,07 g/l), IgG lambda (NR: 1,91 – 6,74 g/l), IgA kappa (NR: 0,57 až 2,08 g/l), IgA lambda (NR: 0,44 – 2,04 g/l), IgM kappa (NR: 0,19 – 1,63 g/l) a IgM lambda kit for the use on the SPA Plus (NR: 0,12 – 1,01 g/l), vzájemný poměr párů izotypů imunoglobulinu byl zjištěn výpočtem. Analýza byla provedena opět na turbidimetru SPAplus (The Binding Site).

Výsledky

Elektroforetické a imunofixační vyšetření séra prokázalo přítomnost molekul MIg u 17/27 (63 %) nemocných, přičemž medián koncentrací hladin činil 3,8 g/l (0,3 – 14,2 g/l). Typizačně se jednalo v pěti případech o kompletní molekuly izotypu IgG (1x IgG-κ, 4x IgG-λ), ve čtyřech případech IgA-λ a u jednoho nemocného byl zjištěn izotyp IgD-λ. U sedmi nemocných byla v séru zjištěna přítomnost pouze lehkých řetězců λ. Koncentrace MIg přesahovaly hranici 10 g/l pouze u dvou nemocných (12,8 a 14,2 g/l) (Obr. 1). Při proteinové analýze moči byla exkrece Bence-Jonesovy bílkoviny zjištěna u 15 (56 %) nemocných, ve všech případech v kvantitě nad 200 mg/24 hodin, přičemž u tří nemocných byla navíc prokázána přítomnost kompletních molekul MIg v moči (1x IgA-λ, 2x IgG-λ). Samotná zjištěná kvantita proteinurie přesahovala u 17 nemocných hodnotu 3,5 g/den, tedy nefrotického typu, přičemž klinicky vyjádřený nefrotický syndrom byl zjištěn u 15 pacientů (Obr. 2). Analýza sérových hladin volných lehkých řetězců prokázala u všech nemocných abnormální hodnoty s mediánem 310 mg/l (53,6 – 1562 mg/l), přičemž patologie indexu κ/λ byla zjištěna u 25 nemocných (92,5 %) (Obr. 3). U dvou nemocných s normálními hodnotami indexu κ/λ, byla zjištěna současně elevace obou lehkých řetězců při pokročilé renální nedostatečnosti. Z 25 nemocných s abnormálními hladinami VLŘ a současně s patologií indexu κ/λ mělo 23 (85 %, z celkového počtu 27) pa-cientů hladiny dVLŘ (dVLŘ – rozdíl hladin dominantního a alternativního VLŘ) > 50 mg/l, což je v současnosti všeobecně akceptovaný limit definující měřitelné onemocnění. Analýza hladin párů těžkých/lehkých řetězců imunoglobulinu a imunoglobulinových podtříd byla provedena u 13 nemocných (dle imunofixace: 4x IgA-λ, 2x IgG-λ, 3x λ, 4x negativní). V případě IgA-λ izotypu byla zjištěna patologie hladin IgA HLC spolu se změnou HLC indexu u 3/4 nemocných, kteří rovněž vykazovali výraznou elevaci podtřídy imunoglobulinu IgA1. V případě IgG-λ izotypu byla zjištěna patologie hladin IgG HLC i indexu u obou nemocných. U jednoho nemocného byl MIg identifikován jako izotyp podtřídy IgG1, u druhého IgG4. V případě λ a imunofixačně negativních sér nebyla zjištěna elevace HLC hladin v jednotlivých izotypech. Naopak u 5/7 nemocných byla zjištěna suprese hladin HLC IgG-κ (u 2/7 současně i IgG-λ) spolu se změnou HLC indexu. Ve třídě IgA a IgM suprese izotypových párů zjištěna nebyla.

Diskuse

Vyšetření proteinového spektra, zejména pak detekce, typizace a kvantifikace hladin MIg patří mezi stěžejní aspekty v diagnostice a sledování nemocných s monoklonálními gamapatiemi [9 až 11]. V případě mnohočetného myelomu představuje standardní přístup stanovení a monitorování kvantity MIg pomocí agarózové/kapilární elektroforézy séra a následné denzitometrie elektroforetické stopy s určením typu imunoglobulinu imunofixací a/nebo průkaz Bence-Jonesovy bílkoviny v moči s určením jejího typu pomocí imunofixace zahuštěné moči z 24 hodinového sběru [11, 12]. V případě méně obvyklých variant myelomu (nesekretorický, Bence-Jonesův či oligosekreční typ) a pro určení hloubky remise je navíc využíváno stanovení sérových hladin volných lehkých řetězců imunoglobulinu [13]. Podobně je postupováno i v případě AL amyloidózy, avšak s určitými specifiky. Kombinace zvyklé analýzy (elektroforéza a imunofixace) séra a moči sice umožňuje detekovat MIg u ~ 94 % nemocných s AL, nicméně u velké části nemocných však získané výsledky nedovolují účinně hodnotit míru léčebné – tzv. hematologické odpovědi nebo naopak progresi onemocnění, z důvodu obvykle velmi nízkých hladin MIg v séru (<10 g/l) či moči (<200 mg/den) či jen pouhé imunofixační pozitivity [9,14 až 16]. V našem souboru byly hladiny MIg v séru detekovány u 63 % nemocných, avšak medián koncentrací byl velmi nízký a pouze u dvou nemocných hladiny MIg přesahovaly 10 g/l, definující měřitelné onemocnění. Exkrece Bence – Jonesovy bílkoviny do moči byla zjištěna u 63 % nemocných, u tří nemocných byly detekovány i kompletní molekuly MIg v moči, přičemž ve všech případech se jednalo o nemocné s těžkou formou nefrotického syndromu. Samotné sledování odpadů Bence – Jonesovy bílkoviny do moči bylo využíváno pro monitorování onemocnění u dvou pacientů s nepřítomností MIg v séru a absencí sérových hladin VLŘ jako měřitelného parametru. Kvantifikace celkové proteinurie za 24 hodin mimo jiné slouží i jako diagnostický ukazatel orgánového postižení ledvin u AL amyloidózy. U nemocných s AL amyloidózou a postižením ledvin nacházíme povětšinou neselektivní proteinurii s dominantní albuminurií. Jako diagnostické kritérium platí přítomnost proteinurie > 0,5 g/den při absenci jiné příčiny nefropatie (např. diabetická nefropatie). Stejně tak i kritérii orgánové léčebné odpovědi/progrese jsou redukce resp. nárůst proteinurie o 50 % a změny v hladinách kreatininu a kreatininové clearance [17 až 19]. Postižení ledvin bývá přítomno až u 60 % nemocných, což ilustruje i náš soubor. Proteinurie nefrotického typu byla zaznamenána u 17 nemocných, přičemž u 15 pacientů byl plně vyvinut nefrotický syndrom.

V současnosti je již zcela běžně dostupné stanovení sérových hladin volných lehkých řetězců (VLŘ) se vzájemným výpočtem poměru obou řetězců – tzv. κ/λ index, poskytující informaci o míře produkce VLŘ klonálními plazmocyty [20, 21]. Samotné stanovení VLŘ bývá pozitivní u 88-92 % nemocných s AL a při kombinaci s výše uvedenými standardními technikami detekce paraproteinu dochází k pozitivnímu záchytu MIg až u 98 % nemocných s AL [14 - 16]. Nespornou výhodou stanovení VLŘ je právě zisk měřitelného parametru u velké části nemocných s oligosekrečním onemocněním či jen pouhou imunofixační pozitivitou, umožňující pravidelné sledování nemocných a hodnocení efektu terapie. V současnosti platí revidovaná IMWG (International Myeloma Working Group) a ISA (International Society for Amyloidosis) kritéria, kdy za měřitelné onemocnění je pokládán stav s absolutní hodnotou rozdílu dominantního - alternativního VLŘ (dVLŘ) >50 mg/l, přičemž dosažení parciální remise odpovídá >50 % redukce vstupních hodnot, velmi dobrá parciální remise je definována jako absolutní hodnota dVLŘ <40 mg/l a naopak progresi stavu definuje nárůst VLŘ o >50 % (a to alespoň o 100 mg/l) [13, 17 - 19]. Kompletní remise je definována jako negativní imunofixační elektroforéza séra i moči, absence klonálních plazmocytů v kostní dřeni a normální index κ/λ. Vzhledem k výše uvedenému je hodnocení léčebné odpovědi pomocí stanovení VLŘ preferováno a pouze u nemocných s absencí patologických hladin či velmi nízkými hladinami VLŘ by se mělo užít klasického hodnocení pomocí elektroforézy séra a/nebo moči. V našem případě byla pozitivita testu včetně patologie indexu κ/λ zjištěna u 92,5 % nemocných, přičemž pro sledování onemocnění bylo pravidelné stanovení sérových hladin VLŘ užito u 85 % nemocných.

Nejnovějším testem využívaným pro analýzu proteinového spektra je stanovení izotypových párů těžkých/lehkých řetězců imunoglobulinu (HLC). Jedná se o perspektivní metodu, která jak se zdá, obohatí spektrum vyšetření užívaných u mnohočetného myelomu a monoklonální gamapatie nejistého významu [20, 21]. Analýza HLC byla provedena v našem souboru u 13 nemocných, přičemž u pacientů s přítomnou kompletní molekulou imunoglobulinu (IgG-λ, IgA-λ) byly zjištěny patologické hladiny identických izotypových HLC párů se změnou HLC indexu, ve všech případech s výhodou citlivěji měřitelného parametru nežli v případě užití elektroforézy. V případě dvou nemocných s elektroforetickou typizací a kvantifikací jako lehké řetězce λ a u tří nemocných s negativitou elektroforetického a imunofixačního vyšetření séra byla zajímavým nálezem zjištěna suprese HLC hladin u izotypových párů třídy IgG. Je nutno podotknout, že u těchto pěti nemocných byl zjištěn těžký nefrotický syndrom, jakožto možná příčina ztrát monomerických molekul IgG močí. Možný přínos stanovení hladin HLC u AL amyloidózy pro klinickou praxi však stále není objasněn a teprve závěry prací na rozsáhlejších souborech tuto otázku zodpoví.

Závěr

Detekce, kvantifikace a komplexní analýza monoklonálního imunoglobulinu patří mezi stěžejní aspekty péče o nemocné s AL amyloidózou. Kombinace standardních technik elektroforézy a imunofixace spolu se stanovením hladin VLŘ umožňuje monitorování naprosté většiny nemocných s AL amyloidózou. Vzhledem k mnohdy obtížné interpretaci výsledků vyšetření je těsná spolupráce ošetřujícího lékaře a laboratorních expertů nezbytná. Pro objasnění významu HLC analýzy je potřeba dalších výsledků na obsáhlejších souborech nemocných.

S podporou grantu NT 12451/5, NT 14400.

Do redakce došlo 16. 2. 2015

Adresa pro korespondenci:

MUDr. Tomáš Pika, Ph.D.

Hemato-onkologická klinika, Fakultní nemocnice Olomouc

I. P. Pavlova 6, 775 20, Olomouc

Email: tomas.pika@seznam.cz