Molekulárně genetická studie mykobakteriálních kmenů prevalujících na území České republiky v roce 2014

Souhrn

Cíl práce: Identifikovat kmeny Mycobacterium tuberculosis prevalující na území České republiky v roce 2014.

Materiál a metodika: DNA 269 kmenů M. tuberculosis získaných od pacientů žijících na území ČR v roce 2014. Kmeny byly postupnou analýzou zařazeny do geneticky příbuzných skupin webovým softwarem MIRU-VNTRplus.

Výsledky: Byly identifikovány čtyři globální linie: 1 Indo-Oceánská, 2 Východo-Asijská (13,8 %), 3 Středo-Asijská a 4 Euro-Americká (83,6 %) se subliniemi: Haarlem (44,2 %), H37Rv, Cameroon, Latinská Amerika-Středomoří (LAM), Haarlem / X, NEW-1, URAL, S, X, TUR a UgandaI. Plná identita repetitivních sekvencí byla prokázána u 27,1 % kmenů dvou globálních linií: 2 Východo-Asijská (2 skupiny) a 4 Euro-Americká (21 skupin): sublinie Haarlem (11 skupin), H37Rv (3 skupiny), Cameroon (2 skupiny), Haarlem / X (2 skupiny), X (1 skupina), LAM (1 skupina) a S (1 skupina). V souboru získaných kmenů bylo sedm multirezistentních (MDR) kmenů bez klastrování. Čtyři MDR kmeny globální linie 2 Východo--Asijské (Beijing) a tři MDR kmeny globální linie 4 Euro-Americké (2 kmeny sublinie Latinská Amerika-Středomoří (LAM) a 1 kmen sublinie Haarlem).

Závěry: Jednoletá studie zaměřená na identifikaci mykobakteriál­ních kmenů prevalujících na celém území České republiky v roce 2014. Studie přináší první geografický obraz o plošném rozložení kmenů M. tuberculosis v populaci.

Klíčová slova:

linie Mycobacterium tuberculosis – repetitivní sekvence – identifikace

ÚVOD

Tuberkulóza (TBC) je zánětlivé onemocnění patřící v České republice k povinně hlášeným nemocem. Onemocnění způsobují acidorezistentní tyčky pomalu rostoucí bakterie Mycobacterium tuberculosis komplex, tzv. Kochův bacil. Nejčastěji je způsobené druhem M. tuberculosis. Celosvětově patří TBC stále k nejsledovanějším nemocem, patří mu druhá příčka mezi úmrtími na infekční nemoci. Ve světě je sociální chorobou značně rozšířenou v rozvojových zemích. Vysoký výskyt tohoto onemocnění je především v Číně, Indii a Ruské federaci. Tyto země se potýkají také s vyšším výskytem rezistence na antibiotika používaná k léčbě TBC. Většina hlášených multirezistentních (MDR) kmenů M. tuberculosis pochází tedy z východní Evropy a centrální Asie. Česká republika patří podle WHO mezi oblasti s nejnižším výskytem tohoto onemocnění na světě, a to i v porovnání s evropskými zeměmi [1]. V roce 2014 byla incidence onemocnění TBC v České republice 4,8/100 000 obyvatel. Vyšší incidenci než republikový průměr mělo hlavní město Praha (7,8/100 000 obyvatel), kraj Středočeský (5,8/100 000 obyvatel), Pardubický (5,4/100 000 obyvatel), Olomoucký (5,2/100 000 obyvatel) a Královehradecký (5,1/100 000 obyvatel). Nejnižší incidence počtu hlášených onemocnění byla v Jihočeském kraji (2,4/100 000 obyvatel). Podíl pacientů s onemocněním TBC, který tvoří cizí státní příslušníci, byl v roce 2014 18,7 % a podle zdravotnických statistik stále mírně narůstá [2].

Sledování neustále probíhajícího evolučního vývoje M. tuberculosis umožňují polymorfismy v DNA. Genotypizace M. tuberculosis je pro mikrobiologii a epidemiologii nepostradatelná. Důležitost genotypizace tuberkulózy potvrdily za posledních 20 let stovky významných publikací [3, 4]. Pro identifikaci a analýzu polymorfismu některých typů opakujících se jednotek v DNA jsou využívány tyto molekulární metody: RFLP (Restriction fragment length polymorphism), spoligotypování a MIRU-VNTR (Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit-Variable Number of Tandem Repeats) či celogenové sekvenování [4].

V předkládané studii bylo provedeno molekulárně genetické testování pomocí metody MIRU-VNTR druhu M. tuberculosis s cílem rozčlenit tento druh do linií, sublinií a vytvoření geneticky příbuzných skupin pro potřeby současných i budoucích epidemiologických studií, zejména za účelem zjišťování patogenity.

MATERIÁL A METODIKA

Pro izolaci DNA a identifikaci genotypů byly použity následující kity a reagencie – izolační kitGenoLyse (HAIN), 24 párů primerů [5] (GeneriBiotech), HotStarTaq DNA Polymerasekit (QIAGEN), polymeráza KAPA2G Robust (Elisabeth Pharmacon), PCR dNTP mix (Top-Bio), agaróza (SIGMA), interkalační barvivo SERVA DNA Stain G (SERVA), 50 bp DNA Ladder (NEW ENGLAND BioLabs), 100 bp DNA Ladder (NEW ENGLAND BioLabs).

K identifikaci byl použit referenční kmen M. tuberculosis H37Rv a 269 kmenů M. tuberculosis získaných od pacientů s TBC žijících v roce 2014 na území čtrnácti statutárních celků České republiky (Hlavního města Praha a třinácti krajů: Středočeského, Jihočeského, Plzeňského, Karlovarského, Ústeckého, Libereckého, Královehradeckého, Pardubického, Olomouckého, Moravskoslezského, Jihomoravského, Zlínského a Kraje Vysočina). Mezi analyzovanými kmeny bylo sedm MDR kmenů; čtyři kmeny z hl. m. Prahy a po jednom kmenu ze Středočeského, Libereckého a Moravskoslezského kraje. V souboru 269 kmenů bylo 57 kmenů od pacientů s cizí státní příslušností.

Ze získaných kmenů byla v naší laboratoři provedena izolace DNA pomocí izolačního kitu GenoLyse (HAIN) a zhotoveno 269 izolátů DNA. Z každého izolátu M. tuberculosis a referenčního kmene H37Rv byly polymerázovou řetězovou reakcí (PCR, z anglického Polymerase Chain Reaction) připraveny amplikony (PCR produkty vzniklé metodou rychlého selektivního zmnožení – amplifikací určité oblasti DNA v podmínkách in vitro). Amplifikované úseky DNA byly ohraničeny čtyřiadvaceti páry tzv. primerů (oligonukleotidů), což jsou krátké fragmenty DNA [6] (GeneriBiotech). Syntéza vybraného úseku DNA probíhala od přisedlých primerů termostabilními polymerázami HotStarTaq DNA Polymerasekit (QIAGEN) nebo KAPA2G Robust (Elisabeth Pharmacon). Pro genetickou analýzu lokusů byly PCR produkty nanášeny na 2% agarózový gel (agaróza SIGMA) a vizualizovány interkalačním barvivem SERVA DNA Stain G. Fotodokumentace gelů byla pořizována fotoaparátem Canon PowerShot_SX510_HS. Na fotodokumentaci byl vizuálně odečten počet repetitivních sekvencí podle vyhodnocovací tabulky [6, 7]. K porovnání velikostí fragmentů DNA generovaných v PCR byl použit 50 bp DNA Ladder a 100 bp DNA Ladder (NEW ENGLAND BioLabs).

Mykobakteriální kmeny získané od pacientů v roce 2014 byly označeny pětimístným či šestimístným kódem. První dvě čísla značí rok, kdy byl materiál odebrán. Číslo izolátu představují tři či čtyři následující čísla. Pod těmito kódy byly kmeny řazeny do fylogeneticky příbuzných skupin. Shluková analýza a identifikace linií a sublinií byla provedena online přístupným webovým softwarem MIRU-
-VNTRplus [6, 7]. Tento volně přístupný software umožňuje uživatelům analyzovat údaje získané vyšetřením jejich kmenů. Referenční databáze kmenů reprezentuje 186 kmenů MTBC (Mycobacterium tuberculosis komplex).

Panel MIRU-VNTR se skládá z následujících 24 lokusů: 154 - 424 - 577 - 580 - 802 - 960 - 1644 - 1955 - 2059 - 2163b - 2165 - 2347 - 2401 - 2461 - 2531 - 2687 - 2996 - 3007 - 3171 -3192 - 3690 - 4052 - 4156 - 4348. Profily kmenů představují sérii 24 čísel odpovídajících počtu opakování v repetitivních sekvencích v každém lokusu. Například počet repetitivních sekvencí referenčního kmene H37Rv je: 2-2-4-3´-1-3-2-2-2-5-3-4-2-3-6-1-3-3-3-3-5-5-2-2- [6, 7]. Klastrované izoláty jsou definovány jako dva nebo více izolátů se shodným počtem repetitivních sekvencí u 24 lokusů ve výše uvedeném pořadí.

VÝSLEDKY

Kmeny M. tuberculosis získané od 269 pacientů (z toho 57 cizinců a 7 MDR) žijících v roce 2014 ve čtrnácti územních celcích České republiky (ČR) byly rozděleny do linií a sublinií a zařazeny do geneticky příbuzných skupin.

Z globálních linií byla v našem souboru identifikována linie 1 Indo-Oceánská: EAI n = 4, 2 Východo-Asijská: Beijing n = 37, 3 Středo-Asijská: Delhi/CAS n = 3 a 4 Euro-Americká: n = 225 sublinie: Haarlem n = 119, H37Rv n = 36, Cameroon n = 24, Latinská Amerika-Středomoří (LAM) n = 13, Haarlem/X n = 9, NEW-1 n = 8, URAL n = 6, S n = 5, X n = 3, TUR =1 a Uganda I n = 1. Grafické znázornění kvantitativního zastoupení prevalujících linií/sublinií v ČR představuje graf 1. Rozložení kmenů genotypu Beijing, Haarlem, Latinská Amerika-Středomoří (LAM) a ostatních genotypů Euro-americké linie 4 v jednotlivých krajích ČR znázorňuje graf 2.

Plná identita repetitivních sekvencí 24 lokusů byla zjištěna u dvou globálních linií: 2 Východo-Asijské a 4 Euro-Americké (linie 1 a 3 neklastrovaly). Tabulka 1 uvádí počet klastrů, jejich velikost a poměrné zastoupení v populaci. Grafické vyjádření výsledků shlukové/klastrové analýzy ilustruje dendrogram na obrázku 1.

Ze souboru 269 kmenů bylo 6 kmenů od pacientů s cizí státní příslušností součástí šesti klastrových skupin (označeni hvězdičkou *, viz obr. 1). Čtyři kmeny byly zařazeny do globální linie 4 Euro-Americká (sublinie Haarlem, S a H37Rv) a dva kmeny do linie 2 Východo-Asijská (sublinie Beijing; 51 kmenů neklastrovalo).

Sublinie Haarlem (linie 4 Euro-Americká) vytváří nejvyšší podíl klastrovaných kmenů v ČR; celkem 11 klastrových skupin. U dvou skupin se dvěma klastrovanými kmeny sublinie Haarlem byl prokázán příbuzenský vztah. U skupiny čtyř klastrovaných kmenů sublinie Haarlem/X byla zjištěna blízkost bydliště (viz tab. 1, obr. 1).

Majoritní linie 4 Euro-Americká prevalovala na celém území ČR (viz graf 2), způsobila onemocnění TBC 83,6 % pacientům (ve 13 % u cizích státních příslušníků). Další významnou sublinií, která byla identifikována u 13,8 % pacientů (z toho 5,6 % cizinců) je linie 2 Východo-Asijská sublinie Beijing. Tato sublinie byla identifikována ve všech krajích kromě kraje Jihočeského, Libereckého, Královéhradeckého a Zlínského (viz graf 2).

Kmeny globální linie 1 Indo-Oceánská, 3 Středo-Asijská sublinie Delhi/CAS, 4 Euro--Americká sublinie NEW-1, URAL, X, TUR a Uganda I byly bez klastrování.

Kmeny MDR (7 kmenů; 2,6 %) nebyly klastrovány. Byla u nich identifikována linie 2 Východo--Asijská sublinie Beijing (4 kmeny) a linie 4 Euro-Americká sublinie LAM (2 kmeny) a sublinie Haarlem (1 kmen). Ze skupiny MDR kmenů patřily 4 kmeny pacientům s cizí státní příslušností.

DISKUSE

V předkládané studii bylo provedeno genotypování pomocí metody MIRU-VNTR repetetivní sekvence kmenů M. tuberculosis u 269 pacientů. Jedná se o molekulárně genetickou metodu navazující na RFLP a spoligotyping. V posledních deseti letech se v rámci TBC tyto metody staly základem pro diferenci genotypů a jejich distribuci v národní i nadnárodní úrovni [4]. Vzhledem k tomu, že je TBC v nadnárodním měřítku vedoucí příčinou úmrtí na infekční onemocnění, v roce 2017 [8] na toto onemocnění celosvětově zemřelo odhadem 1,7 milionů nakažených, je tomuto onemocnění věnována široká vědecká pozornost. Jak již bylo zmíněno výše, ačkoli je incidence onemocnění TBC v ČR pouze 4,8/100 000 obyvatel, představuje toto onemocnění závažnou nákazu, které je třeba věnovat pozornost a intenzivně pracovat na epidemiologických studiích. Vzhledem k tomu, že globální zátěž TBC spadá především na rozvojové země, jsou pro návrh vhodných strategií pro kontrolu nemoci nezbytné přesné odhady přistěhovalectví. Tento trend potvrzuje např. studie [9], z níž je patrno, že z 1 080 pacientů, kteří byli do studie zahrnuti, bylo 614 pacientů (56,9 %) italské národnosti a 466 pacientů (43,1 %) byli cizinci (z toho 27,9 % pocházelo z Afriky, 23,6 % z Asie, 22,3 % z východní Evropy a 11,6 % ze Střední a Jižní Ameriky). V námi předkládané práci bylo zjištěno, že v České republice (ČR) z 269 pacientů, pocházelo pouze 57 kmenů od pacientů s cizí státní příslušností, tedy o polovinu méně, než u výše zmíněné studie v Itálii. V ČR však není tak vysoký výskyt cizinců z Afriky a Jižní Ameriky. Dále bylo zjištěno, že ze skupiny 7 multirezistentních kmenů patřily 4 kmeny pacientům s cizí státní příslušností. Fakt, že v ČR není v současné době tak vysoký podíl cizinců z celkového počtu pacientů, nijak neubírá na důležitosti předkládané studie a lze spíše předpokládat, že v souvislosti s globalizací bude trend incidence TBC v ČR minimálně u cizinců vzrůstající.

V současnosti je M. tuberculosis komplex způsobující onemocnění TBC u člověka řazen do sedmi fylogenetických globálních linií: linie 1 Indo-Oceánská (EAI), linie 2 Východo-Asijská (Beijing), linie 3 Středo-Asijská (CAS), linie 4 Euro-Americká, Africká linie 1, Africká linie 2 a Etiopská linie 7. V předkládané studii byl testován druh M. tuberculosis, u kterého řada autorů popisuje 5 globálních linií: EAI, Beijing, CAS, Euro-Americká linie a poslední identifikovaná linie byla linie Etiopská [6]. V naší studii byly identifikovány 4 linie z 5 a to i u pacientů s cizí státní příslušností (tabulka 1, graf 1; linie 7 nebyla identifikována). Tyto výsledky korespondující s již dříve publikovanými daty získanými v rámci evropských studií, z nich je rovněž patrno, že největší zastoupení má linie 4 Euro-Americká, následuje linie 2 Východo-Asijská (Beijing) a malé nebo žádné zastoupení má linie 1 EAI, linie 3 CAS a linie 7 Etiopská [9]–[11]. Bylo jednoznačně zjištěno, že nejrozšířenějším původcem TBC v populaci je kmen globální linie 4 (Euro-Americká). Prevalujícími subliniemi byly Haarlem a LAM. Tyto výsledky jsou opět v souladu s již dříve publikovanými daty u jiných autorů [12, 13], v naší studii byl největší počet kmenů zařazen do sublinie Haarlem (obrázek 1, graf 1, tabulka 1). Ke stejnému závěru dospěla i naše studie z roku 2013–2014 v Praze [14]. Důvody globálního úspěchu linie 4 a jejích sublinií nejsou zcela známé. Nicméně vzhledem k faktu, že je tato linie geneticky a fenotypově různorodá (fylogeograficky divergentní) s vysokou prevalencí, je díky těmto vlastnostem dobrou charakteristikou pro určování epidemiologie různých subtypů v různých částech světa. Podrobnou studii globální distribuce a geografické členění linie 4 a jejích sublinií uvádí publikace [15] u 3 366 kmenů M. tuberculosis komplex. Autoři uvádějí, že globální úspěch linie 4 je odrazem migrace v populaci člověka. V námi předkládané studii byly identifikovány dva příbuzenské/epidemilogické vztahy mezi pacienty s TBC způsobenou právě linií 4 a její subliníí Haarlem (obrázek 1). Identifikované MDR kmeny linie 4 byly zařazeny do sublinií LAM (2 ze 7 kmenů) a Haarlem (1 ze 7 kmenů), ostatní 3 pacienti byli linie 2 Východo-Asijské–Beijing. Tato data jsou opět v souladu s již dříve publikovanými pracemi. Řada autorů v nich uvádí, že sublinie LAM a sublinie Beijing je spojována s rezistencí na antibiotika [16, 17], proto je těmto kmenům potřeba věnovat zvláštní pozornost. Navíc Merker et al. (2015) uvádějí, že sublinie Beijing vznikla na Dálném východě, odkud se do celého světa rozšířila v několika vlnách, přičemž dochází k postupnému zvětšování velikosti populace této sublinie. Tato zjištění plně korespondují s našimi daty, kdy v ČR v letech 2013–2014 bylo v hlavním městě Praze identifikováno 10 neklastrovaných kmenů linie Beijing [14]. V předkládané studii z let 2014–2015 bylo identifikováno 37 kmenů Linie Beijing z toho 11 kmenů bylo identifikováno v hlavním městě Praze (viz graf 2, tab. 1).

I přes zásadní změny v léčbě TBC spolu s rozvojem zemí a s tím spojenou globalizací, se nedaří snižovat výskyt této nemoci. Naopak přibývá rezistentních kmenů mykobakterií. Tato studie obsahuje zásadní informace o shromažďování dat týkajících se rozšířenosti druhu M. tuberculosis za účelem určení linií (sublinií), pro potřeby identifikace faktorů rezistence a incidence TBC v národní i nadnárodní úrovni.

ZÁVĚR

Předkládáme výsledky studie identifikace a rozložení kmenů prevalujících na území České republiky v roce 2014 pomocí molekulární metody MIRU-VNTR druhu M. tuberculosis. Díky numerickému kódu a programu MIRU-VNTRplus lze kmeny a tedy i výsledky této studie velmi snadno porovnávat a použít pro srovnání v rámci různých studií dalších laboratoří. Toto uplatnění má význam především při identifikaci mikroepidemií a přeshraničního přenosu.

Při víceletém genotypování lze vysledovat původní zdroj infekce a její přenos. Pro prokázání mikroepidemií a nákaz mezi příbuznými je také důležitá spolupráce s epidemiology a klinickými lékaři. Předkládané výsledky mohou být podkladem pro další molekulárně epidemiologické studie doplněné dalšími metodami molekulární typizace.

Podpořeno MZ ČR – RVO („Státní zdravotní ústav – SZÚ, 75010330“).

Do redakce došlo dne 1. 3. 2019.

Adresa pro korespondenci:

RNDr. Martina Pinková

Státní zdravotní ústav

Šrobárova 48

100 00 Praha 10

Ing. Věra Dvořáková, Ph.D.

e-mail: vera.dvorakova@szu.cz