Prevalence protilátek proti viru hepatitidy E v České republice – sérologický přehled

Souhrn

Cíl práce:
Zjistit prevalenci protilátek proti viru hepatitidy E (HEV) v populaci České republiky ve věku od 15 do 64 let a provést analýzu podle věku a pohlaví a zhodnotit přínos imunoblotového testu pro ověření specificity základního screeningového EIA testu.

Materiál a metody:
Pro studii byla využita séra z mnohoúčelového sérologického přehledu z roku 2001. K vyšetření anti-HEV IgG byl použit test enzymové imunoanalýzy (EIA) RecomWell HEV IgG (Mikrogen Diagnostik, SRN). Následné konfirmační vyšetření bylo provedeno imunoblotovým testem RecomLine HEV IgG/IgM (Mikrogen Diagnostik, SRN).

Výsledky:
EIA testem RecomWell IgG bylo vyšetřeno celkem 1715 sér a reaktivita anti-HEV IgG byla zjištěna u celkem 115 vzorků (6,7 %). U mužů bylo zjištěno 58 reaktivních sér (6,7 %) a u žen 57 (6,6 %). Prevalence anti-HEV IgG s věkem stoupá z hodnoty 3,5 % ve věkové skupině 15–24letých na 16,8 % ve skupině 55–64letých.

Závěry:
Na základě sérologického přehledu byla zjištěna séroprevalence protilátek proti viru hepatitidy E v České republice ve věkové skupině 15–64 let. Celková séroprevalence v přehledu činila 6,7 %, přepočtená na počet osob v ČR pak 8,6 %. Prevalence anti-HEV stoupá s věkem s maximem 16,8 % ve věkové skupině 55–64 let. Nebyl zjištěn rozdíl v prevalenci podle pohlaví. Použití imunoblotového testu RecomLine IgG pro ověření výsledků vyšetření protilátek anti-HEV třídy IgG v séroprevalenční studii nelze jednoznačně hodnotit jako přínosné.

KLÍČOVÁ SLOVA:
virus hepatitidy E – anti-HEV – prevalence – EIA – imunoblot

ÚVOD

Virus hepatitidy E (HEV) je řazen do rodu Hepevirus z čeledi Hepeviridae. Jeho genom tvoří jednořetězcová (+) RNA délky 7,2 kb, která obsahuje tři kódující oblasti ORF1, ORF2 a ORF3. Jsou známy čtyři genotypy (gt) infikující člověka HEV 1 až 4 [1], které mají rozdílnou geografickou distribuci [2]. Genotyp 1 se vyskytuje převážně v Asii a severní Africe, genotyp 2 v Mexiku a Jižní Americe, genotyp 3 v Evropě a Severní Americe a genotyp 4 v jihovýchodní Asii. HEV gt1 a gt2 se vyskytují zejména v oblastech s nízkou úrovní hygieny a šíří se fekálně orální cestou, převážně kontaminovanou vodou. Genotyp 3 a 4 se šíří hlavně zoonoticky [3]. Rezervoárem jsou domácí i divoká zvířata, nejčastěji prase domácí i divoké a spárkatá zvěř. K přenosu většinou dochází požitím nedostatečně tepelně zpracovaného masa, ale uplatňuje se i fekálně orální přenos. Možný je i přenos krví např. transfuzí nebo injekční aplikací drog [4].

HEV vyvolává u člověka asymptomatickou infekci nebo manifestní onemocnění, které zpravidla probíhá jako akutní hepatitida, končící úzdravou. U imunokompromitovaných osob může dojít k perzistenci viru a chronickému onemocnění [5].

Laboratorní diagnostika virové hepatitidy E (VHE) je založena na stanovení protilátek IgM a IgG proti HEV, případně stanovení HEV RNA [6]. Sérologické diagnostické testy využívají syntetické peptidy nebo rekombinantní proteiny odvozené z kódujících oblastí ORF2/ORF3. HEV má jeden sérotyp, a proto se v diagnostických testech vyskytují antigeny odvozené od různých genotypů.

Protilátky anti-HEV IgM dosahují zpravidla vysokých hladin již v době objevení klinických příznaků a vymizí ve většině případů po 32 týdnech [6]. Protilátky anti-HEV IgG dosahují nejvyšších hodnot většinou čtyři týdny po objevení symptomů. Pro prevalenční studie je důležitá informace o dlouhodobém přetrvávání protilátek IgG. Literárních údajů však není mnoho a doba přetrvávání protilátkové odpovědi není přesně známa. Chadha M. S. et al. potvrdili přetrvávání anti-HEV IgG pět let po infekci u všech vyšetřovaných osob [7], zatímco Rapicetta M. et al. za stejnou dobu jen u 37 % [8]. Khuroo et al. zjistili, že 47 % osob má prokazatelné anti-HEV IgG protilátky ještě 14 let po prožité VHE [9].

K výrazným epidemiologickým charakteristikám virové hepatitidy E, které by se měly odrazit i v datech o séroprevalenci anti-HEV protilátek, je nemocnost podle věku a pohlaví. Nemocnost VHE v ČR s věkem výrazně narůstá a maxima dosahuje ve věkových skupinách 50–69 let – graf 1(EPIDAT). Dlouhodobě je pozorován vyšší výskyt VHE u mužů než u žen – graf 2 (EPIDAT). Cílem naší studie bylo zjistit prevalenci protilátek proti HEV v populaci České republiky ve věkových skupinách od 15 do 64 let, provést analýzu podle věku a pohlaví a zhodnotit přínos imunoblotového testu pro ověření specificity základního screeningového EIA testu.

MATERIÁL A METODY

Pro určení prevalence protilátek proti viru hepatitidy E třídy IgG (anti-HEV IgG) v České republice byla využita séra z mnohoúčelového sérologického přehledu z roku 2001. Séra byla získána náhodným výběrem od osob z běžné populace bez známek horečnatého onemocnění a byla uchovávána v alikvotech v sérové bance Centra epidemiologie a mikrobiologie SZÚ při teplotě -20 °C. Pro prevalenční studii bylo použito 1 715 vzorků sér osob ve věku 15–64 let, z nichž 48,2 % bylo mužů a 51,8 % žen.

K vyšetření anti-HEV IgG byl použit test enzymové imunoanalýzy (EIA) RecomWell HEV IgG (Mikrogen Diagnostik, SRN). Doplňkové následné konfirmační vyšetření bylo provedeno imunoblotovým testem RecomLine HEV IgG/IgM (Mikrogen Diagnostik, SRN). Oba testy byly provedeny a výsledky vyhodnocovány podle postupu uvedenému v návodu výrobce.

Statistické hodnocení bylo provedeno programem STATA v. 9.2, Stata Corp. LP, College Station, TX, USA, χ 2 testem nebo Armitageovým testem. Hodnoty p < 0,05 byly považovány za statisticky významné. Údaje o nemocnosti VHE podle věku a pohlaví byly získány ze systému hlášení vybraných infekčních onemocnění EPIDAT.

VÝSLEDKY

EIA testem RecomWell IgG bylo vyšetřeno celkem 1 715 sér prevalenční studie a reaktivita anti-HEV IgG byla zjištěna u celkem 115 vzorků (6,7 %), z nich podle kritérií výrobce bylo 13 hraničně reaktivních v tzv. šedé zóně. U mužů bylo zjištěno 58 reaktivních vzorků (6,9 %) a u žen 57 (6,6 %). Výsledky výskytu v jednotlivých věkových skupinách jsou uvedeny celkem a zvlášť pro muže a ženy, v absolutních počtech i relativně v tabulce 1.

Prevalence anti-HEV IgG s věkem stoupá z hodnoty 3,5 % ve věkové skupině 15–24letých na 16,8 % ve skupině 55–64letých. Statistické hodnocení lineárního trendu vzestupu přes jednotlivé věkové skupiny provedené Armitageovým testem vykazuje výsledek vysoce statisticky významný (p < 0,001), tzn. že trend je prokazatelný. Nárůst prevalence anti-HEV IgG s věkem je v souladu s údaji o nárůstu nemocnosti v závislosti na věku, který ukazuje graf 1. Rozdíl v celkové prevalenci anti-HEV IgG u mužů (6,9 %) a žen (6,9 %) není statisticky významný (p = 0,8188). Ani ve věkové skupině 25–34letých, kde byla zjištěna největší odlišnost hodnot prevalence mezi muži (9,3 %) a ženami (5,1 %), není tento rozdíl statisticky významný (p = 0,2931). Graf 2 ukazuje, že od roku 2001 je setrvale zaznamenávána vyšší nemocnost virovou hepatitidou E u mužů než u žen a tento rozdíl je v jednotlivých letech vždy statisticky významný.

Graf 3 ukazuje podíl (%) anti-HEV IgG reaktivních nálezů z počtu vyšetřených testem EIA podle okresů v ČR.

K ověření specifity výsledků anti-HEV IgG byl použit imunoblotový test RecomLine IgG. Ze 1 715 vzorků souboru bylo testem RecomLine IgG vyšetřeno 115 vzorků reaktivních a též 68 vzorků negativních v EIA testu RecomWell IgG. Ze 115 reaktivních vzorků byl výsledek konfirmačního testu pozitivní u 75 vzorků (65,2 %), u 40 vzorků tj. 34,8 %,se reaktivita výsledku EIA testu konfirmačním testem nepotvrdila. RecomWell IgG je test kvalitativní, u něhož je reaktivní výsledek vymezen hodnotou S/CO, tj. poměrem extinkce vzorku a hladiny pozitivity větším než 1. Hodnota S/CO však vyjadřuje míru reaktivity vzorku. V souboru anti-HEV IgG reaktivních sér byly zaznamenány hodnoty S/CO v intervalu 1–11. Nejčetnější byly S/CO hodnoty v rozmezí 1–1,99 tj. hraniční pozitivity (49/115) a hodnoty 2–2,99, tj. slabé pozitivity (25/115) dohromady 74/115 (64,3 %). Podíl výsledků potvrzených testem RecomLine v závislosti na hodnotě S/CO u vzorků pozitivních v testu RecomWell je uveden v tabulce 2. Z tabulky vyplývá, že v kategorii hraničních EIA výsledků S/CO 1–1,99 imunoblotový test potvrdil jen 18, tj. 36,7 % EIA pozitivních výsledků. Pro hodnoty S/CO 2–3,99 shoda výsledků vzrostla na 76,0 %, pro S/CO ≥ 4 je shoda s jednou výjimkou 100%.

Imunoblotovým testem RecomLine bylo vyšetřeno i 68 vzorků negativních v EIA testu RecomWell IgG. U 59 sér byl výsledek imunoblotového testu rovněž negativní, ale u 9 vzorků (13,2 %) byl výsledek pozitivní. Výsledek dovyšetření těchto 9 vzorků dvěma dalšími EIA testy DiaPro IgG (Diagnostic BioProbes s.r.l., Italy) a MP HEV ELISA IgG (MP Diagnostics, Singapore) byl rovněž negativní. Specificitu výsledků imunoblotového testu nebylo u těchto 9 vzorků možné dále ověřit. Z uvedených výsledků je zřejmé, že byly zjištěny výrazné rozdíly mezi EIA testem RecomWell IgG a imunoblotovým testem RecomLine IgG, které nelze hodnotit jen jako rozdíly v citlivosti testů. Použití imunoblotového testu RecomLine IgG pro ověření výsledků vyšetření protilátek anti-HEV třídy IgG v séroprevalenční studii nelze jednoznačně hodnotit jako přínosné.

Celkový výskyt protilátek anti-HEV IgG v celém souboru 1715 sér osob ve věku 15–64 let na podkladě vyšetření EIA testem RecomWell IgG je 6,7 %. Počet vzorků v sérologickém přehledu v jednotlivých věkových skupinách a v podílu mužů a žen neodpovídá zcela zastoupení ve skutečné populaci ČR, proto byly výsledky z jednotlivých věkových skupin na skutečné počty podle údajů Ústavu zdravotnických informací a statistiky (ÚZIS) přepočítány. Celková prevalence anti-HEV IgG protilátek po přepočtení ve věkové skupině 15–64 let je 8,6 % (95% interval spolehlivosti je 4,4–15,0 %). Pokud se zohlední i výsledky konfirmačního vyšetření imunoblotovým testem RecomLine IgG, pak celková přepočtená prevalence ve věkové skupině 15 až 64 let je 5,4 % (95% interval spolehlivosti je 2,2–11,0 %).

DISKUSE

Přítomnost samotných protilátek anti HEV IgG je znakem prožité infekce. Vzhledem k tomu, že v ČR není k dispozici očkování, nemohou být protilátky důsledkem vakcinace.

Bylo zjištěno, že mezi výsledky získanými dostupnými diagnostickými testy na protilátky anti-HEV IgG jsou značné rozdíly [10, 11]. S touto variabilitou testů, která může velmi výrazně ovlivnit hodnoty prevalence, je potřeba počítat při porovnávání dat s údaji zjištěnými v různých studiích. Výsledky studií prováděné novějšími testy mohou být 3–5násobně vyšší ve srovnání s hodnotami prevalence získanými staršími testy. Například prevalence anti-HEV v jihozápadní Anglii zjištěná testem „první generace“ byla 3,6 %, avšak při použití novějšího citlivějšího testu činila 16 % [12]. Sérologické diagnostické testy využívají proteiny odvozené z kódujících oblastí ORF2/ORF3. I při genotypové rozdílnosti má HEV jeden sérotyp [13]. V diagnostických testech se využívají antigeny odvozené od HEV různých genotypů, ale není prokázáno, že by tato skutečnost měla podstatný vliv na citlivost a specifitu testů. Ukazuje se, že lepší vlastnosti mají testy využívající rekombinantní proteiny než syntetické peptidy [14]. V současnosti nejcitlivější test Wantai HEV využívá rekombinantní protein (PE2) spontánně tvořící homodimery nebo polymery, což výrazně podporuje jeho antigenicitu oproti monomerním formám [12]. Analytickou citlivost testů na stanovení anti-HEV IgG lze stanovovat a porovnávat na podkladě referenčního preparátu WHO [15] vytvořeném Národním institutem pro biologické standardy a kontrolu (NIBSC).

V Evropě se prevalence protilátek proti HEV může výrazně lišit jak mezi státy, tak v rámci jednotlivých zemí i při použití shodných nebo porovnatelných testů. Často citovaný je rozdíl v prevalenci v jižní a severní Francii, či v jižní Anglii a Skotsku. Při mezinárodním srovnávání úrovně prevalence jsou častější údaje týkající se dárců krve. Séroprevalenční studie odpovídající sérologickým přehledům v ČR jsou ojedinělé. Dárce krve je možné považovat za skupinu relativně blízkou obecné populaci. Publikovaná data u dárců krve, získaná vysoce citlivým Wantai, jsou k dispozici např. z Německa, kde prevalence činí 29 %, Nizozemska 27 %, jihozápadní Anglie 16 %, jihozápadní Francie 52 % [16].

Hodnota prevalence zjištěná z námi provedeného sérologického přehledu pro populaci ve věku 15–64 let testem RecomWell je 6,7 %. Podle Strakové et al., která publikovala výsledky na základě téhož sérologického přehledu pouze ze dvou okresů ČR, avšak testem DiaPro, byla prevalence 5,7 % [17]. Prevalence anti-HEV protilátek s věkem narůstá, což je ve shodě s věkovou distribucí nemocnosti v ČR a odpovídá i zahraničním publikovaným údajům [18]. Prevalence protilátek u mužů a žen nebyla statisticky významně rozdílná ani celkově, ani v jednotlivých věkových skupinách, což je ve shodě s údaji některých Evropských zemí, např. Německa [19]. Tento nález však není v souladu s údaji o nemocnosti v ČR, která je od roku 2000 setrvale statisticky významně vyšší u mužů (viz graf 2). Graf 3 ukazující geografickou distribuci podílu pozitivních výsledků anti-HEV IgG podle okresů nelze porovnávat s údaji o nemocnosti v důsledku velmi nízkého počtu hlášených případů VHE (13 případů) v roce 2001. Značná část reaktivních výsledků testem RecomWell IgG (34,8 %) se imunoblotovým testem RecomLine IgG nezkonfirmovala. To je překvapivé zjištění v případě, že oba testy jsou od shodného výrobce. Výsledky uvedené v tabulce 2 ukazují, že naprostá většina výsledků nepotvrzených imunoblotovým testem patří do skupiny hraničních či slabých v EIA testu (interval S/CO 1–2,99). Uvedené výsledky je nesnadné vysvětlit jen vyšší specificitou imunoblotového testu, s ohledem na skutečnost, že vyšetření 68 vzorků negativních v RecomWell IgG testu vedlo ke zjištění pozitivity imunoblotovým testem u 9 vzorků (13,2 %), přičemž hodnoty S/CO u uvedených vzorků nebyly blízké hladině pozitivity (CO). Těchto 9 vzorků bylo negativních i při vyšetření dvěma dalšími EIA testy DiaPro a MP. RecomLine je jediným komerčním imunoblotovým testem, proto je obtížné specifitu těchto nálezů déle ověřit.

Při vyhodnocování séroprevalenčních dat získaných na podkladě výsledků EIA testů doplněných o konfirmační vyšetření je proto namístě opatrnost. To potvrzuje např. studie testující soubor dárců krve paralelně třemi EIA testy a imunoblotovým testem, kdy byla prevalence zjištěná testem MP Diagnostics 4,9 %, testem Dia.Pro 4,2 % a testem Fortress 21,8 % a imunoblotovým testem RecomLine byly výsledky testů MP Diagnostics a Dia.Pro potvrzeny v 80 %, ale výsledky testu Fortress v 42,3 % [20].

ZÁVĚR

Na základě sérologického přehledu byla zjištěna séroprevalence protilátek proti viru hepatitidy E v České republice ve věkové skupině 15–64 let. Celková séroprevalence v přehledu činila 6,7 %, přepočtená na počet osob v ČR pak 8,6 %. Prevalence anti-HEV stoupá s věkem s maximem 16,8 % ve věkové skupině 55–64 let. Nebyl zjištěn rozdíl v prevalenci podle pohlaví. Použití imunoblotového testu RecomLine IgG pro ověření výsledků vyšetření protilátek anti-HEV třídy IgG v séroprevalenční studii nelze jednoznačně hodnotit jako přínosné.

Poděkování

Studie byla podporována Interní grantovou agenturou Ministerstva zdravotnictví, projekt č. NT/13884/2012.

Do redakce došlo dne 8. 3. 2016.

Adresa pro korespondenci:

RNDr. Vratislav Němeček, CSc.

Státní zdravotní ústav

Šrobárova 48

100 42 Praha 10

e-mail: vratislav.nemecek@szu.cz