MONITOR aneb nemělo by Vám uniknout, že...

HEPATOPATOLOGIE

...skupina intraduktálních papilárních neoplazií žlučových duktů reprezentuje spektrum jednotek s rozdílnými klinicko-patologickými rysy

Ačkoliv je koncept intraduktálních biliárních papilárních neoplazií (IPBN) obecně uznáván, není doposud vypracována standardizovaná histologická definice. Dle recentní WHO klasifikace tumorů trávicího systému (4 ed., 2010) jsou IPBN charakteristické dilatovanými žlučovými dukty, vyplněnými papilární či vilózní biliární neoplazií pokrývající jemné fibrovaskulární stromální papily. Některé cholangiokarcinomy (CC) však rovněž vykazují intraduktální papilární růst, a to zvláště v oblasti extrahepatických duktů. Nabízí se tedy otázka, zdali všechny neoplazie, tradičně nazývané „papilární cholangiokarcinomy“, náleží do spektra IPBN, nebo je zapotřebí mezi těmito lézemi rozlišovat. Nejednotný názor panuje i mezi patology.

Skupina japonských autorů se ve srovnávací klinicko-patologické studii, publikované v prosincovém čísle Histopathology, zaměřila právě na tento problém. V souboru vlastních i konzultačních pacientů s primárními biliárními neoplaziemi (s vyloučením tumorů žlučníku a nodulárních karcinomů distálních žlučovodů) zachytili celkem 52 tumorů s papilárními intraduktálními formacemi, které rozdělili do provizorní skupiny klasického typu IPBN (25 případů) a papilárního cholangiokarcinomu (27 případů), ke kterým pro srovnání použili 27 případů typických cholangiokarcinomů bez papilární struktury.

Pro zařazení mezi IPBN byla určující pravidelná monomorfní papilární architektonika s tenkými stromálními papilami, nebo absence invaze. Název „papilární cholangiokarcinom“ byl použit pro invazivní tumory s makroskopicky predominantním intraduktálním růstem a mikroskopickou komplexní papilární či papilotubulární architektonikou s nepravidelným větvením a tloušťkou papil, nápadnou solidní nebo tubulární komponentou. Některé případy z této skupiny mohou reprezentovat i intraduktální extenzi (kancerizaci) invazivního karcinomu. U žádné z obou skupin nebyla přítomna chronická duktální léze typu PSC či hepatolitiázy. Nepapilární typické CC pak vykazovaly nodulární růst s převážně tubulární mikroarchitektonikou. Dalšími celkově sledovanými patologickými znaky byla přítomnost intraduktální nekrózy, makroskopicky patrná mukosekrece, hloubka invaze a typ diferenciace nádorových elementů (pankreaticko- biliární, intestinální, gastrický a onkocytární).

Obě hlavní sledované skupiny lézí se signifikantně lišily v několika parametrech. IPBN byly převážně zachyceny v intrahepatálních (52 %) a hilových (32 %) duktech; 72 % vykazovalo makroskopickou mukosekreci, méně nápadnou celulární atypii (přes zařazení všech případů minimálně do stupně high grade dysplazie). Nejčastěji byl přítomen pankreaticko-biliární typ diferenciace (48 %), následovaný intestinálním, gastrickým a onkocytárním. 60 % případů reprezentovalo neinvazivní či mikroinvazivní (<2 mm) léze.

Papilární CC byly přítomny v duktech extrahepatálních (70 %) a hilových (30 %), s minimální makroskopickou mukosekrecí (7 %), nápadnější celulární atypií; výraznou predominancí pankreatickobiliárního typu (74 %), minoritním intestinálním a absencí gastrického či onkocytárního typu; s častější tubulární (81 % vs. 24 % u IPBN) a kribriformní komponentou (56 % vs. 4 %), stejně jako přítomností nekrózy (59 % vs. 12 %). V 96 % papilárních CC byla zachycena intra-, či extramurální invaze. Nebyl prokázán signifikantní rozdíl mezi incidencí metastáz v LU mezi IPBN a papilárními CC.

Byly zachyceny rovněž odlišnosti v imunofenotypu obou skupin, s typickým profilem MUC6+/ CK20 – (72 %) u IPBN oproti absenci tohoto imunofenotypu u papilárního CC. Prognóza pacientů s IPBN, zvláště pětileté přežití bez rekurence, byla výrazně lepší než u případů s papilárním CC (72 % vs. 36 %), a zařazení léze do skupiny papilárního CC představovalo nezávislý faktor signifikantně korelující s rekurencí nádoru. Skupiny papilárních a nepapilárních CC se lišily v méně charakteristikách než papilární CC ve srovnání s IPBN.

Otázkou zůstává interpretace získaných výsledků. Obě hlavní sledované skupiny mohou představovat pouze odlišné subtypy ve spektru skupiny IPBN, obdobné podskupinám užívaným v klasifikaci pankreatických intraduktálních papilárních mucinózních neoplazií (léze hlavního duktu a léze vedlejších duktů). Autoři se však přiklánějí k možnosti zařazení IPBN a papilárního cholangiokarcinomu jako samostatných jednotek. IPBN v tomto pojetí by pak byl obdobou pankreatického IPMN, zatímco papilární cholangiokarcinom by reprezentoval jednu z variant cholangiokarcinomu.

Zdroj:

Fujikura K et al. Comparative clinicopathological study of biliary intraductal papillary neoplasms and papillary cholangiocarcinomas. Histopathology 2016; 69(6): 950-961.

- V. Žampachová -

DERMATOPATOLOGIE / HEMATOPATOLOGIE

... anaplastický veľkobunkový lymfóm môže po liečbe brentuximabom stratiť expresiu CD30

Netradične si v dermatopatologickom Monitore dovoľujeme upriamiť pozornosť na kazuistiku. Autori popisujú prípad pacienta s CD30-pozitívnym / ALK-negatívnym anaplastickým veľkobunkovým lymfómom (anaplastic large cell lymphoma - ALCL), ktorý bol liečený brentuximabom vedotinom, čo je anti-CD30 protilátka konjugovaná s antimitotickou látkou monometyl auristatin E, schválená americkou FDA na liečbu perzistujúceho alebo relabujúceho Hodgkinovho lymfómu a ALCL. U 44-ročného pacienta bola diagnostikovaná systémová forma ALK-negatívneho ALCL s postihnutím lymfatických uzlín, kostnej drene a kože. Lymfóm bol v čase diagnózy CD30, CD3, TIA-1 a Granzým B -pozitívny a CD15, ALK-1, CD20, PAX-5, CD4, CD8 a CD56 -negatívny. Po iniciálnej štandardnej terapii ochorenie perzistovalo a preto bola zahájená liečba brentuximabom. Odpoveď na túto liečbu bola celkom dobrá, neskôr sa však u pacienta objavili viaceré kožné a podkožné infiltráty, ktoré boli biopticky vyšetrené. Išlo o difúzne lymfoidné infiltráty CD3 pozitívnych a CD4, CD8, ALK-1 a CD30 negatívnych buniek. Vzhľadom na diskrepanciu expresie CD30 medzi pôvodným nádorom a rekurentným ochorením bolo vyslovené podozrenie na novovzniknutý sekundárny T-bunkový lymfóm. Negativita CD56 a EBV vylúčila možnosť NK/T-bunkového lymfómu a chýbajúca expresia TCR-gamma diagnózu gamma-delta T-bunkového lymfómu. Porovnanie klonality prvej biopsie a recidívy bohužiaľ nebolo možné. Napriek tomu bola recidíva (aj vzhľadom na identickú morfológiu, vrátane „hallmark cells“) považovaná za identickú lymfoprolife ráciu, iba so stratou expresie CD30, následkom liečby brentuximabom. Tento fenomén je dobre známy z liečby CD20-pozitívnych lymfómov anti-CD20 protilátkou (Rituximabom), kde môže dôjsť k strate expresie CD20 v nádorových bunkách. V tejto kazuistike ide o prvý dokumentovaný prípad straty expresie CD30 v lymfómových bunkách následkom anti-CD30 liečby. Zmenený imunofenotyp môže byť príčinou diagnostických rozpakov alebo chyby s následnou nevhodnou zmenou v manažmente ochorenia. Vzhľadom na skutočnosť, že brentuximab je testovaný aj v liečbe ďalších CD30-pozitívnych lymfoproliferácií (lymfomatoidná papulóza, kožný ALCL, Mycosis fungoides a Sézaryho syndróm), je nutné na fenomén straty expresie CD30 po tejto cielenej liečbe pamätať.

Zdroj:

Al-Rohil RN et al. Loss of CD30 expression after treatment with brentuximab vedotin in a patient with anaplastic large cell lymphoma: a novel finding. J Cutan Pathol 2016; 43(12): 1161-1166.

- M. Švajdler ml. -

 CYTODIAGNOSTIKA

… pro jaro 2018 je připravována nová klasifikace tyreoidální cytopatologie

Mezinárodní klasifikace tyreoidálních cytologií navržená před deseti lety (2007) a publikovaná v roce 2010 (1) - The Bethesda System for Reporting Thyroid Cytopathology (TBSRTC) - se stala nejužívanějším mezinárodním klasifikačním systémem v cytopatologii štítné žlázy. Použití TBSRTC doporučila i American Thyroid Association (ATA) při revizi doporučených postupů v roce 2015 (3).

Reklasifikace neinvazivních folikulárních uzlů s jádry podobnými papilárnímu karcinomu (NIFTP) ovlivnila stanovená rizika malignity i diagnostická kritéria kategorií III – atypie neurčeného významu / folikulární léze neurčeného významu (AUS/FLUS), IV – podezření z folikulární neoplazie / folikulární neoplazie (SFN/FN) a V – podezření z malignity. Nejen tato okolnost, ale i celý souhrn studií publikovaných v letech 2010-2016 s užitím TBSRTC se staly motivací k uspořádání mezinárodního sympozia na téma aktualizace TBSRTC na 19. mezinárodním cytologickém kongresu v Jokohamě.

Přehled připravovaných změn:

Obecné charakteristiky TBSRTC

Nontyreoidální nozologické jednotky: náhodně zachycené ve štítné žláze (intratyreoidální paragangliom, solitární fibrózní tumor a další) nebudou mít specifickou kategorii, doporučuje se užít obecný systém hlášení.

Rizika malignity budou rekalkulována s ohledem na NIFTP. Existence této jednotky posílí konzervativní přístupy v kategoriích III a IV. Do zpráv se doporučuje zmiňovat v indikovaných případech možnost NIFTP.

Označení diagnostických kategorií: i když se panel expertů shodl v názoru, že ideální jsou názvy nezdvojené, současná situace tří kombinovaně nazvaných kategorií (ND / Unsat - nediagnostický / nedostatečný vzorek, AUS/FLUS, FN/SFN) se již ve většině laboratoří vžila.

Měly by být užívány se specifikací.

Kontrola kvality: vedle nezpochybnitelné cytohistologické korelace se doporučují jako parametry diagnostické kvality laboratoře procento AUS/FLUS nálezů, popř. AUS/FLUS poměr k nálezům maligním.

K jednotlivým diagnostickým kategoriím

Nediagnostický / nedostatečný vzorek: kritéria pro nátěry zůstanou, je třeba doplnit pro liquid based cytology (LBC). V souladu s ATA postupy bude doporučen kratší rebioptický interval s upozorněním na rizika interferujících změn postaspiračních.

Benigní: bude obohacena LBC obrazová dokumentace.

AUS/FLUS: panel expertů doporučuje subklasifikovat, jaderná atypie má v této kategorii zřetelně vyšší riziko malignity, než ostatní. Pro redukci této kategorie doporučuje přesunout hraniční vzorky do nediagnostických.

FN/SFN: pro možnou záměnu s kategorií V – podezření z malignity je navrhováno verbalizovat SFN nikoli jako podezření („suspicious“), ale jako nasvědčující – („suggestive of“). Vzhledem k existenci NIFTP se kategorie rozšíří o folikulární léze s jadernými znaky papilárního karcinomu. Pro onkocytární léze bude opuštěn (konečně!) termín Hürthleho buňky ve prospěch onkocytů.

SFM – podezření z malignity: do diferenciální diagnózy bude přidán málo diferencovaný karcinom. Doporučeno bude v této kategorii molekulární testování – zejména RAS, THADA, BRAFK^601E pozitivní a BRAFV^600E negativní. Podle doporučených postupů ATA jsou pacienti se sonograficky suspektními uzly > 4 cm a pozitivními výsledky mutací BRAFV^600E , Tert-promoter, p53 kandidáty na totální tyreoidektomii, a to i s vědomím, že část tumorů následně může být NIFTP.

Papilární karcinomy: bude doplněna obrazová dokumentace pro LBC, popsány speciální varianty- i když subklasifikace na cytologické úrovni není nutná. Podrobněji bude popsána cytologie folikulární varianty – FVPTC mající vztah k NIFTP. Lze předpokládat přesun FVPTC do kategorie suspektních nálezů, aby nenarostly falešné pozitivity.

Medulární karcinomy: budou rozpracovány podrobněji morfologické překryvy s onkocytárními folikulárními lézemi a jinými neuroendokrinními tumory.

Málo diferencované a nediferencované karcinomy: na scénu vstupuje molekulární testování (TERT, MAPK, p53), zatím bez vlivu na prognózu.

Metastázy, lymfomy: bude rozšířeno spektrum orgán indikujících imunocytochemických postupů (např. PAX87, GATA3) a informace o následných klinických postupech.

Lze tedy konstatovat, že mezinárodní standardizace a aktualizace cytopatologických postupů a diagnostických kategorií a diferenciální diagnostiky spolu s integrací molekulární patologie probíhá v paralele s rozvojem histopatologické diagnostiky.

Zdroje:

1. Ali SZ et al. The Bethesda System for Reporting Thyroid Cytopathology. Definitions, Criteria and Explanatory Notes. Springer 2010.

2. Pusztaszeri M et al. The Bethesda System for Reporting Thyroid Cytopathology: Proposed modifications and updates for the second edition from an international panel. Acta Cytologica 2016; 60: 399-405.

3. Haugen BR et al. 2015 American Thyroid Association Management Guidelines for Adult Patients with Thyroid Nodules and Differentiated Thyroid Cancer: The American Thyroid Association Guidelines Task Force on Thyroid Nodules and Differentiated Thyroid Cancer. Thyroid 2016; 26(1): 1-133.

- J. Dušková -

PATOLOGIE GIT

... kanabinoidy mohou pacientům s dlaždicobuněčným karcinomem jícnu škodit

Kanabinoidový receptor 1 (CB1R) může být aktivován vazbou endogenních ligandů anandamidu a 2-arachidonoylglycerolu, exogenním přírodním delta-9-tetrahydrocannabinolem, případně společensky přijatelnějším a nudnějším klinicky užívaným kanabidiolem.

V citované studii byla analyzována overexprese CB1R jako prediktivního markeru metastatického postižení u pacientů s dlaždicobuněčným karcinomem jícnu. Overexprese byla imunohistochemicky detekována v 61,4 % případů, přičemž byla signifikantně asociována s přítomností lymfatických i orgánových metastáz a se špatnou prognózou. Toto zjištění může mít význam zejména v případě časných stadií s infiltrací muscularis mucosae, případně povrchových vrstev submukózy, kdy není jednoznačné, zda je dostačující endoskopická resekce, nebo je nutné přistoupit k radikálnímu chirurgickému řešení. Overexprese CB1R v endoskopické biopsii by tak mohla sloužit jako biomarker pravděpodobného rozsevu tumoru a tedy i nutnosti radikálního řešení.

Z pohledu středoevropského patologa, který se pohříchu setkává spíše s pokročilejšími stádii karcinomu jícnu, je však zajímavější druhý výstup této studie. In vitro totiž byla prokázána inhibice proliferace buněčných linií dlaždicobuněčného karcinomu jícnu po aplikaci AM251 - antagonisty CB1R. Z toho vyplývá, že paliativní aplikace kanabinoidů, které jsou agonisté tohoto receptoru, by mohla vést k progresi tumorů s overexpresí CB1R a zejména v případě užití kanabidiolu by tak měla pouze negativní efekt.

Zdroj:

Naoki et al. Overexpression of cannabinoid receptor 1 in esophageal squamous cell carcinoma is correlated with metastasis to lymph nodes and distant organs, and poor prognosis. Pathol Int 2017; 67(2):83-90.

- O. Daum -

UROPATOLOGIE

... byla publikována další fakta podporující názor, že papilární renální karcinom je výrazně heterogenní jednotka - údaje z rozsáhlé molekulárně-genetické studie

Již dlouhou dobu se vedou diskuze na téma papilárního renálního karcinomu (PRK). Tradiční dělení na podtyp 1 a podtyp 2 s doporučením, že všechny PRK lze prakticky beze zbytku zařadit do jedné či druhé skupiny (1), je opakovaně zpochybňováno. Popsána byla řada podtypů či variant, které nelze ani při nejlepší vůli přiřadit k první či druhé podskupině PRK, jako například varianta solidní, onkocytická, tvořená světlobuněčnými elementy, bifazická squamoidní a další.

Ve WHO klasifikaci 2016 je opatrně naznačeno, že nejspíše onkocytický PRK by mohl být novou podjednotkou a rovněž, že existují PRK, které neodpovídají ani tzv. typu 1, ani typu 2. Stejně tak byla jasně definována skupina PRK spojených s hereditární leiomyomatózou, popř. s defektem genu pro fumarát hydratázu, o kterých jsme čtenáře na stránkách Monitoru již informovali (2).

V lednovém čísle New England Journal of Medicine vyšla v roce 2016 rozsáhlá genetická studie, která přispívá podstatnou měrou do výše nastíněné diskuze. Autoři analyzovali 161 primárních PRK pomocí celogenomového sekvenování, analýzy chromozomálních aberací, methylačního statusu, proteomické analýzy, mRNA a mikroRNA analýz. Podrobné rozepisování výsledků je mimo rámec tohoto krátkého sdělení, avšak z výsledků jasně vyplývá genetická heterogenita PRK. Zdá se, že tzv. PRK typ 1 je poměrně kompaktní jednotka. Naopak PRK typ 2 se rozpadá na minimálně (!) 3 geneticky odlišné léze (3).

Je tedy jasné, že nás v budoucnu čeká další atomizace jednotky PRK na varianty či podtypy, často s velmi odlišným biologickým pozadím a zejména klinickým chováním.

Zdroje:

1. Eble JN et al. Tumours of the urinary system and male genital organs. Pathology and genetics. Lyon, IARC Press, 2004.

2. Moch H et al. Tumours of the urinary system and male genital organs. Pathology and genetics. Lyon, IARC Press, 2016.

3. Linehan et al. Comprehensive Molecular characterization of papillary renal cell carcinoma. N Engl J Med 2016; 374 (2): 135-145.

- O. Hes -

PATOLOGIE ORL OBLASTI

… průkaz karboanhydrázy VI lze využít v diferenciální diagnostice nádorů slinných žláz

Diagnostika a diferenciální diagnostika některých nádorů slinných žláz může být obtížná. Jedním z příkladů je odlišení sekretorického karcinomu mamárního typu (MASC) od karcinomu z acinárních buněk (ACC), zejména pokud tento obsahuje pouze malé množství serózních buněk se zymogenními granuly, jejichž přítomnost je definujícím znakem ACC. Pokud nelze využít molekulárně genetické vyšetření k průkazu přítomnosti translokace t(12;15) (ETV6-NTRK3), která je specifická pro MASC, nezbývá než se spolehnout na pečlivé zhodnocení nádoru v klasickém barvení, případně využít imunohistochemii (IHC).

Autoři Hsieh et al. se v rámci výzkumu využití IHC v diferenciální diagnostice MASC a ACC zaměřili na doposud nepříliš používaný marker karboanhydráza VI (CA6), která je exprimována v serózních acinárních buňkách normální slinné žlázy, kde se podílí na regulaci pH. Zatímco u ACC byla CA6 exprimována ve všech 28 nádorech, tak všech 14 případů MASC bylo negativních. Senzitivita a specificita exprese CA6 pro diagnózu ACC byla srovnatelná s DOG1, jehož pozitivita je v rámci tumorů slinných žláz typická rovněž pro tento nádor.

Závěrem autoři konstatují, že kombinaci markerů CA6 a DOG1 lze s výhodou využít v diagnostice ACC a jeho odlišení od jiných nádorů slinných žláz.

Zdroj:

Hsieh MS et al. Carbonic anhydrase VI: a novel marker for salivary serous acinar differentiation and its application to discriminate acinic cell carcinoma from mammary analogue secretory carcinoma of the salivary gland. Histopathology 2016; 68(5): 641-647.

- J. Laco -

GYNEKOPATOLOGIE

… možná existuje třetí etiopatogenetická cesta vedoucí k dlaždicobuněčnému karcinomu vulvy

Dlaždicobuněčné karcinomy (SCC) vulvy mohou být etiologicky spojené s infekcí vysoce rizikovými typy lidského papilomaviru (HPV) anebo vznikají v důsledku mutací především tumor supresorového genu TP53 v terénu chronických dermatóz (lichen sclerosus a lichen simplex chronicus). Typickými zástupci HPV pozitivních SCC vulvy jsou bazaloidní a kondylomatózní (warty) karcinomy. Početnější skupinu HPV negativních nádorů spojených s genovými mutacemi TP53 představují keratinizující SCC, za jejichž prekurzor je považována vulvární intraepiteliální neoplázie diferencovaného typu (d-VIN). Část HPV negativních keratinizujících SCC vulvy nicméně nevykazuje mutace TP53 a není v době diagnózy asociována s konvenční prekancerózní lézí, naopak souvisí s heterogenním spektrem atypických vericuformních proliferací, které byly již dříve popsány jako vulvární akantóza s porušenou diferenciací, veruciformní lichen simplex chronicus a atypická veruciformní hyperplázie. Společnou vlastností této skupiny dlaždicobuněčných lézí je akantóza, veruciformní růst s abnormální diferenciací keratinocytů a absence výraznějších cytologických atypií a známek HPV infekce. Asociace těchto proliferací s keratinizujícím SCC budí podezření, že se může jednat o další samostatnou skupinu prekanceróz vulvy. K ověření této hypotézy analyzovali autoři metodami sekvenování nové generace molekulární pozadí celkem 11 atypických veruciformních lézí a porovnali spektrum genetických změn se 14 případy HPV negativních keratinizujících SCC vulvy. Metodika umožnila hodnocení stavu celkem 300 genů, mezi které spadaly například TP53, PIK3CA, HRAS a EGFR.

Základním rozdílem mezi atypickými veruciformními proliferacemi a keratinizujícími SCC byla frekvence mutací genu TP53. Zatímco u atypických veruciformních lézí nebyly mutace TP53 pozorovány vůbec, mezi keratinizujícími SCC byly detekovány v 79 % případů. Na podkladě této skutečnosti autoři naznačili diametrální rozdílnost atypických veruciformních proliferací a d-VIN, která by měla dle současných definic jako prekurzor keratinizujících SCC vykazovat mutace TP53. Další odlišností bylo zastoupení aktivačních mutací genu PIK3CA, které byly pozorovány v 73 % atypických veruciformních lézí a pouze u 14 % keratinizujících SCC vulvy. Autoři tímto definovali charakteristický genotyp atypických veruciformních proliferací (mutantní PIK- 3CA / wild type TP53) a usoudili, že právě mutace PIK3CA může být zodpovědná za vznik této skupiny lézí a za jejich progresi v keratinizující SCC. Dysfunkce signální cesty PI3K/AKT/mTOR tedy může být třetí, avšak nejméně častou příčinou vzniku SCC vulvy. Z onkogynekologického hlediska by se jednalo o zásadní objev, neboť by k terapii PIK3CA mutovaných lézí vulvy bylo možno využít cílené terapie PI3K inhibitory. Pro terminologické odlišení atypických veruciformních lézí vulvy od d-VIN autoři navrhli provizorní diagnostickou jednotku „diferencovaná exofytická vulvární intraepiteliální léze“, která by měla být definována následujícími znaky:

• veruciformní architektonika,
• abnormální diferenciace keratinocytů,
• chybění výraznějších atypií bazální vrstvy keratinocytů,
• nepřítomnost mutací TP53,
• vysoká frekvence mutací PIK3CA.

Autoři si jsou vědomi faktu, že jejich publikace nepřináší jednoznačné přímé důkazy pro kauzální spojení mezi atypickými veruciformními lézemi a keratinizujícími SCC. Tuto hypotézu mohou potvrdit nebo vyvrátit až detailní studie genetického pozadí vícečetných simultánních anebo sukcesivních dlaždicobuněčných proliferací u jednotlivých pacientek. A já si neodpustím kritickou poznámku o účelnosti zavádění dalšího termínu do již tak značně nepřehledného názvosloví dlaždicobuněčných lézí dolního ženského pohlavního systému, když lze stejně dobře použít stávající označení „atypická veruciformní proliferace“.

Zdroj:

Watkins JC et al. Differentiated exophytic vulvar intraepithelial lesions are genetically distinct from keratinizing squamous cell carcinomas and contain mutations in PIK3CA. Mod Pathol 2017; 30(3): 448-458.

- P. Škapa -

PULMOPATOLOGIE

... tzv. tekutá biopsie je slibná metoda, má své limitace a histopatologickou diagnostiku plicních nádorů v nejbližší době určitě nenahradí

O takzvané „tekuté biopsii“ (liquid biopsy – LB) se poslední dobou píše mnoho jak v odborném tisku, tak i v bulvárních masmediích, naposledy velmi nešťastný článek plný polopravd až vyložených nepravd publikovala Mladá Fronta Dnes. Vzhledem k tomu, že obdobné zkušenosti jsou zjevně i mimo Česko, vyšel v oficiálním periodiku College of American Pathologists článek reprezentující stanovisko předních pulmopatologů k otázce LB a jejího významu pro diagnostiku plicních nádorů. V přehledném článku shrnujícím výhody a nevýhody LB jsou podrobně rozebrány metodiky a principy LB. V souladu s publikovanými poznatky se autoři podrobněji zaobírají metodikou detekce volné cirkulující nádorové DNA, detekci nádorové RNA a cirkulujících nádorových buněk považují v současné době nevhodnou k rutinní diagnostice. Součástí práce je i přehledná tabulka shrnující senzitivitu, specificitu a konkordanci LB a histopatologické primodiagnózy v různých publikovaných studiích. Je zřejmé, že z původních jásavých a farmaceutickými firmami výrazně protěžovaných studií dosahujících téměř 100% ve všech parametrech se dostáváme k reálnějším hodnotám. Pomineme-li studie dosahující extrémně nízkých hodnot (15% senzitivita tedy opravdu není nic moc), většina solidních publikací se v poslední době ustálila na 60-70% senzitivitě LB v diagnostickém procesu tzv. nemalobuněčných plicních karcinomů. Publikované doporučení tedy ve shodě s objektivními daty vyznívá poněkud skepticky pro zastánce LB. Tato metoda má své místo v diagnostice rezistentních mutací genu EGFR, najmě T790M, u pacientů po selhání biologické léčby, ale v současné době díky nízké senzitivitě nejde o metodiku určenou pro rutinní primodiagnostiku plicních karcinomů.

Je zjevné, že i v USA a zemích EU je debata o LB v plném proudu a že se uplatňují tlaky různých zájmových skupin o upřednostnění LB před klasickou histopatologickou diagnostikou. Argumenty místy až hysterických zastánců LB především ze strany klinických lékařů a molekulárních genetiků jsou jasné: jde o metodu neinvazivní, stačí odběr krve, diagnóza je rychle a můžeme předpokládat snížení míry heterogenity nádorové populace. Argumenty proti LB jsou často bagatelizovány, ale se zásadními námitkami týkající se především nízké senzitivity (1/3 případů není málo!) a hlavně nemožnosti určit histopatologický typ nádoru se vypořádat nedovedou, jak o tom svědčí moderní formát diskuze „pros“ a „cons“ v Translational Lung Cancer Research.

Všechny tyto argumenty byly zohledněny i v jednání panelu zástupců Společnosti českých patologů, České onkologické společnosti a České pneumologické a ftizeologické společnosti v Hradci Králové, které bylo místy poněkud dramatické a někdy až úmorně dlouhé, ale nakonec vyústilo v souhrnný konsenzus postupů při diagnostice tzv. nemalobuněčných plicních karcinomů. Kromě postavení LB jako metody doplňkové v případech nemožnosti provedení molekulárně patologické analýzy z biopsie či rebiopsie jde o materiál komplexní, postihující i další biomarkery a je publikován na našich webových stránkách.

Závěrem lze tedy říci, že LB není žádnou „likvidační biopsií“ pro histopatologickou diagnostiku plicních nádorů, jak by si někteří jedinci zřejmě přáli, ale že se jedná o vhodnou doplňkovou metodiku v rukách odborníka komplexního oboru molekulární patologie. Teď už jen, aby plátci tento fakt zohlednili v úhradách…

Zdroje:

1. Scholl LM. et al. Liquid Biopsy in Lung Cancer: A Perspective From Members of the Pulmonary Pathology Society. Arch Pathol Lab Med 2016; 140(8): 825-829.

2. Ilié M et al. Pros: Can tissue biopsy be replaced by liquid biopsy? Transl Lung Cancer Res 2016; 5(4): 420-423.

3. Mino-Kenudson M. Cons: Can liquid biopsy replace tissue biopsy? - the US experience. Transl Lung Cancer Res 2016; 5(4): 424-427.

4. http://www.patologie.info/aktuality.php?zobrazit=480

- R. Matěj -

ORTOPEDICKÁ PATOLOGIE

… nodulární fasciitis je spojena s rekurentní translokací genu USP6

Nodulární fasciitis (NF) je známý imitátor sarkomu s potencí poplést klinického lékaře, vyvolat podezření svým obrazem na zobrazovacích metodách a vzhledem k buněčnosti, reaktivním změnám fibroblastů a vyšší mitotické aktivitě svést na scestí rovněž patologa.

Kolegové z Nového Zélandu prověřovali diagnostickou užitečnost přestavby genu USP6, která byla popsána jako rekurentní a specifická změna u NF v roce 2011. Gen USP6 je mapován na chromozom 17p13 a kóduje ubikvitin specifickou proteázu 6, enzym s různými buněčnými funkcemi, zahrnujícími obměnu bílkovin, zánětlivou signalizaci, a buněčnou transformaci. Po identifikaci pravidelně přítomné přestavby genu USP6 byl rovněž přehodnocen pohled na biologickou povahu NF, původně považovanou za reaktivní proces pro její tendenci ke spontánní regresi. NF je nyní považována za nádor a posloužila jako model nového konceptu „tranzientní neoplazie“.

Autoři shromáždili 20 případů, z nichž 7 bylo klasifikováno jako jistá nodulární fasciitis, 4 byly zařazeny pod hlavičku možná NF a devět případů bylo označeno jako „určitě nikoli“ NF. Poté provedli FISH na řezech z parafinových tkáňových bloků s užitím sondy detekující přestavbu USP6. Ze sedmi případů jisté NF bylo šest pozitivních a ze čtyř možných NF byl jeden pozitivních. Z devíti případů „určitě ne“ NF, pestrého souboru sklerotické tukové nekrózy, proliferativní fasciitis, inflamatorního myofibroblastického tumoru, synoviálního sarkomu, myofibroblastomu, fibromatózy, fyloidního tumoru, polypu hlasivky a celulárního dermatofibromu, nebyl pozitivní žádný.

Rozpoznání nodulární fasciitis tak už není pouze morfologickou záležitostí, identifikace přestavby genu USP6 pomocí FISH z formol-parafinového materiálu může být užitečným pomocníkem v případech, kdy je diagnóza NF obtížná, např. v malých vzorcích, u případů s variantní histomorfologií, či u lézí s neobvyklou manifestací, např. v hlubokých měkkých tkáních či značné velikosti.

Zdroj:

Shin C et al. USP6 gene rearrangement in nodular fasciitis and histological mimics. Histopathology 2016; 69(5): 784-791.

- K. Veselý -

PATOLOGIE MĚKKÝCH TKÁNÍ

... clear cell sarkóm obličky má analóg medzi detskými nediferencovanými sarkómami tvorenými malými okrúhlimi bunkami

Nediferencované sarkómy včasného detského veku, tvorené malými okrúhlymi (prípadne vretenitými) bunkami tvoria heterogénnu skupinu nádorov. Po vylúčení jednotiek so známym genetickým podkladom (napr. Ewingov sarkóm alebo infantilný/ kongenitálny fibrosarkóm), väčšina týchto ostatných „Ewing- like“ nádorov zostáva neklasifikovateľná („undifferentiated round cell sarcoma“, URCS). Vďaka pokrokom v molekulovej genetike sa však aj v tejto skupine nádorov postupne darí nachádzať nové jednotky (napr. okrúhlobunkové sarkómy s CICDUX4, BCOR-CCNB3 alebo EWSR1-NFATc2 translokáciou).

Svetlobunkový sarkóm obličky (clear cell sarcoma of kidney, CCSK) je veľmi vzácny agresívny tumor včasného detského veku. Relatívne nedávno boli v CCSK popísané rekurentné genetické aberácie. Vo väčšine prípadov je prítomná interná tandemová duplikácia exónu 16 génu BCOR, menej častá je translokácia t(10;17) (q22.3; p13.3) s výslednou fúziou génov YWHAE-NUTM- 2B/E. Tieto aberácie sú vzájomne prakticky exkluzívne. Ďalším vzácnym nádorom, ktorý sa vyskytuje v tejto vekovej skupine a navyše má aj podobnú histomorfológiu je primitívny myxoidný mezenchymálny tumor (primitive mesenchymal tumor of infancy, PMTI). Ide o extrarenálny nádor vyskytujúci sa takmer výlučne v oblasti trupu, končatín a hlavy a krku. Na základe vstupného prípadu okrúhlobunkového sarkómu panvy u 4-mesačného chlapca s potvrdenou translokáciou YWHAE-NUTM2B/E sa americkí autori rozhodli vyšetriť prítomnosť translokácií typických pre CCSK na súbore URCS (22 prípadov) a PMTI (7 prípadov) u pacientov vo veku do jedného roka, s cieľom zistiť, či sa nejedná o príbuzné jednotky. YWHAE-NUTM2B/E translokácia bola síce zistená už iba v jednom ďalšom prípade URSC, 9 z 22 prípadov (41%) však vykazovala tandemovú duplikáciu BCOR. Táto aberácia bola prítomná aj v 6 zo 7 PMTI (86%).

Genetické zmeny typické pre CCSK teda boli zistené približne v polovici okrúhlobunkových sarkómov u detí vo veku do jedného roka. Okrem identickej genetickej aberácie mali tieto sarkómy histomorfológiu, ktorá sa prekrývala s CCSK. Nádory boli tvorené lobulmi monotónnych okrúhlych, ovoidných alebo menej často hviezdicovitých buniek s jemným chromatínom, s jemnou „chicken-wire“ kapilárnou sieťou a variabilne myxoidnou strómou a možno ich považovať za extrarenálny analóg CCSK. Dôkaz aberácii typických pre CCSK v časti URCS otvára možnosti skúmania biologického potenciálu tejto skupiny nádorov, s možnosťou použitia aktuálnych liečebných protokolov určených pre CCSK, ktoré signifikantne zlepšili prognózu tohto agresívneho ochorenia.

Zdroj:

Yu-Chien K et al. Recurrent BCOR internal tandem duplication and YWHAE- NUTM2B fusions in soft tissue undifferentiated round cell sarcoma of infancy: Overlapping genetic features with clear cell sarcoma of kidney. Am J Surg Pathol 2016; 40(8): 1009-1020.

- M. Švajdler ml. - 

HEMATOPATOLOGIE

… v rámci γδ-pozitivních kožních T-lymfomů je nutné odlišit vzácnou epidermotropní variantu

Primární kožní γδ-pozitivní T-lymfom (gdCTCL) se poprvé objevil v klasifikaci WHO v roce 2008 a přežil i její „apdejt“ v roce 2016. Narůstající znalosti o tomto nádoru nás však nutí revidovat původní názor, že se výlučně jedná o agresivní nádor s maximálně třetinovým pětiletým přežitím. Ani histologický obraz není homogenní, ale lze odlišit nádory subkutánní, dermální a velmi vzácné epidermotropní. Unikátní sestavu 13 pacientů s epidermotropním gdCTCL porovnává se sedmi pacienty s dermálním/subkutánním lymfomem článek v AJSP.

Epidermotropní gdCTCL (EgdCTCL) postihl 6 žen a 7 mužů s mediánem výskytu 57 roků (1,4 až 83 roků). Postižení bylo obvykle mnohotné nebo dokonce difuzní, u devíti pacientů se někdy v průběhu onemocnění zvažovala klinická diagnóza mycosis fungoides (MF) a u pěti se nakonec klinici k této diagnóze přiklonili. Při diagnóze bylo v nižším klinickém stádiu podle ISCL/EORTC pět pacientů (2x IA a 3x IB), ostatní případy byly klinicky pokročilejší (6x IIB, 1x IIIA a 1x IVA). Lymfadenopatie byla zastižena u pěti pacientů, u dvou byla histologicky potvrzena infiltrace lymfomem, u jednoho pacienta bylo ověřeno postižení plíce, kostní dřeň nebyla infiltrována.

V celkem dvaceti sedmi biopsiích byl definujícím nálezem dobře patrný epidermotropismus, ve čtvrtině vzorků byly zastiženy Pautrierovy pseudoabscesy, běžné bylo postižení kožních adnex. Dermální postižení bylo prokázáno v méně než polovině vzorků, častěji bylo intersticiální než difuzní. Obrazu dominovaly středně velké, jen mírně atypické buňky. Nádor exprimoval CD3 a TCRγ, často byly alespoň parciálně pozitivní granzym B a TIA-1. CD4 bylo negativní, pouze třetina případů exprimovala CD8, zhruba polovina případů CD5 a CD7, někdy se zastihly CD30-pozitivní buňky, CD56 bylo většinou negativní.

Pacienti s nižším klinickým stádiem při diagnóze měli indolentní klinický průběh bez progrese do vyšších stádií, naopak z pacientů s pokročilým stádiem čtyři progredovali a z nich tři zemřeli.

Nálezy autoři porovávali se sedmi případy převážně dermálního/subkutánního gdCTCL (DSgdCTCL), které diagnostikovali u 3 žen a 4 mužů s mediánem věku 64 roků (24 až 87 roků). Pacienti s dostupnými údaji byli v době diagnózy 3x ve stádiu IIB a 1x ve stádiu IVB. U dvou byla zastižena lymfadenopatie bez histologického potvrzení nádorové infiltrace, jeden pacient měl systémové postižení s gastrointestinální masou, jeden pacient měl infiltraci dřeně prokázanou morfologicky a jeden pouze molekulárně.

Histologicky dominovalo denzní difuzní postižení dermis a podkoží s typickým obklopováním adipocytů, karyorhexí a někdy i angiocentricitou. U pokročilých nádorů byl poměrně často zastižen epidermotropismus, někdy i s Pautrierovými pseudoabscesy. Nádorové elementy byly obvykle středně velké až větší, mírně až výrazně atypické. Nádor exprimoval CD3, TCRγ, granzym B, TIA-1 a CD56, obvykle byl negativní při průkazu CD4, CD8, CD5 a CD7, častá byla příměs CD30-pozitivních buněk.

Protože všech pět pacientů s DSgdCTCL, u kterých byly dostupné údaje o sledování, zemřelo, je prognóza tohoto onemocnění statisticky významně mnohem horší než u EgdCTCL.

EgdCTCL musí být odlišen od prognosticky nepříznivého primárního kožního CD8-pozitivního agresivního epidermotropního cytotoxického lymfomu, který exprimuje TCRß. Při četnějším výskytu CD30-pozitivních buněk je v diferenciální diagnóze lymfomatoidní papulóza (zejména vzácný typ D s expresí TCRγδ). Otevřená je otázka vztahu k mycosis fungoides. Existuje vlastně γδ-pozitivní MF a jak je od sebe rozpoznat? Ale co je ještě důležitější - pokud se EgdCTCL ve srovnatelném klinickém stádiu chová jako MF, neměl by být i terapeutický přístup obdobný? Nesmíme jen zapomínat na to, že na rozdíl od klasického MF se EgdCTCL častěji prezentuje v pokročilejším klinickém stádiu a identifikace TCRγδ-pozitivního fenotypu u epidermotropního kožního lymfomu je tedy známkou potenciálně agresivnějšího chování nádoru.

Zdroj:

Merrill BA et al. Primary cutaneous T-Cell lymphomas showing gamma-delta (γδ) phenotype and predominantly epidermotropic pattern are clinicopathologically distinct from classic primary cutaneous γδ T-cell lymhomas. Am J Surg Pathol 2017; 41(2): 204-215.

- V. Campr -

GYNEKOPATOLOGIE

… správně nastavená kritéria adekvátnosti vzorků pro materiál kyretáže/biopsie endometria u postmenopauzálních pacientek mohou významně ovlivnit riziko falešně negativních nálezů

Většina (asi 75 %) karcinomů endometria se vyskytuje u postmenopauzálních žen a častou první známkou onemocnění je postmenopauzální krvácení. Pacientky kromě vyšetření zobrazovacími metodami často podstupují i diagnostický odběr tkáně (kyretáž, biopsii), jehož cílem je vyloučit či potvrdit přítomnost nádorového procesu či jiné patologie. Výtěžnost biopsií/kyretáží endometria u postmenopauzálních pacientek je však poměrně nízká. V tomto kontextu vyvstává otázka, které vzorky již označit jako „nediagnostické“ či „neadekvátní“ s ohledem na vyloučení případné závažné patologie. Předchozí studie některých autorů ukázaly, že insuficientní vzorky se vyskytují asi u 15 % žen starších 60 let, a asi u 10 % z nich se při následném vyšetření prokáže karcinom endometria. Jiné práce však udávají jako nedostatečných až 50 % vzorů. Otázkou tedy zůstává, jaké kritérium pro hodnocení adekvátnosti vzorku použít.

Autoři z University of Massachusetts se zaměřili na retrospektivní analýzu 1768 vzorků u žen starších 60 let s ohledem na jejich kvantitativní aspekt. Ze vzorků vybrali ty, které byly hodnoceny jako insuficientní (266) a dostatečné s diagnózou atrofie (974). Všechny tyto vzorky pak rozdělili do 3 skupin na podkladě počtu fragmentů / útržků endometria (definovaných jako „endometrial strips“ dle jejich dat sestávající asi z 50-300 epitelových buněk). Kategorie s minimálním počtem tkáně obsahovala ≤ 10 těchto fragmentů / útržků; kategorie střední 11-30; kategorie s hojným materiálem > 30. Negativní prediktivní hodnota byla kalkulována na podkladě následného 12 měsíčního follow-up. Během tohoto období 43 %, 82 % a 63 % žen z každé skupiny podstoupilo další proceduru zahrnující biopsii, kyretáž či hysterektomii. Ve skupině s minimálním množstvím tkáně byla v průběhu follow-up diagnostikována malignita u 19 % pacientek (23/123); ve skupině se středním množstvím tkáně u 0,5 % pacientek (3/653) a ve skupině s objemným materiálem u žádné pacientky (0/98). Negativní prediktivní hodnota pro jednotlivé kategorie tedy byla 81 %, 99,5 % a 100 %.

Závěrem autoři konstatují, že použití jimi navrhovaného kvantitativního kritéria pro neadekvátní vzorky umožní selekci asi 15 % všech pacientek, které profitují z opakovaného a časného následného vyšetření. Naopak nedochází ke zbytečnému zatěžování pacientek i personálu tam, kde to není nutné.

Zdroj:

Sakhdari A et al. Endometrial samples from postmenopausal women: A proposal for adequacy criteria. Int J Gynecol Pathol 2016; 35: 525-530.

- P. Dundr -

NEUROPATOLOGIE

... invázia do mozgu v inak benígnych meningiómoch nie je jednoznačným prediktorom ich rekurencie

Podľa súčasnej WHO klasifikácie mozgových nádorov z roku 2016 je meningióm II. stupňa malignity definovaný špeciálnym histologickým podtypom (chordoidný a svetlobunkový) alebo atypickými histologickými znakmi. Atypický meningióm sa diagnostikuje pri zvýšenej mitotickej aktivite (4 alebo viac mitóz na 10 veľkých zorných polí), inváziou do mozgového tkaniva alebo tromi či viacerými z nasledujúcich znakov: plachtovitý rast, zvýšená celularita, prominentné jadierka, nekrózy, malé bunky s vysokým nukleo-cytoplazmatickým pomerom. Invázia do mozgového tkaniva, ako samostatné kritérium pre II. stupeň malignity v inak benígnom meningióme, je uvádzaná ako novinka klasifikácie z roku 2016, i keď už v klasifikácii z roku 2007 sa v kapitole o meningiómoch píše, že invazívny histologicky benígny meningióm zodpovedá rekurenciou a mortalitou II. stupňu malignity. Histologicky benígne meningiómy nevykazujú genetické zmeny meningiómov vyššieho stupňa malignity a objavili sa práce spochybňujúce kritérium invazivity, preto autori štúdie retrospektívne hodnotili invazivitu do mozgu ako kritérium progresie meningiómov v dvoch veľkých nemeckých centrách. Do práce bolo zaradených 229 meningiómov, z toho bolo 149 s atypickými histologickými znakmi a/alebo so zvýšenou mitotickou aktivitou, 19 meningiómov špeciálneho histologického typu (chordoidný, svetlobunkový) a 61 invazívnych, ale inak benígnych meningiómov. Meningiómy so zvýšenou mitotickou aktivitou, atypickými histologickými znakmi, chordoidné a svetlobunkové meningiómy boli asociované so skrátením intervalu bez progresie. Z „benígnych invazívnych“ meningiómov len 4 vykázali rekurenciu. Z nich 3 mali niektoré ďalšie histologické alebo klinické osobitné črty (vysoké Ki67, parciálna chirurgická resekcia a neurofibromatóza II. typu). Z analýzy vyplýva, že invázia do mozgového tkaniva v inak benígnom meningióme je pravdepodobne nedostatočná pre zaradenie do II. stupňa malignity. Kritérium invazivity, ktoré niektorí používajú už takmer 10 rokov, môže rozhodnúť o adjuvantnej terapii, preto by mala byť táto kontaverzia čo najskôr vyriešená.

Zdroj:

Baumgarten P et al. Brain invasion in otherwise benign meningiomas does not predict tumor recurrence. Acta Neuropathol 2016; 132(3): 479-481.

- B. Rychlý -

KARDIOPATOLOGIE

… existují novinky v problematice myokarditid

Pro kardiology je zlatým standardem diagnózy myokarditidy endomyokardiální biopsie. Provádí se z pravé komory, z levé komory, či z obou. Diagnostická výtěžnost závisí především na počtu odebraných vzorků. Je třeba si být vědom možnosti jen ložiskového postižení myokardu a s tím spojené falešně negativní diagnózy. Ke klasické histologii se dnes připojuje i imunohistochemická typizace infiltrujících leukocytů. Pro diagnózu myokarditidy byl stanoven požadavek nálezu více než 14 mononukleárních leukocytů, včetně více než 7 T-lymfocytů na 1 mm² vzorku. Součástí bioptického hodnocení musí být i pátrání po přítomnosti etiologického agens, nejčastěji metodou PCR. Mimochodem, v České republice jsou endemické oblasti výskytu borreliové myokarditidy.

Zánětlivou kardiomyopatií se rozumí myokarditida spojená s poruchou funkce levé komory, která má nejčastěji obraz dilatované kardiomyopatie. Myokarditida je v současnosti pokládána za nejčastější příčinu vzniku dilatované kardiomyopatie; téměř 50 % nemocných s dilatovanou kardiomyopatií má imunohistochemicky prokazatelnou myokarditidu.

Pro histopatologa je diferenciálně diagnostickým problémem, naštěstí vzácným vzhledem k raritě obou jednotek, rozlišení obrovskobuněčné myokarditidy a sarkoidózy srdce. Pro obrovskobuněčnou myokarditidu je charakteristická diagnostická trias: obrovské mnohojaderné buňky, difuzní zánětlivý infiltrát a nekrózy kardiomyocytů. Zánětlivý infiltrát obsahuje především T-lymfocyty, makrofágy a eozinofily; pokud se tvoří granulomy, jsou nepravidelně tvarované. Naopak pro sarkoidózu myokardu je typická tvorba dobře ohraničených granulomů, přičemž obrovské buňky mohou obsahovat Schaumannovy či asteroidní inkluze. Granulomatózní změny jsou provázeny fibrózou, jen málo aktivním zánětlivým infiltrátem a minimálním výskytem nekrózy kardiomyocytů. Sarkoidóza myokardu se pitvou či moderními zobrazovacími metodami prokáže až u 25 % nemocných se sarkoidózou jiného orgánu.

Zdroje:

1. Krejčí J. Myokarditidy a zánětlivá kardiomyopatie. Kardiol Rev Int Med 2015; 17(4): 288-294.

2. Kubánek M, Voska L. Obrovskobuněčná myokarditida a sarkoidóza srdce – update 2015. Kardiol Rev Int Med 2015; 17(4): 295-299.

- I. Šteiner -

IMUNOHISTOCHEMIE

… vícekanálová paralelní imunohistologie se stává technicky schůdnou pomocí hmotnostní spektrometrie

Asi každý, kdo se někdy hlouběji zabýval imunohistologií, pocítil potřebu detekovat několik proteinů paralelně na jednom řezu. Pokud to zkusil, většinou zjistil, že možnosti jsou v reálné praxi nevelké. U vícenásobných barvení pro procházející světlo jsme limitováni depozity barevných reakčních produktů, které silně omezí nebo znemožní vazbu dalších protilátek do stejné subcelulární lokalizace. V praxi je možné sledovat až čtyři antigeny paralelně, musí však mít odlišnou lokalizaci (jiná buněčná populace nebo buněčný kompartment – např. jádro, cytoplazma, membrány). Pokud použijeme detekci fluorescenční, padá omezení v lokalizaci, musíme však používat protilátky přímo značené, případně z odlišných zvířecích druhů, nebo barvit sekvenčně. Rovněž spektrum fluorochromů je v praxi omezené, zápasíme s autofluorescencí, blednutím barvení a artefakty. Nejpokročilejší technologie v tomto směru je Multiomyx od GE, již v této rubrice zmiňovaný. Přímá detekce proteinů v řezu hmotnostními spektrometry zatím rovněž nepřináší výsledky srovnatelné s kvalitně provedenou imunohistochemií po stránce morfologické korelace a schopnosti práce s formol-parafinovým materiálem.

Inovací, která mne zaujala (1) je kombinace těchto dvou přístupů. Antigeny jsou detekovány klasicky pomocí protilátek. Ty jsou přímo značeny izotopy kovů vzácných zemin, které se normálně v tkáních nevyskytují a slouží jako unikátní nepřekrývající se značka, detekovaná po odpálení spotu laserem pomocí hmotnostního spektrometru. Značek jsou k dispozici desítky, detekce může probíhat paralelně. Metoda pracuje s formolem fixovaným parafinovým materiálem a prostorové rozlišení je 300 nm, což poskytuje velmi slušnou morfologickou informaci. Nemusíme se zříci ani dobarvení hematoxylinem, ten je hmotnostní spektrometrií dobře detekován a výsledky jsou velmi přesvědčivé (2). Velkou výhodou je kromě absence pozadí a minimálního přesahu kanálů i dynamický rozsah měření o dva řády větší než u fluorescence. Je tedy možné vazebná místa přesně kvantifikovat zároveň pro abundantní a málo zastoupené proteiny. Je reálné např. změřit míru fosforylace proteinu na několika epitopech zároveň a to celé vymezit na specifickou buněčnou populaci. Nevýhodou je pomalé snímání (na současném stupni vývoje technologie čtvereční milimetry v řádu hodin) a rovněž nutnost mít k dispozici vysoce specifické protilátky ve formátu způsobilém pro značení (purifikované bez stabilizujících koloidů). Tyto překážky však může překonat další vývoj metody. Certifikované kity pro diagnostiku vztaženou k léčbě by na sebe v tom případě asi nenechaly dlouho čekat.

Multiparametrická stanovení poskytují unikátní možnosti hlubšího průniku do biologie tkáně (3). Multiplexní metoda s kovovými značkami a detekcí hmotnostním spektrometrem se mi jeví jako zatím nejvýznamnější pokrok v imunohistologii od zavedení tepelného oživení antigenů. Problémem může být náročný hardware. Budoucnost jako obvykle ukáže.

Zdroje:

1. Levenson RM et al. Immunohistochemistry and mass spectrometry for highly multiplexed cellular molecular imaging. Lab Invest 2015; 95(4): 397-405.

2. Angelo M et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nat Med 2014; 20: 436–442.

3. Bodenmiller B. Multiplexed Epitope-based tissue imaging for discovery and healthcare applications. Cell Syst 2016; 2(4): 225-238.

- R. Nenutil -

NEUROPATOLOGIE

… stanovení proliferačního indexu pomocí imunodetekce PHH3 u meningiomů je lepším prediktorem jejich rekurence, než stanovení mitotického indexu a proliferačního indexu pomocí imunodetekce MIB-1

V říjnovém čísle American Journal of Clinical Pathology přináší skupina autorů z norských pracovišť z Trondheimu zajímavou práci, která porovnává a hodnotí význam různých způsobů stanovení míry proliferace nádorových buněk na souboru 160 pacientů s diagnostikovaným meningiomem.

Autoři v uvedeném souboru, kromě dalších parametrů, stanovili mitotický index nádorů jako počet mitóz nádorových buněk v 10-ti zorných polích HPF (1 HPF = 0,16 mm²), dále pak proliferační index nádorů jako počet pozitivních jader v 1000 nádorových buněk v nejvíce mitoticky aktivních oblastech při detekci Ki-67 (MIB-1); stanovení PHH3 (phosphohistone H3) proliferačního indexu bylo provedeno obdobně, do celkového počtu pozitivních buněk však byly počítány pouze ty, které vykazovaly současně pozitivitu PHH3 a distinktní morfologii mitotické figury, takový postup umožnil eliminovat PHH3 pozitivní buňky v časné fázi mitotického cyklu.

Z celkového počtu 160 pacientů vykazovalo G1 morfologii 116 meningiomů a G2 morfologii 44 meningiomů; rekurentní onemocnění bylo zachyceno ve 30 případech (20 G1 nádorů a 10 G2 nádorů). Ze statistické analýzy výsledků vyplynulo, že jako nejvhodnější znak předpovídající rekurenci onemocnění se jeví proliferační index PHH3, při pozitivitě odpovídající ≥ 0,5% (tedy ≥ 5 PHH3 pozitivních mitóz/1000 nádorových buněk v místech s největší mitotickou aktivitou); ani mitotický index (nejméně 4 mitózy/10HPF), ani MIB-1 proliferační index (≥ 3% pozitivních nádorových buněk) nedosahovaly ve výsledcích statistické významnosti.

Předložená práce představuje podklad pro úpravu vyšetřovacích schémat meningiomů; zajímavá bude určitě i prospektivní studie s výše popsaným designem.

Zdroj:

Winther TL. et al. Phosphohistone-H3 proliferation index is superior to mitotic index and MIB-1 expression as a predictor of recurrence in human meningiomas. Am J Clin Pathol 2016; 146: 510-520.

- T. Jirásek -

NEFROPATOLOGIE

… ochrana mitochondrií může představovat novou cílovou strukturu při léčbě chronických onemocnění ledvin u obézních pacientů

Obezita představuje důležitý rizikový faktor při vývoji chronického onemocnění ledvin (CKD) a to nezávisle na přítomnosti hypertenze, diabetu nebo dyslipidémie. Primárním místem poškození ledvin u obézních jsou glomeruly, na počátku s jejich zvětšením a s expanzí mezangiální matrix a následně s kolapsy a s rozvojem glomerulosklerózy. Mechanismus, který je zodpovědný za vývoj CKD u obézních není přesně znám.

Studie týmu Suryi Seshan dokumentuje jako klíčové poškození mitochondrií (zdroje energie, ATP) v různých typech buněk ledvin u myší během diety s vysokým obsahem tuků. Autoři prokázali, že během 28 týdnů s dietou s vysokým obsahem tuků došlo k redukci velikosti mitochondrií a k úbytku membrán mitochondriálních krist v různých typech buněk; v podocytech, endoteliích v glomerulech a také v buňkách proximálních kanálků. Poškození mitochondrií vedlo k nahromadění kapek lipidů, k poškození endoplasmatického retikula a k apoptóze.

Tomuto stavu dokázali zabránit použitím protektivního peptidu SS31. SS31 je permeabilní tetrapeptid, antioxidant, který se specificky koncentruje na vnitřní membráně mitochondrií, v místě produkce volných radikálů. SS31 se selektivně váže na kardiolipin a předpokládá se, že tato vazba může ochránit mitochondriální kristy před stresem zamezením tvorby volných radikálů. Léčba SS31 zabránila akumulaci lipidů a následnému poškození mitochondrií ve všech typech ledvinných buněk. Odvrátila glomerulární a tubulární poškození.

Studie přináší experimentální důkaz, že dysfunkce mitochondrií hraje centrální roli v patogenezi onemocnění ledvin navozených dietou s vysokým obsahem tuků. Jde o objevení nového mechanismu u onemocnění ledvin doprovázejících obezitu, kdy mastné kyseliny navodí produkci volných radikálů. Vysoká hladina volných radikálů vede k oxidaci kardiolipinu a následně k poškození mitochondrií, které proto produkují více volných radikálů a vytváří se začarovaný kruh excesivní produkce volných radikálů, což prohlubuje další poškození mitochondrií a ohrožuje syntézu ATP. Vedle toho volné radikály také vedou k expresi prozánětlivých a profibrotických cytokinů.

Léčba SS31 odvrátila poškození a současně neměla vliv na hladinu cukru v krvi, krevní tlak ani na váhu zvířat a byla také dobře tolerována. Pokud projde SS31 klinickými testy, mohla by tato nebo podobná látka jako např. koenzym Q10 v budoucnu představovat renoprotektivní léčbu u pacientů s metabolickým syndromem.

Zdroj:

Szeto H et al. Protection of mitochondria prevents high fat diet-induced glomerulopathy and proximal tubular injury. Kidney Int 2016; 90(5): 997–1011.

- E. Honsová -