Nové potenciálne biomarkery pre predikciu preeklampsie

Souhrn

Cíl studie:

Rešerše současné literatury s cílem nalézt nové biomarkery, které by mohly v kombinaci se stávajícími metodikami přispět k včasnému záchytu preeklampsie. Pozornost byla věnována zejména biomarkerům detekovatelným metodami molekulární genetiky – mikroRNA (miRNA), dlouhým nekódujícím RNA (long non-coding RNA – lncRNA) a alteracím v metylacích promotorů genů, jejichž exprese je klíčová pro rozvoj PE.

Typ studie:

Review.

Název a sídlo pracoviště:

Ústav biologie a lékařské genetiky 1. LF UK a Všeobecné fakultní nemocnice v Praze.

Metodika:

Rešerše článků obsažených v databázi PubMed publikovaných do března 2018.

Výsledky:

U pacientek, u nichž došlo k vývoji preeklampsie, byly opakovaně zjišťovány zvýšené hodnoty miR-210, miR-155, miR-16 a miR-181a. Nižší hodnoty než u kontrol byly naopak nalézány v případě miR-223. Exosomy představují jeden z hlavních zdrojů mikroRNA v krvi – mohou pocházet jak z placenty, tak z krevních buněk samotných. Mezi lncRNA byly vytypovány zejména na úrovni tkáně placenty jako vhodné molekuly k dalšímu studiu LOC391533, LOC284100, CEACAMP8, RPAIN, SPRY4-IT 1 a lncRNA Uc.187 se zvýšenou expresí a MEG3, STOX2-IT3, lncRNA-ATB a MALAT-1 s expresí sníženou.

Alterace v metylaci promotorů rovněž na úrovni tkáně placenty byly nalezeny například u genů HLA-G, MTHFR, HERVWE 1, GNA12 nebo SERPINA3.

Závěr:

U všech výše zmíněných potenciálních biomarkerů lze nalézt jejich funkční vztah ke komplexnímu procesu etiopatogeneze PE. S ohledem na praktické využití se však jeví jako nejvhodnější pro rozšíření stávající palety biomarkerů miR-210 transportovaná v exozomech a vykazující zvýšené hladiny u PE v řadě dosavadních studií.

klíčová slova

preeklampsie, biomarkery, mikroRNA, dlouhé nekódující RNA, metylace promotorů

ÚVOD

Preeklampsia (PE) patrí medzi ochorenia vyskutujúce sa v priamej súvislosti s tehotenstvom, s nástupom po 20. týždni gravidity. PE postihuje 2–8 % tehotenstiev celosvetovo. Výskyt je najvyšší v multikultúrnych krajinách, ako je napríklad USA [24]. Incidencia PE v Českej republike je jednou z najnižších celosvetovo – 0,83 % v roku 2013 [13]. Aj napriek tomu je toto ochorenie zodpovedné za väčšinu predčasných pôrodov, morbiditu a mortalitu matky a plodu [24].

Tento patofyziologický stav je charakterizovaný nástupom hypertenzie (systolický krvný tlak 140 mm Hg, diastolický krvný tlak 90 mm Hg; namerané dvakrát za sebou v rozostupe štyroch hodín) a proteínúriou (300 mg za 24 hodín) [1, 24].

Napriek tomu, že stav podobný PE bol prvýkrát opísaný už starovekými Egypťanmi [1], nebolo poskytnuté presvedčivé objasnenie etiopatogenézie chorobného procesu, aj preto je PE nazývaná „chorobou teórií“ [37]. Existuje predpoklad, že vznik ochorenia je závislý na kombinácii viacerých rizikových faktorov, ako je vek, parita, doba medzi jednotlivými tehotenstvami, predchádzajúce PE či index telesnej hmotnosti [35].

Rozhodujúcim dejom pre zdravé tehotenstvo je prestavba špirálových artérií maternice. Pokiaľ je tento proces narušený, dochádza k zníženému prie­toku krvi na feto-maternálnom rozhraní v prvom trimestri gravidity [18]. Súčasná literatúra podporuje dvojfázovú modelovú hypotézu o patogenézii PE. Prvou etapou je slabá placentácia, ktorej výsledkom je placentárna hypoxia, čo vedie k vzniku trofoblastových „úlomkov“ a sekrécii škodlivých faktorov (sFlt1 – rozpustná tyrozin kináza 1 podobná fms, zápalové cytokíny, protilátky receptorov angiotenzínu-I), ktoré sú uvolňované do krvi matky [18]. Druhým štádiom ochorenia je materská odpoveď na abnormálnu placentáciu. Nerovnováha medzi škodlivými a prospešnými faktormi vedie k zápalovým reakciám a endoteliálnej dysfunkcii v mnohých systémoch (cievy, obličky, pečeň, mozog atď) [18].

PE možno ďalej subklasifikovať ako PE so skorým nástupom (EOPET – early-onset PE, pred 34. týždňom) a neskorým nástupom (LOPET – late-onset PE, po 34. týždni). Epigenetické profily v placentách EOPET a LOPET podporujú hypotézu, že obidve formy sú spôsobené rôznymi mechanizmami [14].

EOPET je ťažšou formou PE. Predpokladá sa, že je iniciovaná abnormálnou placentáciou, ktorá je spojená so zníženou perfúziou a so zvýšenou apoptózou trofoblastov [48]. LOPET je miernejšia forma, ktorá sa považuje za materinský syndróm. Obvykle sa spája s normálnym vývojom placenty a s predispozíciou matky, ako je hypertenzia alebo diabetes [48].

Skoré predikovanie PE by umožnilo včasnú liečbu, čím by došlo k zníženiu ohrozenia zdravia matky aj plodu. Klinické markery, ako sú krvný tlak, proteínúria a doplerovská ultrasonografia artérií v maternici, zostávajú najspoľahlivejšou metódou pri monitorovaní PE, avšak nemôžu byť použité v skorej diagnostike [29].

V súčastnosti sa ukazuje, že kombinácia klinických a biologických markerov by mohla zlepšiť detekciu PE. Biologické markery momentálne zahŕňajú imunologické faktory – cytokíny
(IL-6, IL-16, TNF, IFN, PPI3), angiogénne (PAPPA, AFP, PIGF, HtRA3) a antiangiogénne faktory
(sFItI, NGAL), ktoré majú zásadnú úlohu v patológii a etiológii PE [33]. Nevýhodami používania kombinácie markerov je ich nedostatočná diagnostická presnosť, ktorá sa pohybuje od 57,6 do 70,8 % [36] a neschopnosť rozlíšiť závažnosť PE či hodnotiť priebeh ochorenia [33].

Zvýšenie diagnostickej presnosti by mohla priniesť kombinácia s biomarkermi iného charakteru. Mnohé štúdie sa zameriavajú najmä na deregulované miRNA či lncRNA, ktoré sú do krvi matky transportované prostredníctvom exozómov, malých a stabilných nanovezikúl. Exozómy prítomné v krvi predstavujú neinvazívnu biopsiu ich pôvodného tkaniva [38]. Ďalším prístupom k dia­gnostike PE by mohla byt epigenetika, konkrétne použitie metylačného profilu podozrivých génov.

MIKRO RNA

MikroRNA (miRNA) patria do skupiny malých nekódujúcich RNA, ktoré regulujú génovú expresiu, primárne na posttranskripčnej úrovni. Ide o krátke (21–25 nukleotidov) jednoreťazcové RNA. Odhaduje sa, že regulujú expresiu 30 % všetkých ľudských génov [3], čím sa zúčastňujú takmer vo všetkých základných bunkových procesoch [50]. Viaceré štúdie preukázali, že ich aberantná expresia je spojená s mnohými patologickými stavmi [11, 12, 37].

V roku 2007 Pineles a kol. ako prví preukázali vzťah medzi PE a neobvyklou miRNA expresiou v placente [34]. Po tejto správe sa ich diagnostický potenciál ako špecifických molekulárnych markerov pre komplikácie súvisiace s tehotenstvom stali predmetom veľkého záujmu [10]. V rámci rešerše sa v publikáciách najčastejšie objavovala miR-210. Jej zvýšená expresia v PE tehotenstvách bola nameraná v 12 z nich.

Výsledky naznačujú, že práve miR-210 by mohla byť potencionálnym markerom PE, keďže jej zvýšená expresia bola nameraná v séru tehotných žien trpiacich na PE v porovnaní so zdravými kontrolami [2], a to už 8–12 týždňov pred objavením sa klinických symptómov [2].

MiR-210 bola identifikovaná ako miRNA indukovaná hypoxiou v rôznych bunkových typoch [16]. Výsledky štúdie, v ktorej sa taktiež podarilo preukázať up-regulovanú expresiu miR-210, a to nie len u pacientiek s PE, ale aj v trofoblastových bunkách kultivovaných za hypoxických podmienok, ukázali, že takáto hladina miR-210 inhibuje migráciu a invazívnosť trofoblastových buniek, a to potlačením expresie Ephrin-A3 a Homeobox-A9 [52].

Ďalšia práca, ktorá sa zaoberala nájdením spojenia medzi zvýšenou expresiou miR-210 a patologickými prejavmi PE, pracovala s faktom, že miR-210 sa podieľa na mitochondriálnej dysfunkcii u rôznych typoch rakovín [22]. V súlade s týmito zisteniami, autori zaznamenali v PE placentách zníženú hladinu komponentov dýchaciaho reťazca, či už na úrovni mRNA, alebo proteínu, a zvýšenú produkciu reaktivných foriem kyslíka (ROS) [31].

Na základe bioinformatickej analýzy funkčných génov pre miR-210 sa zistilo, že jedným z často sa objavujúcich cieľov je gén KCMF1 [27], ktorý podporuje proliferáciu, migráciu a invazívnosť buniek u rakovín epitelu [4]. To podporili aj výsledky štúdie, kroré preukázali, že gén KCMF1 je funkčným cieľom miR-210 v ľudských trofoblastoch [27].

Podobným príncípom bol odhalený aj ďalší cieľový gén miR-210, a to THSD7A, ktorý je pravdepodobne zapojený do modulácie invázie ľudských trofoblastových buniek [28].

Druhou najčastejšie sa vyskytujúcou miRNA v literatúre, ktorej expresia bola zvýšená v porovnaní s kontrolami, bola miR-155. miR-155 bola v roku 2007 v štúdii Pineles a kol. jednou zo siedmich up-regulovaných miRNA u pacientiek s PE + SGA (malý na svoj gestačný vek) [34].

V roku 2010 Zhang a kol. ako prví poskytli dôkaz, že miR-155 je pravdepodobne zapojená do patoganézie PE a zohráva úlohu v angiogenéze placenty. Výsledky preukázali, že cieľom miR-155 je gén pre angiogénny regulačný faktor CYR61 [51]. Neskôr tiež zistili, že cyklín D1 v bunkách HTR-8/SVneo podporuje migráciu a jeho umlčanie, spôsobené zvýšenou expresiou miR-155, znižuje ich migračnú kapacitu [7].

Ďalším možným funkčným cieľom miR-155, ktorý sa podarilo odhaliť, je gen eNOS (endotelová syntáza oxidu dusnatého). Aberantná expresia eNOS môže opäť znížiť migračné schopnosti trofoblastových buniek [23].

Tretími najčastejšie sa vyskytujúcimi miRNA boli miR-16 a miR-181a. V štúdiách, ktoré sa zamerali na miR-16 a jej úlohu u PE, sa zistilo, že nadmerne exprimovaná miR-16 inhibuje proliferáciu a migráciu dMSC (mezenchymálne kmeňové bunky pocházdajúce z decidua) a spôsobuje zastavenie bunkového cyklu v G0/G1 fázi prostredníctvom génu bunkového cyklu CCNE1, ktorý je jej funkčným cieľom. Zvýšená hladina expresie miR-16 taktiež ovplyvňuje migračnú schopnosť trofoblastových buniek (HTR-8 / SVneo bunky) a ľudských endotelových buniek z pupočnej žily, čím znižuje ich schopnosť tvoriť krvné cievy [43].

miR-181a je silno exprimovaná v kostnej dreni a týmuse. Môže modulovať diferenciáciu hematopoetických línií a má dôležitú úlohu pri vývoji T a B-buniek. Okrem toho existujú dôkazy, že miR-181a má tumor supresívne účinky. Kvôli týmto faktom nebolo prekvapením, keď sa objavila štúdia, ktorej výsledky preukázali, že miR-181a je regulátorom proliferácie a imunosupresívnych vlastností MSC (mesenchymal stem cells) [25].

V profiloch miRNA v PE tehotenstvách s aberantnou expresiou sa vyskytovali aj miRNA, ktorých hladina expresie bola znížená v porovnaní s kontrolami. V rámci zahrnutých štúdií sa najčastejšie objavila miR-223.

LONG NON-CODING RNAS (LNCRNAS)

Veľkú skupinu ncRNA tvoria >200 nukleotidov dlhé úseky RNA, ktoré sa nazývajú lncRNA [6]. Tento druh nekódujúcich RNA je len veľmi málo konzervovaný naprieč druhmi [20]. Po ich objavení panovala domnienka, že sú funkčne bezvýznamné. Avšak zakrátko sa zistilo, že čoraz viac lncRNA hrá kritickú úlohu pri rôznych poruchách [30], vrátane kardiovaskulárnych ochorení, rakoviny a neurodegeneratívnych ochorení [9].

Nedávne štúdie poukazujú na to, že lncRNA môžu byť jedným z faktorov, ktoré sa podieľajú na patofyziologických mechanizmoch u PE [9].

Medzi výrazne viac exprimované lncRNA u tehotných trpiacich na PE v porovnaní so zdravými kontrolami boli LOC391533, LOC284100 a CEACAMP8, RPAIN, SPRY4-IT 1, lncRNA Uc.187. Výsledkom analýzi, ktorej cieľom bolo zistiť vzájomné asociácie prvých troch spomínaných lnc-
-RNA a exprimovanej mRNA v biologických procesoch, bolo významné prepojenie s metabolizmom lipidov a sekundárnou imunitnou odpoveďou [9]. Nadmerná expresia RPAIN v HTR8/Svneo bunkových liniách viedla k inhibovaniu proliferácie, invazivity buniek a proteínu C1q, ktorý je dôležitý pre invázivitu trofoblastov a remodeláciu špirálových artérií [40]. V prípade SPRY4-IT 1 sa preukázalo, že zvýšená expresia môže mať negatívny vplyv na tvorbu bunkových tubulárnych sietí endotelia, teda na remodeláciu špirálových artérií [54]. Zvýšená hladina lncRNA Uc.187 podobne ako už spomínané lncRNA negatívne ovplyvňuje proliferáciu a invazívnosť buniek a zvyšuje ich apoptózu [5].

Do skupiny lncRNA, u ktorých bola preukázaná znížená koncentrácia v placentách PE tehotenstiev, patria MEG3, STOX2-IT3, lncRNA-ATB, MALAT-1. Pri zníženej expresii MEG3 dochádza k zvýšeniu apoptózy a k zníženiu migrácie buniek. Taktiež to môže mať dopad na reguláciu buniek v hladkom svalstve ciev počas remodelácie špirálových artérií [53]. LncRNA STOX2-IT3 pôsobí ako regulačný element alternatívneho zostrihu STOX2, ktorý je kandidátnym génom PE u fínskych pacientiek. V prípade, že táto intronová lncRNA chýba (experimentálna down-regulácia), alebo je defektná (pacienti s PE), dôjde k vystrihnutiu konzervovanej domény na C-konci v proteíne STOX2, čo ovplyvňuje jeho funkciu [32]. U lncRNA-ATB sa podarilo preukázať, že down-regulácia znížuje schopnosť proliferácie, invázie buniek a tvorbu dutých rúrok podobných kapiláram v HTR8/Svneo [26]. Znížená hladina lncRNA MALAT-1 opäť inhibuje proliferáciu, migráciu a invazívnosť buniek, spôsobuje zablokovanie bunkového cyklu v G0/G1 fázi a zvyšuje apoptózu buniek [19].

EPIGENETICKÉ MARKERY

Epigenetika zahŕňa zmeny v expresii genóv bez zmeny sekvencie DNA. Epigenetické značky sa stávajú trvalými až po diferencovaní bunky. Vo vývojových štádiách, ako aj u niektorých nádoroch dochádza k rozsiahlemu epigenetickému preprogramovaniu, ktoré má za následok odstránenie alebo zmenu epigenetických značiek [41].

Jedným z príkladov epigenetických značiek je DNA metylácia. Jedná sa o metyláciu, pridanie metylovej skupiny, cytozínu (CpG miesta). V dôsledku metylácie dochádza ku zmene funkcie regulačných sekvencií génu napr. v promótore, čo následne ovplyvňuje transkripciu génu [44].

Existuje množstvo štúdií, ktoré sa zaoberajú zmenou DNA metylácie u tehotenstiev trpiacich na PE. Niektoré sledovali metyláciu CpG u konkrétnych génov alebo skupiny génov, ktoré už boli spájané s PE.

Medzi skupinu génov, u ktorých bola zistená hypermetylácia promótoru u PE vzoriek v porovnaní s kontrolami, patrí napríklad gén HLA-G, ktorého zmeny v expresii môžu mať dopad na invazívnosť buniek trofoblastu prostredníctvom rôznych signálnych dráh [42], alebo gén MTHFR, ktorý kóduje 5,10-methylentetrahydrofolát reduktázu, jeden z kľúčových enzýmov v metabolizme homocysteínu (hcy). Niekoľko štúdií sa zhoduje na tom, že zvýšená hladina hcy úzko súvisí s PE [8]. Hypermetylácia promótoru bola zistená aj pre gén HERVWE 1, ktorý kóduje syncytín-1, proteín, ktorého znížená expresia je spojená s narušením štruktúry a funkcie sycýtia v PE placentách, ale aj s regulovaním proliferácie trofoblastu, apoptózy a potláčaním imunitných reakcií [15].

Medzi gény, u ktorých bola naopak preukázaná hypometylácia promótoru, patrí napríklad gén GNA12 [47] alebo gén SERPINA3, ktorého proteín je pravdepodobne špecifický inhibítor elastázy, ktorá hrá dôležitú úlohu v procese implantácie vajíčka, čo by mohla jeho zvýšená koncetrácia inhibovať. Takýto účinok by bol v súlade s akceptovaným názorom na patogenéziu PE a SERPINA3 by mohol byť pokladaný za gén korešpondujúci skôr s predisponujúcim stavom ochorenia ako so sekundárnym následkom [17].

Ďalším prístupom, ako ozrejmiť vplyv metylácie na patológické prejavy PE, je diferenciálna metylácia CpG oblastí v celom genóme a následná validácia vybraných génov. V rámci tejto skupiny štúdií boli nájdené ďalšie gény, ktoré majú odlišnú metyláciu. Hypermetylácia bola zistená v oblastiach génov zapojených do bunkovej signalizácie (gén WNT2), oplodnenia (gén SPESP1), signalizácie ROS (gén NOX5) a bunkovej adhézie (gén ALCAM) [49], ale aj v génoch ADORA2B, SOX7, CXCL1, CDX1 [21] či CUEDC1 [46].

Gény, u ktorých bol zistený hypometylovaný promotór, boli CAPN2, EPHX2 [21], DHX34 [46] a TIMP3, u ktorého existuje predpoklad, že jeho zvýšená expresia inhibuje invazívnosť trofoblastov a angiogenézu [45].

ZÁVER

Cieľom rešerše bolo vytypovať markery, ktoré by viedli k zvýšeniu diagnostickej presnosti v dia­gnostike PE v kombinácii s doposiaľ používanými markermi. Najlepším adeptom by bola mir-210. Avšak jej použitie ako vhodného biomarkeru je ešte potrebné validovať na veľkom súbore pacientiek.

Studie byla podpořena projekty Progres Q 25 a SVV 260263 Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy ČR a projektem č. RVO-VFN 64165 Ministerstva zdravotnictví ČR.

Korespondující autorka

Doc. RNDr. Marie Korabečná, Ph.D.

Ústav biologie a lékařské genetiky

1. LF UK a VFN

Albertov 4

128 00 Praha 2

e-mail: marie.korabecna@lf1.cuni.cz