Metoda One-Step Nucleic Acid Amplification – jaká je budoucnost zpracování sentinelových uzlin?

Souhrn

Cíl studie:
Článek popisuje současné možnosti využití molekulárně biologické metody One-Step Nucleic Acid Amplification (OSNA) v peroperačním zpracování sentinelových lymfatických uzlin v onkologické operativě. Principem vyšetření je stanovení cytokeratinu 19 jako markeru metastatického postižení ve vzorku lymfatické tkáně.

Typ studie:
Přehledový článek.

Název a sídlo pracoviště:
Gynekologicko-porodnická klinika, Fakultní nemocnice Plzeň a Lékařská fakulta UK v Plzni; Ústav biologie, Lékařská fakulta UK v Plzni; Oddělení imunochemické diagnostiky, Fakultní nemocnice Plzeň a Lékařská fakulta UK v Plzni; Šiklův ústav patologie, Fakultní nemocnice Plzeň a Lékařská fakulta UK v Plzni.

Metodika:
Literární rešerše literatury dostupné na databázi PubMed a publikované do dubna roku 2017. Jako klíčových slov bylo použito oficiálně využívané zkratky OSNA i celého názvu metody One-Step Nucleic Acid Amplification.

Závěr:
Využití metody OSNA s detekcí cytokeratinu 19 v sentinelových uzlinách jako markeru metastatického postižení představuje v současné době akceptovanou formu peroperačního zpracování sentinelových uzlin u karcinomu prsu a kolorektálního karcinomu. Dosud publikovaná data naznačují možnost úspěšného využití tohoto způsobu vyšetření sentinelových uzlin i u ostatních zhoubných novotvarů s lymfogenním šířením. Jedná se například o karcinomy štítné žlázy, žaludku, plic, dělohy, hlavy a krku. K prosazení metody OSNA i u těchto malignit je však zapotřebí většího množství publikovaných dat.

Klíčová slova:
OSNA, CK19, sentinelová uzlina

ÚVOD

Stav lymfatického aparátu představuje u nádorů s lymfogenním šířením zásadní prognostický faktor. Jeho stanovení, včetně detailního vyšetření tzv. sentinelové uzliny, slouží k přesnějšímu určení rozsahu onemocnění, stagingu, a díky tomu k adekvátní volbě pooperační adjuvantní léčby. Koncept sentinelové uzliny v pojetí moderní medicíny dnes již není novinkou a těší se širokému využití v onkologické chirurgii mnoha lékařských oborů. První kroky vedly přes detekci uzlin u pacientů s rakovinou penisu v sedmdesátých letech minulého století [2], maligních kožních melanomů až ke snad největšímu masovému využití této metody, tedy k mapování sentinelové uzliny u pacientek se zhoubným nádorem prsu. V současnosti využíváme v onkogynekologii mapování sentinelových uzlin u pacientek s karcinomem vulvy, do rutinní praxe se postupně celosvětově dostává vyšetřování sentinelových uzlin u karcinomu děložního hrdla [25] a v případě karcinomu děložního těla probíhá intenzivní výzkum uplatnění této koncepce.

K mapování sentinelových uzlin jsou standardně využívány tyto značkovací látky/tracery samostatně či v kombinaci: Patentní Modř, ^99mTc a ICG. Jejich detekce probíhá peroperačně, či v případě radioaktivního Technecia je možné sentinelové uzliny lokalizovat již před operací pomocí scintigrafických vyšetření. Aplikaci značkovací látky je pak doporučováno provádět nikoliv přímo do tumoru, ale do jeho lůžka, kde se předpokládá zachování architektury lymfatického řečiště, a tím volný odtok směrem ke spádové lymfatické uzlině. Specifickou problematiku představuje mapování sentinelové uzliny u karcinomů endometria, a to pro nejednotnost ve způsobu a místa aplikace tracerů. Tuto problematiku přehledným způsobem komentují například publikace Robové et al. [21, 22]. Navzdory dosavadním snahám v této oblasti nebylo standardizace způsobu mapování sentinelových uzlin u karcinomu endometria zatím dosaženo. Jedná se tedy o metodu dosud pouze experimentální, která je náplní výzkumných projektů [8]. V současné době, zejména zásluhou severoamerických autorů (protokol užívaný v Memorial Sloan Kettering Cancer Center), je prosazována aplikace značkovacích látek intracervikálním způsobem [3, 13]. Přes všechny nedostatky této metody je tento způsob aplikace t.č. nejrozšířenější a jeho využití je komentováno i v aktuálních doporučení ESMO-ESGO-ESTRO či NCCN pro léčbu pacientek s karcinomem endometria [4, 18].

Identifikace sentinelové uzliny však nepředstavuje jediný problém v této oblasti. Výzvou je i zpracování získaného materiálu. V tomto bodě naráží požadavky operatéra a klinika na možnosti vyšetřovacího aparátu představované v současnosti téměř výhradně patologem a jeho vybavením. Ideálním postupem by bylo, kdybychom byli schopni detekovat sentinelovou uzlinu, vyjmout ji a odeslat na zpracování, které nám poskytne přesné výsledky během operace, a pokud možno v řádu minut. Toto samozřejmě v současnosti možné není. S využitím metody frozen section (FS) jsme sice během přibližně 30 minut schopni od zkušeného patologa obdržet validní výsledek, nicméně se jedná o výsledek předběžný a jeho definitivní platnost potvrdí až vyšetření trvající řadu dní. Jaká je ale přesnost předběžného výsledku FS? Publikace z roku 2013 kolektivu autorů Sláma et al. se podrobně zabývá zpracováním sentinelové uzliny metodou FS u karcinomu děložního hrdla na populaci 225 pacientek. V této publikaci metoda FS dosahovala přesnosti definitivního vyšetření v 56,2 % případů, či v 63 % při vyloučení kategorie izolovaných tumorových buněk (ITC) [24].

NOVÉ MOŽNOSTI VYŠETŘENÍ SENTINELOVÉ LYMFATICKÉ UZLINY

Právě do tohoto rozporu mezi aktuálními možnostmi diagnostického aparátu a požadavky kliniků v současnosti vstupují moderní molekulárně biologické metody, které si kladou za cíl vyhovět našim nárokům na přesnost i rychlost. Jednou z takových metod je metoda One-Step Nucleic Acid Amplification (OSNA). Tato progresivní metoda se dokázala prosadit do standardů operační péče pro pacienty s kolorektálním či prsním karcinomem a je využívána již téměř 300 nemocnicemi po celém světě [27]. Konkrétně v případě karcinomu prsu vykazuje senzitivitu 89,3 %, specifitu 94,8 % a shodu s definitivním patologickým výsledkem (konkordanci) v 93,8 % [27]. V případě kolorektálního karcinomu hovoříme o senzitivitě 86,2 %, specificitě 96,5 % a konkordanci 95,7 % [30]. Výzkum jejího využití v onkologické chirurgii probíhá již od roku 2006 a dosud bylo zveřejněno více než 120 publikací s touto tematikou (databáze PubMed, heslo: OSNA, One-Step Nucleic Acid Amplification), viz grafy 1 a 2.

One-Step Nucleic Acid Amplification neboli OSNA, je metoda založená na detekci cytokeratinu 19 (CK19) v lymfatické tkáni a je plně akreditována pro Evropu podle evropské směrnice pro in vitro diagnostiku 98/97 EC. Jedná se o izotermický proces využívající technologie rychlé amplifikace nukleových kyselin (RT-LAMP: Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification) k semikvantitativnímu stanovení mRNA CK19. Tento cytokeratin je v podstatě epitelovým markerem, který normální lymfatickou tkání není exprimován. Jeho míra exprese tedy poukazuje (v souvislosti s nádorovým onemocněním pacientky) na přítomnost nádorových buněk epiteliálního původu, a tedy metastatického postižení vyšetřované lymfatické uzliny [26].

Prvním krokem zpracování je tzv. homogenizace uzliny v lyzátu. Žádná další úprava již není nutná, a tak vzorek putuje do detekčního přístroje RD-100i (Sysmex, Kobe, Japan). Výsledky z vyšetření celé uzliny jsou známé asi do 30 minut a analyzovat je možno vzorky až ze čtyř uzlin najednou. Kvantitativní analýza vzorku umožňuje rozlišit, nejen zda se jedná o uzlinu pozitivní či negativní, ale podle množství exprimovaného CK19 lze posoudit i míru postižení uzliny ve smyslu mikrometastáza/makrometastáza. Podle analýzy hodnot kopií mRNA CK19 byly stanoveny tyto cut off hodnoty pro karcinom prsu: uzliny s počtem kopií mRNA CK19 do 250 jsou hodnoceny jako negativní, od 250 do 5000 kopií mRNA CK19 jako mikrometastáza a nad 5000 kopií mRNA CK19 jako postižení makrometastatické [29]. Jako další využití této metody je podle posledních dat možnost predikce postižení axilárních nesentinelových uzlin u karcinomu prsu [28].

Výše zmiňované cut off hodnoty 250 a 5000 kopií mRNA CK19 pro odlišení mikrometastáz či makrometastáz byly postupně akceptovány i pro karcinom kolorekta a jsou aplikovány i ve studiích pro ostatní malignity plic, endometria, děložního hrdla atd. [5, 12, 16, 17, 19, 30].

Možnost využití metody OSNA u pacientek s karcinomem endometria byla zkoumána týmy japonských a španělských autorů. Jednalo se o soubory s 35 a 34 pacientkami, u kterých bylo tímto způsobem vyšetřeno 137 a 94 uzlin. Japonský tým metodu OSNA porovnával s histopatologickým zpracováním vzorku po 2 mm. Tým španělských autorů centrální jednomilimetrovou část uzliny vyšetřil po 200 µm včetně imunohistochemického vyšetření a detekce CK19 a zbývající tkáň uzliny byla určena ke zpracování metodou OSNA. Metoda OSNA vykazovala v porovnání s klasickým histopatologickým zpracováním senzitivitu 82,4–100 % a specifitu 87,6–99,2 % [15, 16]. Dále viz tabulku 1.

Tato metoda tedy teoreticky naplňuje naše požadavky na vysokou přesnost a zároveň dostupnost výsledku v krátkém časovém rámci a umožňuje během probíhající operace rozhodnout o rozsahu radikality výkonu. Vyšetření lze s úspěchem využít i u pacientů po neoadjuvantní chemoterapii. Zde odpadají vyšší nároky na zkušenost patologa, neboť OSNA změny tkáně uzlin způsobené proběhlou chemoterapií nezohledňuje. Navíc se jedná o automatizovaný proces, který lze dobře standardizovat a který může provádět zaškolený laboratorní pracovník [26]. I tato metoda má své limity. Za největší negativum tohoto vyšetření je považován fakt, že během analýzy OSNA je použitá část vzorku zcela znehodnocena, a není tak možná jeho histologická kontrola. A totéž platí i opačně, histologicky zpracovaný vzorek není možné využít k analýze OSNA. Chybí tak kontrola vzorku zlatým standardem, v tomto případě histologickým/imunohistochemickým vyšetřením. Tento handicap je ve studiích nahrazován různými způsoby prokrájení vzorku či imunohistochemickým potvrzením exprese CK19 v mateřském tumoru a v částkách histologicky zpracovaných uzlin – viz výše.

DISKUSE

OSNA se tak stává metodou, která má potenciál nalézt v budoucnu ještě širší uplatnění. Vysoká přesnost a rychlost vyšetření prokazatelně redukuje nejen anxietu našich pacientek (eliminace doby psychického tlaku spojené s čekáním na definitivní výsledek), ale i množství následných anestezií a chirurgických operací, což pozitivně ovlivňuje kvalitu života [1]. V roce 2016 byl publikován článek autorů z Velké Británie, kteří se touto zajímavou problematikou zaobírali. Až 97 % respondentek ankety prohlásilo, že bylo s vyšetřením spokojeno a bylo by ochotno stejnou proceduru v budoucnu opět podstoupit [1]. Často diskutovaná nákladnost metody se se stále širším zapojením do praxe neustále snižuje. Podle analýz publikovaných v roce 2014 a 2016 se model operační léčby s využitím OSNA jeví jako model významně redukující náklady na péči o pacientky s karcinomem prsu ve srovnání se standardním modelem využívajícím FS a následně definitivní histopatologické vyšetření s využitím imunohistochemie. Tento postup také snižuje až u 20 % pacientek nutnost druhého operačního výkonu [20, 23].

V poslední době peroperační vyšetření sentinelových uzlin karcinomu prsu ztrácí na významu. Pacientky s mikrometastázami či postižením jedné až dvou sentinelových uzlin, které nepodstoupily předoperační neoadjuvantní chemoterapii a u kterých je plánován prs zachovávající výkon, jsou indikovány k radiační léčbě [7, 9, 10]. U ostatních gynekologických malignit však využití této metody představuje do budoucna nadále přínos.

Studie s využitím metody OSNA u vyšetření sentinelových uzlin i u jiných zhoubných nádorů než u karcinomu prsu či kolorektálního karcinomu přinesly podobné výsledky ohledně senzitivity a specifity a naznačují její možné využití do budoucna. Jednalo se o studie vyšetření uzlin u karcinomu žaludku (senzitivita 83,3 %, specificita 95,9 %) [14], karcinomu plic (senzitivita 95 %, specificita 99,3 %) [12], karcinomu endometria (senzitivita 82,4 %, specificita 99,2 %) [16], karcinomy štítné žlázy (senzitivita 81,5 %, specificita 92,1 %) [6], skvamózního karcinomu krku a hlavy (senzitivita 86,9 %, specificita 96 %) [11] či děložního hrdla (senzitivita 50 %, specificita 98,4 %) [16]. Na základě výsledků studií u kolorektálního karcinomu byla tato metoda uznána japonským ministerstvem zdravotnictví a již od roku 2013 je hrazena ze zdrojů veřejného zdravotního pojištění [27].

ZÁVĚR

Na jaře roku 2016 byla zahájena na Gynekologicko-porodnické klinice Fakultní nemocnice v Plzni ve spolupráci s Biomedicínským centrem a Šiklovým ústavem patologie nekomerční monocentrická klinická studie (ClinicalTrials.gov ID: NCT02826291) využívající tuto unikátní metodu u pacientek s karcinomem děložního těla. Výsledky této studie by měly být dostupné již v tomto roce.

MUDr. Jan Kosťun

Gynekologicko-porodnická klinika FN Plzeň

Alej Svobody 80

304 60 Plzeň

e-mail: jan.kostun@gmail.com