Vyšetření NK a NKT buněk v diagnostice a léčbě imunologických příčin ženské neplodnosti – retrospektivní analýza dat terciárního klinického centra

Souhrn

Dysregulace imunitních funkcí může být jednou z příčin selhání implantace embrya. Významná úloha v procesu otěhotnění náleží složkám vrozené neadaptivní imunity, mimo jiné NK a NKT buňkám.

Tato práce přináší retrospektivní analýzu vyšetření počtů a funkcí NK a NKT buněk periferní krve žen s buněčnou imunopatologií před imunointervenční léčbou a po ní a vyhodnocení podílu klinických gravidit po terapii.

Byl proveden retrospektivní sběr dat a zhodnocení výsledků terapie neplodných žen léčených pro abnormální počty a/nebo funkční vlastnosti NK/NKT buněk po stimulaci antigeny spermií a trofoblastu. Hodnocena byla laboratorní data získaná analýzou periferní krve na průtokovém cytometru před léčebnou imunointervencí a při ní nebo po ní, a to ve vztahu k dosažení či nedosažení klinického těhotenství. Z celkového počtu 184 hodnocených případů imunomodulační terapie nastala klinická gravidita u 109 žen (59 %), přičemž 25 jich otěhotnělo přirozeně a zbylé ženy za užití některé z technik asistované reprodukce. Dosažení klinické gravidity bylo sdruženo se statisticky významně nižšími počty cirkulujících NK buněk (p = 0,03) a významně nižší aktivací NK buněk trofoblastem (p < 0,001).

Zvýšené počty NK buněk periferní krve a jejich patologická aktivace antigeny trofoblastu mohou být jedním z imunologických faktorů ženské neplodnosti. Správně zvolená imunointervenční léčba může zvýšit pravděpodobnost dosažení klinického těhotenství.

Klíčová slova:

neplodnost – imunita – NK buňky – klinické těhotenství – imunomodulace – in vitro fertilizace – metody asistované reprodukce – implantace embrya – podíl klinicky těhotných

ÚVOD

Neplodnost neboli sterilita je definována jako neschopnost otěhotnět po 1 roce pravidelného nechráněného styku (1). Česká nomenklatura navíc rozlišuje sterilitu jako stav, kdy nedochází k oplodnění, a infertilitu, což je nemožnost donosit a porodit životaschopné dítě při zachované schopnosti otěhotnět.

Imunitní systém má důležitou úlohu v řadě procesů lidské reprodukce. V těle matky se vyvíjí plod, který má polovinu genetické výbavy od otce, a je tedy pro mateřský imunitní systém semialogenní. Funkce imunitního systému však před otěhotněním ani v graviditě nesmějí být nijak potlačeny, neustále musejí správně fungovat všechny obranné mechanismy k zajištění maternální homeostázy, aniž by například matka byla vystavena vyššímu riziku infekcí. Této nelehké úloze slouží celá řada mechanizmů na straně matky i plodu.

Důležitou roli na straně matky hraje především komplexní buněčná imunitní odpověď, zajišťovaná různými typy leukocytů a jejich produkty. K nejvýznamnějším populacím leukocytů s tímto úkolem patří buňky NK (natural killer) a NKT (natural killer T). NK buňky postrádají antigenně specifické receptory a jejich hlavním úkolem je cytotoxicita zajišťovaná perforiny a granzymy a také produkce cytokinů a chemokinů dále ovlivňujících imunitní systém. Jsou definovány sadou diferenciačních antigenů – k nejdůležitějším se řadí molekula CD16 (Fc receptor pro IgG) a CD56 (adhezní molekula). NKT buňky jsou zvláštní skupinou lymfocytů se současnou expresí jak T-buněčného receptoru (TCR), tak receptoru NK 1.1 typického pro NK lymfocyty.

Uterinní NK buňky (uNK) se od NK buněk periferní krve značně liší. Na svém povrchu exprimují specifické molekuly, které slouží k regulaci cytotoxických reakcí. Produkují několik proteinů netypických pro periferní NK buňky, jež jsou důležité pro nastavení feto-maternální rovnováhy, například faktor inhibující růst leukemických buněk (LIF), angiopoetin nebo vaskulární endotelový růstový faktor (VEGF) a placentární růstový faktor (PLGF) (2).

O tom, zda a jak souvisí počty a funkce cirkulujících NK buněk s chováním uterinních uNK lymfocytů a odkud vlastně uNK pocházejí, se stále vedou diskuse. Je však již dokázáno, že značnou roli hraje tzv. nábor (recruitment) cirkulujících NK buněk, k němuž dochází pod vlivem hormonů a chemokinů produkovaných in utero a který spočívá v migraci NK a NKT buněk periferní krve přes endotelové a stromální deciduální buňky (3–5).

Skutečnost, že počty a funkce NK a NKT buněk periferní krve do jisté míry odrážejí skutečnost in situ (tj. v děloze), je využívána i v klinické praxi. U žen s poruchami plodnosti jsou stanovovány relativní a absolutní počty NK a NKT buněk v periferní krvi a je sledována jejich in vitro aktivace po stimulaci antigeny spermií a antigeny embryonálního původu.

Cílem předkládané práce byla retrospektivní analýza vyšetření počtů NK a NKT buněk periferní krve a jejich funkčních vlastností po in vitro stimulaci antigeny spermií a trofoblastu u žen s diagnózou neplodnosti. Analyzovali jsme prekoncepční rozdíly v těchto parametrech v závislosti na tom, zda ve sledovaném období žena dosáhla klinického těhotenství či nikoliv. Za dosažení klinického těhotenství byl považován sonografický průkaz gestačního váčku in utero. Druhotným cílem práce byla analýza léčebných imunointervenčních postupů, které byly k úpravě buněčných imunopatologií použity, v závislosti na dosažení gravidity.

SOUBOR PACIENTEK A METODIKA

Byla provedena retrospektivní analýza klinických údajů a výsledků imunologických laboratorních vyšetření pacientek s poruchou plodnosti, léčených v letech 2018–2020 na pražských klinikách asistované reprodukce GENNET a ISCARE. Šlo o pacientky s různými příčinami poruch plodnosti, které za sebou měly nejméně 2 neúspěšné embryotransfery kvalitních embryí a u nichž bylo v rámci hledání možné příčiny opakovaných neúspěchů provedeno imunologické laboratorní vyšetření. Z laboratorního informačního systému byla vygenerována data za období 30 měsíců, přičemž cílovým parametrem při prohledávání laboratorní databáze bylo vyšetření počtů a funkcí NK/NKT buněk periferní krve. Algoritmus výběru pacientek do studie je prezentován na obr. 1.

Imunofenotypizace lymfocytů periferní krve byla provedena metodou průtokové cytometrie s použitím směsi monoklonálních protilátek KOMBITEST CD3 FITC/CD4 PE-Cy7/CD8A PC-Cy7/CD16⁺ CD56 PE/CD19 APC/CD45 PerCP-Cy5.5 (EXBIO Praha). Postupy značení lymfocytů, lyzace erytrocytů i cytometrická analýza byly v souladu s doporučeními výrobce monoklonálních protilátek.

Test aktivace NK a NKT buněk periferní krve byl proveden s použitím diagnostické soupravy NKFlowEx (EXBIO, Praha). Periferní krev byla naředěna kultivačním médiem X-VIVO v poměru 1 : 1 a poté byla kultivována ve 4 různých zkumavkách stimulovaná mitogenem (PWM – pokeweed mitogen), suspenzí lyzovaných spermií, trofoblastovou buněčnou kulturou JAR exprimující HLA-G (Exbio Praha) a bez přidaného stimulačního činidla po dobu 24 hodin. Následně bylo provedeno značení buněk směsí monoklonálních protilátek CD45 FITC/CD16⁺ CD56 PE/CD3 PE-Cy5/CD69 PE-Cy-7, po kterém byla provedena lyzace erytrocytů. Vzorky byly analyzovány na přístroji NAVIOS EX. Cytometrická analýza je založena na detekci aktivačního znaku CD69 na povrchu analyzovaných buněk (obr. 2).

Referenční rozmezí normálních hodnot relativní četnosti NK buněk v periferní krvi se pohybuje v rozmezí 5–18 %, u NKT buněk je to 0–10 %. V případě stimulace spermiemi bylo za normu považováno pro NK i NKT buňky rozmezí 0–10 % aktivovaných buněk. Podíl buněk aktivovaných trofoblastem za normálních okolností nepřevyšuje u NK buněk 15 % a u NKT buněk 12 %.

Statistická analýza získaných dat byla provedena s pomocí softwaru STATISTICA 13.5.0.17 (TIBCO Software Inc., USA). Charakter rozdělení dat byl analyzován Kolmogorovovým-Smirnovovým testem normality. S ohledem na to, že nebylo potvrzeno normální rozdělení dat, byly další analýzy prováděny neparametricky. Ke srovnání skupin byl použit Kruskalův-Wallisův test, za významnou byla stanovena hladina významnosti p ≤ 0,05.

Analyzovány byly rozdíly v datech mezi skupinami žen, které otěhotněly („dosaženo klinické gravidity“) a neotěhotněly („nedosaženo klinické gravidity“). Laboratorní nálezy byly hodnoceny před zahájením imunointervenční terapie (vyšetření 1, V1) a po léčbě (vyšetření 2, V2), přičemž mezi V1 a V2 uplynulo nejméně 12 a nejvýše 36 týdnů a v tomto období bylo gynekologem provedeno sonografické vyšetření k potvrzení či vyloučení klinické gravidity.

VÝSLEDKY

Byly analyzovány výsledky laboratorních vyšetření 184 žen s mediánem věku 34 let, průměr 36,7 roku, mezikvartilové rozmezí 33–41 let.

Základní klinická data při prvním vyšetření (ve V1) shrnuje tab. 1. Vyplývá z ní, že analyzované skupiny se navzájem statisticky významně nelišily ve vstupních datech s výjimkou jediného faktoru, kterým byl věk. Jinými slovy – ve skupině „dosaženo klinické gravidity“ byly mladší ženy.

Z analyzovaných 184 pacientek byla po léčbě zaznamenána klinická gravidita u 109 žen (59 %). Těchto 109 klinických gravidit bylo dosaženo některou z technik asistované reprodukce (n = 82; 75 %), inseminací (n = 2; 2 %) nebo přirozeně (n = 25; 23 %). Do skupiny klinických gravidit nebyla započítána preklinická (biochemická) těhotenství, tj. gravidity, jejichž průkaz byl založen pouze na biochemických vyšetřeních séra nebo moči.

Poruchy v počtech a funkcích NK a NKT buněk byly ve skupině 184 analyzovaných případů léčebně ovlivňovány perorálními nebo parenterálně podávanými kortikosteroidy, intralipidy nebo polyspecifickými imunoglobuliny. Relativně nejvíce klinických gravidit (při hodnocení léčby technikami asistované reprodukce označeno jako podíl klinicky těhotných; CPR – clinical pregnancy rate) bylo dosaženo při terapii perorálními kortikosteroidy, tj. prednisonem a methylprednisolonem, a to 65 % (obr. 3).

U žen, které dosáhly klinické gravidity, byly ve srovnání se skupinou žen bez průkazu klinické gravidity po léčebné imunointervenci zaznamenány významně nižší hodnoty relativních počtů NK buněk, a tedy významnější sestupná dynamika tohoto parametru (p = 0,030). Rozdíly v podílech NKT buněk mezi skupinami těhotných a netěhotných žen po imunointervenční léčbě nebyly prokázány (p = 0,982). Rovněž tak úspěšnější v dosažení klinické gravidity byly ty ženy, které po imunomodulační léčbě vykázaly významně nižší (p = 0,0002) aktivaci NK buněk (nikoli však NKT buněk) trofoblastem (tab. 2).

V analyzované kohortě bylo 25 žen, které při léčbě imunomodulátory otěhotněly přirozeně, což představuje 13,5 % z celkového počtu léčených pacientek a 25 % ze skupiny dosažených klinických gravidit. Ženy, které otěhotněly přirozeně, měly oproti ženám, jež otěhotněly díky asistované reprodukci, nižší hodnoty stimulace NK buněk spermiemi (medián 2,51 vs 5,76 %; p = 0,002). NKT aktivace spermiemi nevykázala rozdíly. Zajímavé je, že ženy, které po imunointervenční léčbě otěhotněly přirozeně, se od skupiny žen, jež otěhotněly jiným způsobem, nelišily věkem, tedy nebyly (dle původního očekávání) ve srovnání se ženami podstupujícími IVF léčbu významně mladší (p = 0,217).

DISKUSE

Práce analyzuje výsledky vyšetření počtů NK a NKT buněk v periferní krvi a výsledky testu aktivace NK a NKT buněk periferní krve u neplodných žen. Významně více žen, které otěhotněly, mělo nižší podíl NK buněk v periferní krvi a nižší míru aktivace této buněčné populace po in vitro stimulaci trofoblastem. Ženy, které otěhotněly přirozeně, měly významně méně spermiemi aktivovaných NK buněk než ženy, jež otěhotněly jiným způsobem.

Uvádí se, že průměrná pravděpodobnost otěhotnění ženy ve věku do 35 let, která má nechráněný pohlavní styk, je asi 16 %. Zdravá žena tedy otěhotní se zdravým mužem v průměru za 6 menstruačních cyklů. U čtyřicátnic je však tato pravděpodobnost už jen 6 % (6). Efektivitu jakékoliv terapie se zacílením na dosažení těhotenství je proto vždy třeba hodnotit ve vztahu k těmto hodnotám. Národní registr asistované reprodukce ČR uvádí, že ve věkové skupině 35–39 let (které se náš soubor věkově nejblíže podobá) dosahuje podíl dosažení klinické gravidity po léčbě některou z technik asistované reprodukce 20–30 % (7). Z tohoto pohledu lze hodnotit dosažení klinické gravidity v 57 % jako významně pozitivní efekt imunologické léčby. Téměř 14% podíl přirozených početí po terapii imunopatologie u žen, které již splňovaly kritéria definice neplodnosti, je důkazem toho, že léčba neplodnosti páru nevyžaduje vždy použití metod asistované reprodukce.

V práci záměrně uvádíme jako endpoint podíl klinicky těhotných, a nikoliv počet živých dětí. Jako měřítko pro efektivitu jakékoliv léčby směřující k otěhotnění je porod příliš časově vzdálený, po dobu 9 měsíců je těhotenství vystaveno mnoha rizikům, která již s buněčnou imunopatologií nemusejí nijak souviset.

Implantace embrya v děloze je velice komplexní mnohastupňový proces. Na kterémkoliv jeho stupni se mohou objevit poruchy a jen část z nich dovedeme přesněji určit anebo je cíleně ovlivnit. Jedním z faktorů zajišťujících úspěch implantace a řádný vývoj embrya je správná funkce imunokompetentních buněk.

Hlavní populaci imunologicky aktivních buněk v děložní sliznici představují NK buňky. Před implantací embrya jsou většinou v metabolickém klidu, v místě implantace se hromadí a aktivují (8). Za jejich hlavní úkoly se považují rozpoznávání trofoblastu, účast v navození mechanismů vedoucích k jeho toleranci, tvorba angiogenních faktorů potřebných k tvorbě spirálních arterií, a tedy usnadnění vaskularizace. NK buňky jsou velké granulární lymfocyty, které tvoří přibližně 15 % krevních cirkulujících lymfoidních buněk (9).

Charakteristická pro NK buňky je exprese povrchového znaku CD56 (CD56⁺) a nepřítomnost znaku CD3 (CD3^–). Dalším významným znakem NK buněk je antigen CD16, podle jehož exprese se NK buňky rozdělují na dvě subpopulace: cytotoxické NK (CD16⁺) a imunoregulační NK (CD16^–). Cytotoxických je asi 90 % NK buněk, imunoregulačních 10 %. Pro imunologii reprodukce jsou významnější cytotoxické NK buňky (CD56⁺ CD16⁺). Cytotoxický charakter NK buněk může být umocněn v prostředí s převahou T_H1-buněčné odpovědi. Prosperující gravidita vyžaduje optimální poměr těchto buněk.

Uterinní NK buňky se od NK buněk periferní krve značně liší. Na svém povrchu exprimují specifické molekuly (NKG2C, NKG2E, KIR2DL4), které slouží k regulaci cytotoxických reakcí (10). Produkují několik proteinů netypických pro periferní NK buňky. Tyto proteiny jsou důležité pro nastavení feto-maternální rovnováhy. Nebezpečí in utero však představují aktivované NK buňky: při poruchách nidace, opakovaném selhání implantace kvalitního embrya a opakovaném potrácení je na NK buňkách snížena exprese inhibičních tzv. KIR (killer-cell immunoglobuline-like) receptorů a zvýšena exprese aktivačních znaků (CD69, CD101, CD94) (11–12).

NKT buňky rozeznávají lipidové nebo glykolipidové antigeny prezentované spolu s proteinem CD1d, patřícím k MHC antigenům I. třídy (13). Ačkoliv tyto buňky nesou na svém povrchu receptor TCR, nelze je považovat za T lymfocyty. Stejně tak je i přes přítomnost znaku CD56 nemůžeme považovat za podskupinu NK buněk. NKT buňky v graviditě rozpoznávají svůj ligand CD1d na buňkách extravilózního i vilózního trofoblastu, čímž se spouští jejich efektorové funkce. NKT buňky se mohou spolupodílet na těhotenských ztrátách, a to produkcí embryotoxických cytokinů TNF-α a IFN-γ nebo i svým vlivem na konvenční NK buňky, kdy stimulací NK proliferace směrem k CD56^dim CD16⁺ na feto-maternálním rozhraní zvyšují cytolytickou aktivitu této buněčné populace (13).

Některé i recentní práce popírají význam vyšetření cirkulujících NK a NKT buněk periferní krve s výhradou, že uNK jsou zcela jinou buněčnou populací, a že tedy výsledky vyšetření cirkulujících leukocytů nevypovídají nic o situaci in utero (14–15). V souladu s řadou jiných autorů se však domníváme – a naše výsledky pro tuto skutečnost též nepřímo svědčí, že stav cirkulujících NK buněk do jisté míry odráží situaci v děloze. Pozitivní korelaci mezi krevními NK a uNK lymfocyty v endometriu prokázali například Santillánová et al. (16). Park et al. verifikovali korelaci počtů a funkcí cirkulujících NK buněk s deciduálními NK lymfocyty (17). Z práce Hanny et al. vyplývá, že CD16⁻ NK buňky jsou atrahovány z krve do endometria též prostřednictvím interakcí mezi CXCR4 a CXCL12 chemokiny (18).

I naše data potvrzují, že složení, četnost a funkce krevních NK buněk lze použít k posouzení feto-maternální tolerance. V našem souboru významně úspěšněji dosahovaly gravidity ženy s nižšími počty cirkulujících NK buněk a s nižší schopností aktivace po stimulaci trofoblastem. Dalším důležitým poznatkem je skutečnost, že snahy o úpravu, resp. potlačení aktivace NK buněk spermiemi mohou být završeny úspěšným přirozeným početím. Přínos vyšetření počtů a funkcí periferních imunocytů má velký význam v rutinní klinické praxi, protože biopsie endometria nebo uterinní laváž potřebné k analýzám uNK jsou již výkony do jisté míry invazivními, je třeba je načasovat a sladit s menstruačním cyklem pacientky, odběr materiálu může provést pouze erudovaný gynekolog s příslušným vybavením, analýza těchto biologických materiálů je ohrožena možnou kontaminací periferní krví a v neposlední řadě je analýza periferní krve snáze standardizovatelná.

Dobrou zprávou (i přes jisté zklamání z efektu nových léčebných možností) je pro nás skutečnost, že nejúspěšnějšími a nejpřínosnějšími imunomodulátory v léčbě poruch imunity sdružených s neplodností jsou perorální kortikosteroidy. Ženy léčené methylprednisolonem nebo prednisonem dosáhly gravidity až v 65 % případů. Přitom kortikosteroidy jsou jako látky s imunointervenčním účinkem známy a používány již od poloviny 20. století. Jde o terapii finančně dostupnou, bezpečnou a v této oblasti reprodukční imunologie dle našeho názoru modalitou první volby (19).

V reprodukční imunologii se využívá imunomodulačního, nikoli však imunosupresivního účinku kortikosteroidů, které mění odpověď imunitního sytému tak, že primárně ovlivňují expresi genů kódujících faktory účastnící se zánětlivých kaskád, transkripci těchto genů v jádře a posttranskripční a posttranslační mechanismy v cytoplazmě. Tím významně ovlivňují počty leukocytů in situ i v cirkulaci, tvorbu prozánětlivých cytokinů lymfocyty a buňkami monocyto-makrofágového systému, modifikují zánětlivé kaskády na úrovni blokády enzymů typu fosfolipázy A₂, stabilizují lyzosomové membrány, snižují tvorbu prostaglandinů, ovlivňují cévní permeabilitu. V reprodukční imunologii je využíváno i vlivu kortikosteroidů na redukci aberantních populací NK buněk, k normalizaci exprese cytokinů na endometriu a k modulaci patologického endometriálního zánětu.

U polyspecifických imunoglobulinů je míra dosažení klinické gravidity v našem souboru rovněž vysoká – 63 %. Jde však o terapii finančně velmi nákladnou a hůře dostupnou. Jelikož jde o krevní deriváty, je třeba mít na zřeteli i to, že kvantum dárcovské plazmy není neomezené a že na těchto krevních derivátech mohou být životně závislí, a tedy mnohem potřebnější pacienti s imunodeficity nebo s některými těžkými a život ohrožujícími autoimunitními chorobami.

Intralipidy jsou sterilní tukové emulze určené k intravenóznímu podávání s obsahem sójového oleje a vaječného lecitinu. Jejich imunomodulační účinek u imunitně podmíněných poruch plodnosti spočívá v jejich protizánětlivém působení, neboť intralipidy jsou kompetitivní antagonisté prekurzorů eikosanoidu kyseliny arachidonové, čímž snižují množství prozánětlivých mediátorů a blokují tak zánětlivé kaskády (20). V reprodukční imunologii je off-label indikací intralipidů léčba kortikorezistentních pacientek s buněčnou imunopatologií. Dávkovací schémata jsou individuální. Důležitým faktorem je započetí léčby ještě před embryotransferem, resp. před ovulací, a to z důvodu vlivu progesteronu na aktivaci NK buněk.

Naše práce má bezesporu i slabá místa. Nezohledňuje například počet transferovaných embryí při IVF, byť jsme si vědomi toho, že po vnesení dvou embryí stejné kvality do dělohy bude pravděpodobnost otěhotnění vyšší než při vnesení pouze jednoho z nich. Nezohledňujeme ani kvalitu transferovaných embryí, ačkoliv je prokázáno, že preimplantační genetické testování a transfer euploidního embrya zvyšuje pravděpodobnost početí (21). Vhodné by také bylo porovnat počty předchozích IVF stimulací, embryotransferů a předchozích úspěšných či neúspěšných gravidit v analyzovaném souboru; těmto možným konsekvencím budou věnovány naše další studie.

ZÁVĚR

Vyšetření počtů cirkulujících NK buněk a stanovení jejich aktivace po in vitro stimulaci spermiemi a trofoblastem má své místo v diagnostice imunologických příčin ženské neplodnosti. Řádně vedená a správně monitorovaná imunointervenční terapie se spolupodílí na zvýšení úspěšnosti léčby neplodnosti.

Poděkování

Děkujeme klinikám GENNET, s. r. o., a ISCARE, a. s., za podporu výzkumu a vývoje v oblasti reprodukční imunologie.

Čestné prohlášení

Autorky prohlašují, že v souvislosti s tématem, vznikem a publikací tohoto článku nejsou ve střetu zájmů a vznik ani publikace článku nebyly podpořeny žádnou farmaceutickou firmou.

Seznam zkratek

CD      diferenciační skupina (cluster of differentiation)

CPR    podíl klinických těhotenství (clinical pregnancy rate)

JAR     buněčná linie choriokarcinomových buněk (syncytiotrophoblast-like)

KIR      killer-cell immunoglobuline-like receptory NK buněk

LIF       faktor inhibující růst leukemických buněk (leukemia inhibitory factor)

NK       přirozený zabíječ (natural killer)

NKT     natural killer T buňka

PLGF   placentární růstový faktor (placental growth factor)

PWM   pokeweed mitogen

TCR    T-buněčný receptor

T_H       pomocný (helper) T lymfocyt

uNK    uterinní NK buňka

V1, V2 vyšetření 1 (před léčbou), vyšetření 2 (po léčbě)

VEGF  vaskulární endotelový růstový faktor (vascular endothelial growth factor)

Adresa pro korespondenci:

MUDr. Karin Malíčková

Klinické centrum ISCARE, a. s.

Českomoravská 2510/19, 190 00  Praha 9

Tel.: 234 770 255

e-mail: malickova@iscare.cz