Význam mikroRNA v patofyziologii aterosklerózy a jejich možné klinické využití

Souhrn

Ateroskleróza a její klinické manifestace (např. infarkt myokardu, či cévní mozková příhoda) v rozvinutých zemích stále představují vedoucí příčinu úmrtí. Během posledních dekád se naše znalosti o vzniku aterosklerózy výrazně posunuly kupředu: byly popsány klíčové molekuly a signální kaskády, které se tohoto komplexního procesu účastní, a to umožnilo vývoj efektivních terapeutických postupů, které dokážou zmírnit dopady aterosklerózy na zdraví jedince. Objev nekódujících RNA (ncRNA), které se podílejí na regulaci genové exprese a účastní se takřka všech procesů v našem těle, přináší další úroveň komplexnosti, nabízí nový náhled na regulaci jednotlivých procesů a v neposlední řadě i nové postupy využitelné v diagnostice či v terapii aterosklerózy. Tento přehledný referát předkládá základní informace o funkci mikroRNA, jedné ze skupin ncRNA, a následně se zaměřuje na jejich zapojení do patogeneze aterosklerózy. V poslední části textu podává přehled možného využití cirkulujících mikroRNA v diagnostice aterosklerózy a na výsledcích animálních a pilotních humánních studií demonstruje i možný terapeutický potenciál, který se v těchto malých molekulách skrývá.

Klíčová slova:
cirkulující mikroRNA – diagnostika aterosklerózy – ncRNA – terapie aterosklerózy

Úvod – ateroskleróza jako komplexní proces

Ateroskleróza představuje chronické komplexní onemocnění, během kterého dochází k ukládání lipidů do cévní stěny, jejímu chronickému zánětu a přestavbě, čímž dochází k změnám v krevním toku, ischemii tkání a orgánů a v případě akutního uzávěru cévy pak k urgentním stavům, které bezprostředně ohrožují život pacienta [1,2]. Klíčový význam v rozvoji aterosklerózy má cholesterol, který je v cirkulaci pro svou lipofilní povahu přenášen v lipoproteinových částicích. Odsun cholesterolu z periferních tkání do jater zajišťují lipoproteiny o vysoké hustotě (high density lipoproteins – HDL), dodávku do periferie pak lipoproteiny o nízké hustotě (low density lipoproteins – LDL) [1,2]. Oba procesy jsou za normálních okolností v rovnováze. Dojde-li ovšem k narušení cholesterolové homeo­stázy ve prospěch akumulace cholesterolu v peri­ferních tkáních (např. cévách), je podpořen proces atero­sklerózy. Laboratorně pozorujeme zvýšení hladin LDL-cholesterolu (LDL-C), či snížení hladin HDL-cholesterolu (HDL-C).

Narušení cholesterolové homeostázy pak spolu s lokálními změnami toku krve představují první kroky několikastupňového procesu vzniku aterosklerotického plátu. V místech změněného toku (zejména v bifurkacích) dochází k endotelové dysfunkci, endotel je více propustný a jeho buňky začínají vystavovat receptory, které usnadňují přestup bílých krvinek do cévní stěny a je aktivována signální kaskáda nukleárního faktoru kappa B (NFκB) [1–3]. Postupně vznikající zánět vede k alteraci v hladinách cytokinů, další změny toku se pak odrážejí na změně genové exprese nejen v endotelových, ale následně i hladkosvalových buňkách cévní stěny [4]. Hladkosvalové buňky přecházejí ze svého klidového kontraktilního fenopytu (nezbytného pro normální funkci cévy) do fenotypu proliferačního, dochází k remodelaci cévní stěny a dalšímu zrání aterosklerotických plátů [5].

mikroRNA (miRNA, miR), molekuly jež představí další odstavec, jsou zapojeny do všech výše zmíněných procesů. Dle osnovy nadnesené v tomto úvodu bude o zapojení vybraných miRNA do procesu aterosklerózy pojednáno v dalších odstavcích.

Nekódující RNA, mikroRNA a jejich funkce

Jedním z dlouho platných principů molekulární biologie je předpoklad, že deoxyribonukleová kyselina (deoxyribonucleic acid – DNA) slouží jako matrice pro vznik přenašečové ribonukleové kyseliny (messenger ribonucleic acid – RNA) a struktura mRNA je klíčem pro vznik bílkovin. mRNA jsou proto označovány jako kódující RNA, neboť ve své struktuře kódují strukturu bílkovin, které v buňkách plní řadu strukturálních a výkonných funkcí. Aby výše uvedený proces mohl úspěšně probíhat, je zapotřebí řada již desítky let známých nekódujících RNA – z nich uveďme např. ribosomální RNA (rRNA) nebo transferovou RNA (tRNA), které jsou nezbytné pro vznik ribosomů nebo pro přenos aminokyselin v průběhu proteosyntézy, ale žádné proteiny přitom nekódují [6].

Studie z posledních let využívající moderní molekulárně-biologické metody, které umožňují studium celého genomu a transkriptomu, tj. obsahu všech přepisovaných (transkribovaných) RNA v buňce, však ukazují, že zhruba dvě třetiny genomu jsou aktivně přepisovány a proteiny-kódující RNA přitom představují pouze cca 2 % z toho množství [7,8]. Zbývající molekuly RNA jsou označovány jako nekódující RNA (non-coding RNA – ncRNA) a dle jejich délky jsou rozdělovány na dvě základní skupiny – dlouhé nekódující RNA (long noncoding RNA – lncRNA) a malé nekódující RNA (small noncoding RNAs – sncRNA). sncRNA se obecně účastní regulace genové exprese a dle jejich specifických funkcí se poté dělí do celé řady podskupin (obr. 1A) [6,9].

mikroRNA (miRNA, miR) představují jednu ze skupin sncRNA – jedná se o krátké, přibližně 22 nukleotidů dlouhé úseky jednovláknové RNA, které negativně regulují genovou expresi na podkladě interference s cílovými mRNA, tj. těmi RNA, které kódují vznik bílkovin [10]. Dle všeobecně platného pravidla komplementarity (tj. že adenin se váže s uracilem a guanin se váže s cytosinem; A-U, C-G) se miRNA v komplexu s pomocnými proteiny vážou do specifických oblastí mRNA a svou vazbou vyvolají buď degradaci této mRNA, nebo zabrání překladu mRNA do bílkoviny – oba popisované mechanizmy způsobí, že proces genové exprese je zpomalen/zastaven a dojde ke snížení hladin bílkoviny, kterou cílová mRNA kódovala (obr. 1B).

Regulace pomocí miRNA je vysoce komplexní – jedna miRNA často cílí na více různých mRNA (mnohdy zapojených do jedné metabolické či signální kaskády) a jedna mRNA může být cílem pro více různých miRNA (obr. 1C), jako příklad vybrána miR-33 a přenašečový protein ABCA1 (ATP-binding cassette transporter A1), o jejichž významu bude pojednáno dále [11]. miRNA tímto způsobem působí jako citlivé regulátory genové exprese a narušení jejich hladin, popisované u řady onemocnění včetně aterosklerózy, má pak širokosáhlé dopady na řadu buněčných procesů. Může např. vyústit v urychlení proliferace (množení) či diferenciace (vyzrávání) buněk, může zcela změnit buněčný fenotyp, či může snížit expresi vybraných receptorů na povrchu buněk; v kontextu aterosklerózy se zmíněné procesy uplatní např. při vzniku aterosklerotického plátu, v remodelaci cévní stěny či regulaci metabolizmu lipoproteinů [11].

Posledním důležitým aspektem týkajícím se funkce miRNA je skutečnost, že miRNA nejsou limitovány ve své působnosti pouze na buňky, v nichž vznikají – buňky jsou schopny miRNA aktivně uvolňovat (ať již do malých membránových váčků, např. exosomů, nebo do pro aterosklerózu tak nezbytných lipoproteinových částic; obr. 1D) a předávat si je tak mezi sebou ve smyslu parakrinní či endokrinní komunikace [12]. miRNA vzniklá v játrech či v bílé krvince se tak např. může dostat do endotelových buněk, ovlivnit jejich genovou expresi, a tím urychlit či zpomalit proces aterosklerózy.

Pro možné klinické využití miRNA jsou pak důležitá zejména následující dvě fakta:

• hladiny miRNA jsme schopni ovlivnit s využitím uměle syntetizovaných molekul, což přináší nové terapeutické možnosti [13]
• miRNA vyskytující se v extracelulárním prostoru (krvi, plazmě, moči, slinách…) je možné vyizolovat a stanovit jejich hladiny (které se mění v přítomnosti nemoci, nebo při odpovědi na léčbu), což přináší nové diagnostické možnosti [12]

mikroRNA v patofyziologii aterosklerózy

mikroRNA a metabolizmus cholesterolu a lipoproteinů

SREBPs (sterol regulatory element binding proteins) představují již řadu let známé transkripční faktory, které přímo aktivují/inhibují expresi různých enzymů a signálních molekul zapojených do lipidového metabolizmu [14]. Při syntéze SREBPs vznikají i dvě miRNA, konkrétně miR-33a a miR-33b [15], které jsou uloženy v intronech genů pro SREBPs a podobně jako SREBPs i tyto dvě miRNA cílí na mRNA, které jsou přímo zapojeny do efluxu cholesterolu z jater/periferních tkání do nascentních HDL (např. transportér ABCA1 [15]), nebo které jsou důležité pro exkreci cholesterolu z jater do žluči (např. transportér ABCB11 [16]) a stejně tak cílí na řadu enzymů zapojených do syntézy mastných kyselin (např. CROT, FASN a další cíle), obr. 1C [11,15]. Byla již provedena řada studií na myších [17] i primátech [18], které ukazují, že blokádou miR-33 je možné zvýšit hladiny cirkulujícího HDL o 40–50%, aniž by HDL ztratilo své protizánětlivé vlastnosti a zároveň dochází ke zmenšení aterosklerotických plátů u pokusných zvířat [17,18]. Tyto efekty jsou pravděpodobně dány zvýšením exprese ABCA1 (a tím zvýšenou tvorbou HDL a vyšším „odsunem“ cholesterolu z periferie do jater), zvýšením exprese ABCB11 (a tím zvýšenou exkrecí cholesterolu do žluči) a v neposlední řadě recentní studie ukazují i na vliv blokády miR-33 na chování makrofágů a regulačních T-lymfocytů, které mají vlivem blokády miR-33 ateroprotektivní vlastnosti [19].

Kromě miR-33, která nepochybně představuje jeden z důležitých posttrankripčních uzlů regulujících metabolizmus cholesterolu, existují i další podobné miRNA; např. miR-27a přímo reguluje expresi transkripčních faktorů SREBP (a tím nepřímo miR-33 a všech jejích cílů) [20], je zapojena do syntézy apolipoproteinu B100 (apoB100) a má více než 9 dalších cílů přímo zapojených do metabolizmu cholesterolu [21]. Další miRNA (miR-223) tlumí expresi klíčového enzymu cholesterolové syntézy hydroxymethyl­glutaryl–koenzymA syntetázy a dále přímo snižuje hladiny scavangerového receptoru typu 1 třídy B (SRB1), který je nezbytný pro vychytávání HDL-částic [22]. miR-30c reguluje expresi genu MTTP (microsomal triglyceride transfer protein), jež je nezbytný pro loading lipidů do nascentního apoB, a tak i pro vznik částic o velmi nízké hustotě (very low density lipoproteins – VLDL) [23]. Recentní studie pak ukazují na význam miR-148a, která snižuje hladiny receptoru pro LDL (LDLR) a její blokáda pomocí specifických antagonistů způsobuje zvýšení clearance LDL v játrech [24].

Poslední zajímavostí, kterou v kontextu metabolizmu lipoproteinů a miRNA uvádíme, je i fakt, že zmiňovaná miR-223 je jednou z miRNA, které působí i mimo místo svého vzniku v jaterních buňkách – je také uschována v lipo­proteinových částicích HDL (v LDL-frakci jsou její hladiny mnohem nižší) a z HDL dochází k jejímu transportu do endo­telových buněk (ve kterých se tato miRNA za fyziologických okolností vůbec nevyskytuje) [25]. V endotelových buňkách pak miR-223 přímo snižuje expresi intra­celulární adhezivní molekuly typu 1 (intracellular adhesion molecule 1 – ICAM-1), receptoru, který zajišťuje vazbu bílých krvinek na endotel a jejich přestup do cévní stěny – transfer miR-223 mezi HDL a endotelovými buňkami tak částečně vysvětluje dlouho známé anti-aterogenní působení HDL-molekul [25].

mikroRNA ovlivňující vznik a progresi aterosklerózy

Kromě miR-223 předávané do endotelových buněk z HDL regulují expresi ICAM-1, či E-selektinů miR-222, nebo miR-31 [26,27]. Pro endotelové buňky vysoce specifická miR-126 zase cílí na cévní adhezní molekulu (vascular cell adhesion molecule 1 – VCAM1) [28]. Terapeutické ovlivnění těchto miRNA by v budoucnu mohlo zabránit diapedéze leukocytů do cévní stěny, a tím utlumit aterosklerózu v jednom z jejích klíčových prvních kroků.

Jiné miRNA se podílejí na regulaci endoteliální zánětlivé odpovědi – v této hraje klíčovou roli signální dráha NFκB a např. miR-146a nebo miR-181b jsou jejími přímými inhibitory [29,30]. Intravenózní podání miR-181b pokusným zvířatům dokonce tlumí endoteliální zánětlivou odpověď a zmenšuje aterosklerotické léze, a tento efekt přitom není odvislý od změn v lipidovém spektru pokusných zvířat [29].

Krom zánětu se na rozvoji a progresi aterosklerózy dále podílejí změny v toku krve – v predilekčních místech cévního řečiště (bifurkace, zúžení) či na místech již vzniklých aterosklerotických plátů se laminární proudění (l-flow) mění v proudění turbulentní (tzv. d-flow, z angl. disturbed flow) [2]. Hladiny výše zmíněné miR-126 (konkrétně její varianty miR-126–5p) se vlivem d-flow snižují, čímž endotel přichází o její ateroprotektivní vlastnosti; podobně i artificiálně navozená blokáda této miRNA u pokusných zvířat, u nichž byly uměle navozeny endotelové léze, způsobila, že se tyto léze mnohem hůře hojily [31]. Hladiny celé řada dalších miRNA (např. miR-92a, miR-155, miR-663 a další) jsou tzv. „flow-dependentní“, tj. mění se s kvalitou proudění krve [4]. Krevní tok však neovlivňuje jen expresi miRNA v buňkách, ale ovlivňuje i obsah extra­celulárních membránových váčků, které buňky produkují – laminární proudění způsobuje, že je již zmíněná miR-126 ve větší míře transportována z endotelových buněk do membránových váčků, které se tak dostávají do hladkosvalových buněk cévní stěny a udržují jejich kontraktilní fenotyp [31]. Podobně laminární proudění vede k uvolnění miR-143 a miR-145 do extracelulárních váčků, což má rovněž ateroprotektivní vlastnosti [32] – u myší deficientních pro miR-143/145 je kontraktilní funkce hladkosvalových buněk narušena, pokusná zvířata mají nižší tlak než kontrolní skupina a mnohem méně reagují na podání vazopresorů [33]. Navození zvýšené exprese miR-145 pomocí lentivirového vektoru naopak vede k zmenšení aterosklerotických lézí a k četným změnám jejich kvality – hromadí se v nich méně makrofágů, pláty mají menší nekrotické jádro a pevnější fibrinovou čepičku (a obecně vyšší obsah kolagenu) než pláty kontrolní skupiny [34].

Využití mikroRNA v diagnostice aterosklerózy a jejích komplikací

Cirkulující miRNA, tedy miRNA nacházející se v extracelulárním prostoru – plné krvi, plazmě, séru, ale i moči, slinách, potu, či mateřském mléce – byly poprvé popsány v roce 2008 [35]. Některé z těchto miRNA jsou do extra­celulárního prostoru aktivně uvolňovány (jak bylo popsáno výše např. pro miR-126, miR-143/145, či miR-223), jiné se do oběhu dostávají např. při nekróze buněk (např. miR-499 při infarktu myokardu [36]). S ohledem na skutečnost, že některé miRNA vykazují tzv. tkáňovou/orgánovou specificitu (tj. jejich exprese v dané tkáni je 20krát vyšší než exprese v ostatních tkáních [37]), je pak možné vybrané miRNA teo­reticky využít jako biomarkery poškození různých orgánů [38]. Možné využití miRNA jako diagnostických či prognostických markerů aterosklerózy a s aterosklerózou asociovaných nemocí ukazuje obr. 2 [2,39–41].

Studie věnující se diagnostice nemocí pomocí miRNA jsou nyní ve svých začátcích – většina studií je nyní limitována svým rozsahem (zejména malou velikostí vzorku), ale také volbou kontrolní vzorku (často jako kontrolní skupina vystupují zdraví jedinci, nikoliv pacienti s podobnými klinickými obtížemi). Velkým problémem pro porovnávání jednotlivých studií je i nedostatečná standardizace postupů mezi jednotlivými laboratořemi, problém ve stanovení hladin miRNA může nastat i v případě, že byl pacient před odběrem vzorků zaléčen heparinem, který inhibuje polymerázovou řetězovou reakci (PCR), která se využívá při stanovení hladin miRNA. Další nevýhodou stanovení miRNA oproti běžně užívaným biomarkerům je v současnosti i rychlost stanovení (trvají většinou několik hodin oproti desítkám minut u běžně užívaných biomarkerů). Zda se miRNA jako diagnostické markery v budoucnu uplatní, se tedy bude odvíjet od toho, zda budou tyto technické překážky odstraněny a zda nové miRNA-biomarkery přinesou nové informace (např. o pacientově prognóze), které současné biomarkery neposkytují [39].

Využití mikroRNA v terapii aterosklerózy?

Principy terapeutického ovlivnění miRNA jsou v podstatě dvojí: je-li některá z miRNA vlivem nemoci snížena, je naším cílem její hladiny substituovat (navýšit); jsou-li hladiny některé miRNA naopak zvýšeny, je cílem tyto hladiny snížit, ev. danou miRNA vyblokovat [13]. V animálních studiích jsou s výhodou využívány oba postupy, což nám blíže umožňuje pochopit význam jednotlivých miRNA u různých nemocí – příklady takového ovlivnění byly uvedeny výše např. pro miR-33, či miR-181a, jejichž modulace vedla k útlumu tvorby aterosklerotických plátů a regresi atero­sklerózy. Na lidských subjektech jsme se zatím setkali v kontextu aterosklerózy a nekódujících RNA se dvěma léčivy – miravirsenem [42]a mipomersenem [43]. Miravirsen je oligonukleotid namířený přímo proti miR-122, což je jaterně specifická miRNA která udržuje expresi řady jaterně specifických genů. Zároveň je však nezbytná pro efektivní replikaci viru hepatitidy C a její blokádou pomocí miravirsenu se podařilo snížit virovou nálož u infikovaných osob a u části z nich nebyla virová RNA vůbec identifikovatelná; jako vedlejší výstup této studie bylo pozorováno snížení hladin cholesterolu u pokusných osob [42]. Mipomersen je pak oligonukleotid přímo namířený proti apoB (nejedná se tedy o přímou blokádu některé z miRNA, ale o využití jejich mechanizmu účinku), který snižuje hladiny LDL a dle recentních dat i výskyt kardiovaskulárních příhod u pacientů s familiární hypercholesterolemií [43].

Závěr

Nekódující RNA představují velice rozsáhlou skupinu molekul, jejichž pravý význam začínáme v posledních dvou až třech desetiletích postupně odkrývat. miRNA díky své všudypřítomnosti a velkému množství intra- i extracelulárních funkcí patří k jedné z nejatraktivnějších podskupin malých nekódujících RNA, které by v budoucnu mohly sloužit jako univerzální diagnostické sérové markery pro řadu různých nemocí, včetně aterosklerózy a jejích komplikací, ale také jako nové léčebné prostředky. Nelze očekávat, že během pár let miRNA nahradí běžně užívané markery (jako např. troponiny), nebo že v lékárnách najdeme infuze s miRNA-inhibitory, které okamžitě zvrátí počínající aterosklerózu nebo normalizují hladiny cholesterolu. Je také možné, že miRNA přestavují pouze „slepou větev“ výzkumu a za několik let, či desetiletí se objeví nové atraktivnější a bezpečnější molekuly. V současné době však miRNA představují nepochybně zajímavou skupinu molekul, která si zaslouží další zkoumání, a až další výzkum pak odhalí, jaký je jejich pravý klinický potenciál.

Práce vznikla v rámci projektu „Kardiovaskulární systém: od modelu přes terapii k prevenci“(MUNI/A/1365/2015) z prostředků na specifickývysokoškolský výzkum, kterou poskytlo MŠMT ČR v roce 2016.

MUDr. Jan Novák

jan.novak@fnusa.cz

II. interní klinika LF MU a FN u sv. Anny v Brně

www.fnusa.cz

Doručeno do redakce 12. 9. 2016

Přijato po recenzi 26. 9. 2016