První nález fenotypu Gy(a-) v České republice od jeho objevu v r. 1967. Možné příbuzenství s původními nositeli tohoto fenotypu v USA v letech 1967–1968

Overview

Úvod:
Krevní skupinový systém Dombrock zahrnuje 2 kodominantní antigeny – Do^a (DO 001) a Do^b (DO 002), a 3 vysokofrekventní antigeny: Gy^a (DO 003), Hy (DO 004) a Jo^a (DO 005). Glykoprotein DO je připojen k membráně erytrocytů pomocí GPI-kotvy. Patří do rodiny mono-ADP-ribosyltransferáz. Gen DO je umístěn na krátkém raménku chromozomu 12. Zaujímá 14 kB a obsahuje 3 exony. V současné době je známo 10 alel systému Dombrock. Vysokofrekventní antigen Gy^a byl objeven v r. 1967 autory J. Swanson et al. Fenotyp Gy(a-) byl nalezen v r. 1967 a 1968 u dvou rodin československého původu. Dosud jsou známy 4 molekulárně genetické mechanismy vyvolávající fenotyp Gy(a-). Fenotyp Gy(a-) byl uznán jako nulový fenotyp systému Dombrock.

Kazuistika:
Nalezli jsme ženu (V.F.) s protilátkou proti vysokofrekventnímu antigenu, která byla určena jako anti-Gy^a, a fenotyp V.F. jako Gy(a-). Pokusili jsme se prozkoumat, zda žena není příbuzná s původními nositeli fenotypu Gy(a-) z let 1967 a 1968. Získali jsme údaje o dvou původních rodinách (osobní komunikace). Vyšetření jsme provedli také u bratra, dcery a sestřenice ženy.

Metody:
Sérologie: Vyšetřeno gelovou aglutinací DiaMed ID. Analýza DNA: Byla izolována DNA z krevních vzorků a provedena PCR s následnou sekvenací produktů. Genealogické studie: Provedeny s využitím matrik a úředních záznamů o emigraci do USA v 19. století. Detailní studie byly provedeny u rodiny ženy a u první americké rodiny (SK). U druhé americké rodiny byly studie provedeny jen u jmen existujících v té době v domovské oblasti V.F. Výsledky: Sérologie: V.F.: Do(a-b-); Hy-; Gy(a-). Anti-Gy^a. Protilátka reagovala 2+ v nepřímém antiglobulinovém testu, ± až 2+ v bromelinovém testu. Bratr: Do(a-b+); Hy+; Gy(a+). Reakce slabší než obvykle pravděpodobně heterozygotní stav Gy^a). Dcera: Krevní skupina AB0 shodná s matkou, reakce jejích erytrocytů se sérem V.F. pozitivní 2+ v nepřímém antiglobulinovém testu, negativní v bromelinovém testu. Analýza genomové DNA: V.F.: V genu DO byla nalezena mutace v homozygotním stavu IVS1-2a>g v akceptorovém sestřihovém místě intronu 1. Určena alela DOB (378 T; 624 C; 793 G). Ostatní 3 známé mutace byly sekvenováním vyloučeny. Sestřenice: Nenalezena žádná mutace genu DO. Genealogické studie: Nenalezli jsme žádné společné předky V.F. a amerických rodin, ale předkové jak V.F., tak rodiny SK žili začátkem 19. století ve stejné vesnici. Ve stejné vesnici také nalezeno příjmení jedné osoby a manželského partnera druhé osoby z druhé americké rodiny, ale nemůžeme potvrdit identitu osob

Závěr:
Mutace genu DO u V.F. je stejná jako u tří Gy(a-) osob z let 1967 a 1968. V domovské obci předků V.F. a rodiny SK byly příbuzenské sňatky pravděpodobné, protože obec existuje od 14. století a po staletí tu spolu žije 200–300 obyvatel. Podle našich zjištění považujeme dávné příbuzenství mezi V.F. a přinejmenším rodinou SK za velmi pravděpodobné.

Klíčová slova:
Dombrock, Gregory, fenotyp Gy(a-), sérologie, analýza DNA, PCR, sekvenování, genealogické studie

Úvod

Vysokofrekventní antigen Gregory – Gy^a náleží ke krevnímu skupinovému systému Dombrock. Tento systém patří mezi méně známé skupinové systémy. K jeho vyšetření nejsou běžně dostupná diagnostická séra a sérologické vyšetření antigenů a protilátek působí problémy i ve specializovaných laboratořích. Aloprotilátky proti antigenům systému Dombrock v sérech pacientů jsou totiž zpravidla slabé, bývají součástí směsi jiných aloprotilátek a jejich reaktivita se oslabuje skladováním. Výjimku tvoří protilátka anti-Gy^a. Přitom u protilátek anti-Do^a a anti-Do^b byly popsány potransfuzní hemolytické reakce (6, 15, 27, 29, 30). Situaci dále komplikuje sérologická reaktivita vzácných fenotypů Hy- a Joa- (6, 8, 27).

Antigeny systému Dombrock

Krevní skupinový systém Dombrock zahrnuje 2 kodominantní antigeny – Do^a (DO 001) a Do^b (DO 002), a 3 vysokofrekventní antigeny: Gregory – Gy^a (DO 003), Holley - Hy (DO 004) a Joseph - Jo^a (DO 005) (6, 7, 15, 27). V závorkách je uvedeno označení podle ISBT. Frekvence antigenů Do^a a Do^b se liší mezi rasami. U bílé rasy je frekvence Do^a přibližně 66 %, Dob 82 %. U černé rasy je frekvence Do^a 55 %, Do^b 89 %. U Asiatů se frekvence dále liší podle oblastí, ale obecně je velmi vysoká frekvence antigenu Do^b (98,5–99,5 %) (6, 15, 27).

Frekvence antigenů Gy^a, Hy a Jo^a vysoko překračují 99 %. Fenotypy Hy- a Jo^a- byly nalezeny jen u černé rasy (6, 8, 27). Fenotyp Gy^a- se sporadicky nachází u různých ras po celém světě (1, 2, 13–15, 27).

Biochemie

Antigeny systému Dombrock jsou umístěny na glykoproteinu, který je připojen k membráně erytrocytů pomocí glykosylfosfatidylinositolové kotvy (tzv. GPI-glykoprotein) (6, 15, 27). Tímto způsobem je k membráně krevních buněk připojena řada dalších proteinů, z nichž některé jsou též nositeli jiných krevních skupinových systémů (12). Glykoprotein Do patří do rodiny mono-ADP-ribosyltransferáz. Nebyla však u něj prokázána žádná enzymatická aktivita (6, 11, 12, 15, 27).

Vlastní protein se skládá z 314 aminokyselin a obsahuje signální sekvenci a motiv GPI-kotvy. Dále obsahuje několik potenciálních míst pro N-glykosylaci a 4-5 omocí softwaru Mcysteinových zbytků. Citlivost proteinu na sulfhydrylová činidla ukazuje, že se v terciární struktuře uplatňují disulfidické můstky (6, 15, 27).

Molekulární genetika

Gen DO je umístěn na krátkém raménku chromozomu 12. Zaujímá 14 kB a obsahuje 3 exony (obr. 1) (6, 9, 10, 15, 27). Většina nukleotidových polymorfismů, které specifikují jednotlivé alely systému Dombrock, je umístěna na exonu 2. V současné době je známo 10 alel systému Dombrock. Molekulárně genetický podklad jednotlivých alel je uveden v tabulce 1 (6, 8, 15, 26, 27, 28). Alely DOA a DOB se liší ve třech nukleotidových pozicích. Dvě z nich jsou němé mutace (378 C>T; 126Tyr, a 624T>C; 208Leu), jedna mutace působí záměnu aminokyseliny (missense mutation) (793A>G; Asn365Asp) (6, 9, 10, 15, 27).

HY1, HY2 a JO jsou alely fenotypů Hy- a Jo(a-). Alela GY5 je jedna ze čtyř známých mutací vyvolávajících fenotyp Gy(a-) (6, 8, 15, 27). Alely DOB-SH, DOA-HA, DOA-SH, DOB-WL byly objeveny v posledních zhruba dvou letech (26, 27, 28).

Molekulárně genetický podklad fenotypů Hy- a Jo(a-) vysvětluje částečně jejich sérologickou reaktivitu. Alely HY1 a HY2 mají na pozici 793 guanin, což odpovídá alele DOB. Erytrocyty s fenotypem Hy- reagují slabě se séry anti-Do^b a nereagují se séry anti-Do^a. Alela JO má na pozici 793 adenin, což odpovídá alele DOA. Erytrocyty s fenotypem Jo(a-) reagují slabě se séry anti-Do^a a nereagují vůbec nebo jen velmi slabě se séry anti-Do^b (6, 7, 8, 15, 27).

Objev antigenu Gy^a a jeho vztahu k systému Dombrock Vysokofrekventní antigen Gy^a byl objeven v roce 1967 v USA autory J. Swanson et al. Fenotyp Gy(a-) a protilátka anti-Gy^a byly nalezeny u dvou sester, jejichž rodiče byli pokrevně příbuzní (1). O jeden rok později byly v jiné rodině nalezeny další dvě Gy(a-) sestry (2). U obou rodin byl uveden československý původ.

V roce 1992 autoři J. A. Banks et al. v mezinárodní referenční laboratoři pro imunohematologii v Bristolu prokázali, že antigeny Gy^a, Hy a Jo patří do krevního skupinového systému Dombrock. Fenotyp Gy(a-) byl uznán jako nulový fenotyp systému Dombrock (7). Vykazuje recesivní dědičnost.

Dosud jsou známy čtyři molekulárně genetické mechanismy, které vyvolávají fenotyp Gy(a-) (tab. 2) (3, 4, 5, 6, 27). Proband GY1 je jedna ze dvou sester, u nichž byl fenotyp Gy(a-) v r. 1967 poprvé objeven. GY2 a GY3 jsou dvě sestry z další rodiny československého původu objevené v r. 1968. Molekulárně genetický mechanismus Gy(a-) fenotypu je u GY1, GY2 a GY3 stejný, u všech je také přítomna alela DOB. GY4 pochází z Kanady, HJ z ostrova Reunion Island (ostrov v Indickém oceánu patřící k Francii) a GY5 pochází z USA.

Kazuistika

Na podzim 2004 jsme během rutinního předtransfuzního vyšetření k plánované operaci nalezli u pacientky (V. F.) protilátku reagující se všemi dostupnými erytrocyty kromě jejích vlastních. Základní vyšetření bylo provedeno s komerčními panely (jeden screeningový a dva identifikační) metodou gelové aglutinace DiaMed ID.

Protilátku jsme vyhodnotili jako suspektní protilátku proti vysokofrekventnímu antigenu a krevní vzorky jsme odeslali do Národní referenční laboratoře Ústavu hematologie a krevní transfuze.

Protilátka a fenotyp V.F. byly určeny až v mezinárodní referenční imunohematologické laboratoři International Blood Group Reference Laboratory, NBS, v Bristolu, ve spolupráci s Národní referenční laboratoří pro imunohematologii, ÚHKT Praha. Specifita protilátky byla určena jako anti-Gya a fenotyp jako Do(a-b-); Hy-; Gy(a-).

Charakteristika pacientky

• Žena, 55 let
• Bez transfuze v anamnéze
• 2 těhotenství, 2 porody
• Thyreotoxikóza léčená v minulosti radiojódem, v době vyšetření bez medikace
• Plánována korektivní gynekologická operace

Cíle naší práce

Protože první nositelé fenotypu Gy(a-) v USA v letech 1967–1968 byli uvedeni jako československého původu, rozhodli jsme se prozkoumat, zda naše pacientka V.F. není s těmito původními nositeli Gy(a-) fenotypu příbuzná. Pro tento účel se nám podařilo získat údaje o dvou původních rodinách (osobní komunikace). Při našem výzkumu jsme použili jednak laboratorní metody (sérologie, analýza DNA), jednak genealogické šetření. Laboratorní vyšetření jsme provedli také u bratra, dcery a sestřenice V.F.

Materiál a metody

Sérologie:

Sérologická vyšetření byla provedena gelovou aglutinací DiaMed ID, a to nepřímým antiglobulinovým a bromelinovým testem. Screening antierytrocytárních protilátek byl proveden s komerčním panelem Screening panel 123 (Sanguin Amsterdam). První pokus o identifikaci protilátky byl proveden s komerčními panely erytrocytů Macropanel 16 (Sanguin Amsterdam) a Panocell 16 (Immucor). Protilátka a fenotyp byly určeny v referenčních laboratořích s použitím vzácných inhouse sér a erytrocytů a sér SCARF.

Analýza DNA:

Analýza genomové DNA byla provedena podle postupu popsaného autory Rios et al., Transfusion 2001 (3). Byla izolována DNA z krevních vzorků a provedena PCR s použitím primerů umístěných v oblastech intronů sousedících s exony 1, 2 a 3 (tab. 3). PCR produkty byly separovány na agarózovém gelu pomocí elektroforézy, purifikovány a sekvenovány v obou směrech. Vlastní postup: Genomová DNA pacientky byla izolována z plné krve izolační soupravou QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen) podle přiloženého protokolu. Polymerázová řetězová reakce (PCR) proběhla na přístroji Biometra. Složení reakční směsi PCR o celkovém objemu 25 μl: 0,8 μM primery (odpovídá 20 pmol každého primeru ve směsi), 0,4 mM dNTPs mix (Boehringer Mannheim) (odpovídá 0,1 mM každého dNTP), 1 mM MgCl₂, 1 U HotStar Taq DNA polymerázy (Qiagen) a 1x reakční pufr. Reakční schéma se skládalo z počáteční denaturace (15 minut při 95 °C); následovalo 35 cyklů, každý cyklus se skládal ze tří kroků: denaturace (20 s při 94 °C), nasednutí primerů (20 s při 55 °C) a prodloužení syntetizovaného řetězce tzv. elongace (20 s při 72 °C); pak proběhla závěrečná elongace 10 minut při 72 °C. Vzniklé PCR produkty byly elektroforeticky separovány na 2% agarózovém gelu v přítomnosti ethidium bromidu, přečištěny pomocí MiniElute PCR Purification Kit (Qiagen) a přímo sekvenovány z obou směrů pomocí Big Dye v 1.1 Terminator Cycle řejněnými v databázi EMBL/ /GenBank.

Genealogie:

Genealogické studie byly provedeny s využitím matrik a úředních záznamů týkajících se emigrace do USA v 19. století uložených ve Státním oblastním archivu v Třeboni a ve Státním okresním archivu České Budějovice (16–24). Detailní studie byly provedeny u rodiny V.F. a první americké rodiny (SK) (obr. 3 a 4). V druhé rodině byly genealogické studie provedeny jen u jmen existujících v té době v domovské oblasti V.F., protože jsme neměli dostatek údajů k přesné identifikaci jednotlivých osob. Prozkoumali jsme 6 až 7 generací k přelomu 18. a 19. století.

Výsledky

Sérologie

V.F.: Protilátka byla určena jako anti-Gya. Protilátka reagovala v nepřímém antiglobulinovém testu 2+, v bromelinovém testu ± až 2+. Fenotyp byl určen jako Do(a-b-); Hy-; Gy(a-).

Bratr V.F: Fenotyp byl určen jako Do(a-b+), Hy+, Gy(a+). Reakce byly slabší než obvykle (pravděpodobně heterozygotní stav Gy^a).

Dcera V.F.: Vyšetřili jsme pouze krevní skupinu (shodná s V.F.) a reakci jejích erytrocytů se sérem V.F. Reakce byla pozitivní, a to jen v nepřímém antiglobulinovém testu 2+. V bromelinovém testu byla reakce negativní. Reakce odpovídají heterozygotnímu stavu Gy^a.

Analýza genomové DNA (obr. 2)

V.F: V genu DO byla zjištěna mutace v homozygotním stavu IVS1-2a>g v akceptorovém sestřihovém místě intronu 1, která působí vystřižení exonu 2. Ostatní 3 známé mutace pro Gy(a-) byly sekvenováním vyloučeny. Jde o stejnou mutaci jako u původních nositelů Gy(a-) fenotypu GY1, GY2 a GY3 československého původu (2, 3). Byla určena alela DOB (378 T; 624 C; 793 G).

Sestřenice V.F.: Nebyla prokázána žádná mutace genu DO.

Genealogické studie

Rodina SK, linie SK (obr. 3): Nalezli jsme soubor dokumentů o emigraci a záznamy v matrikách pro nejstarší dostupné předky linie SK, pra-pra-prarodiče, pana J.SK. a jeho ženu A. Pan J.SK. se narodil v roce 1813 a jeho otec byl kovářem v obci M. J.SK. měl šest dětí a rodina požádala o emigraci v roce 1860 (16–18).

Jedním z dětí J.SK. byla dcera A.SK. Narodila se v roce 1848. V záznamech amerických kolegů je uvedena pra-prababička s rodným jménem A.SK. Jako rok narození je uveden rok 1847. Protože dcera pana J.SK., A.SK., byla v době emigrace dítě a její svatba se musela konat v Americe, nemůžeme potvrdit její totožnost s uvedenou pra-prababičkou. Ale totožnost dcery pana J.SK. a A.SK. v záznamech amerických kolegů je poměrně pravděpodobná. Rodina SK, linie MA (obr. 4): Nalezli jsme záznamy o svatbě a další údaje o pra-prarodičích panu T.MA. a slečně M.HE. M.HE. se narodila jako nemanželské dítě. T.MA. ani M.HE. nežili v okolí obce M. Ale manžel matky slečny M.HE. pan V.HE. byl synem sedláka ve vsi vzdálené asi 10 km od obce M a jeho matka pocházela z obce M. Pan V.HE se prohlásil v roce 1837 sňatkem s matkou M.HE za otce děvčete, budoucí slečny M.HE., a dal jí své jméno. Je ale obtížné říci, zdali byl skutečným otcem, protože se oženil s matkou M.HE, když byly M.HE. 2 roky (19, 20, 23, 24).

Rodina paní V.F. (obr. 5): Pokud jde o rodinu paní V.F., vystopovali jsme předky jak z otcovské, tak z mateřské linie v obci M. Pra-pradědeček V.F. z otcovské linie se narodil jako nemanželské dítě v roce 1864 a on, jeho matka i jeho prarodiče žili v obci M. Předkové babičky V.F. z mateřské linie byli sedláci žijící po generace v obci M. Poslední z nich byl praprapradědeček paní V.F. narozený v roce 1832 (19, 21).

Druhá americká rodina: Neměli jsme dostatek údajů, abychom potvrdili přesnou identitu osob uvedených v poskytnutém rodokmenu. Pouze jsme zjistili, že příjmení jedné osoby a příjmení manželského partnera jiné osoby se vyskytovala v obci M. Tato jména jsme také nalezli v širším okolí obce M (18–22).

Diskuse a závěr

Nenalezli jsme žádné společné předky V.F. a amerických rodin. Mutace v genu DO u paní V.F. je ale stejná jako u 3 původních nositelů Gy(a-) fenotypu objevených v USA v letech 1967–1968 (GY1, GY2, GY3). Zjistili jsme dále, že jak předkové V.F. po mateřské i otcovské linii, tak předkové rodiny SK žili začátkem 19. století ve stejné vesnici (obec M).

První záznamy o obci M pocházejí ze 14. století (25). V roce 1869 podle sčítání lidu v tehdejším Rakousko- Uhersku zde žilo 245 obyvatel. Po dobu několika staletí zde žil pospolu poměrně malý počet obyvatel a příbuzenské sňatky tedy byly pravděpodobné.

Opakované příbuzenské sňatky významně zvyšují pravděpodobnost výskytu recesivně dědičného znaku a jeho fenotypového projevu a udržují tento znak v populaci. Protože fenotyp Gy(a-) patří mezi recesivně dědičné znaky, může být jeho udržení v oblasti obce M a nález u paní V.F. důsledkem příbuzenských sňatků v blíže neurčené minulosti.

Podle našich zjištění považujeme dávné příbuzenství mezi V.F. a přinejmenším rodinou SK za velmi pravděpodobné.

Poděkování

Děkujeme našim americkým kolegům (John J. Moulds, Jane Swanson, Rebecca Thomas a Mary Zweber) za poskytnutá data o původních Gy (a-) rodinách. Děkujeme Ondřeji Scheinostovi z oddělení lékařské genetiky za zorganizování analýzy DNA. Také děkujeme všem spolupracovníkům Transfuzního oddělení a Oddělení lékařské genetiky a Robertu Dulferovi ze Společnosti Rožmberk, o.p.s., za podporu, odbornou pomoc a spolupráci. Děkujeme také zaměstnancům Státního oblastního archivu v Třeboni za pomoc při studiu historických záznamů.

MUDr. Helena Banzetová

Transfuzní oddělení Nemocnice České Budějovice,

a.s. B. Němcové 54

370 87 České Budějovice

e-mail: banzetova@nemcb.cz

Došlo do redakce: 27. 2. 2007

Přijato: 2. 4. 2007