Detekce a klinický význam cirkulujících nádorových buněk u pacientů s kolorektálním karcinomem

Overview

Cirkulující nádorové buňky (CTC – circulating tumor cells) jsou nádorové buňky identifikované v periferní krvi pacientů se zhoubným onemocněním. CTC představují velmi zajímavý biomarker se slibným potenciálem pro využití v léčebném managementu pacientů s kolorektálním karcinomem. Na rozdíl od jiných nádorových biomarkerů jsou CTC živé buňky, které nesou molekulární a biologické informace o nádoru jako celku a odrážejí probíhající mutační změny. Detekce CTC z periferní krve je pro pacienta jednoduchou, šetrnou a lehce opakovatelnou metodu tzv. „tekuté biopsie“, nicméně různé metody selekce a detekce CTC znesnadňují klinické použití CTC jako biomarkeru. Přítomnost/množství CTC velmi dobře koreluje s prognózou a přežitím pacientů. Vzhledem k tomu, že CTC mají metastatický potenciál, jeví se znalost vlivu jednotlivých léčebných modalit na množství CTC v krvi jako velmi důležitá. Lze předpokládat, že efektivnější léčebný režim bude asociován se snížením hladin CTC v krvi a také s lepší prognózou. Zvýšení nebo setrvání hladin CTC bude naopak spojeno s rezistencí vůči aplikované léčbě. Rutinní využívání CTC v klinické praxi je limitováno především vysokou cenou vyšetření a velkou variabilitou dostupných dat. Dosud publikované práce sice prokázaly slibný potenciál CTC, nicméně pro jejich využívání v klinické praxi bude potřebný další výzkum.

Klíčová slova:

prognóza – kolorektální karcinom – biomarker – cirkulující nádorové buňky – monitorování léčby

ÚVOD

Léčebný management pacientů s kolorektálním karcinomem představuje neustále aktuální onkochirurgickou problematiku. I přes velký pokrok v časné detekci a efektivitě léčby zůstává generalizace onemocnění nejčastější příčinou smrti u těchto nemocných [1−2]. V posledních desetiletích pozorujeme intenzivní výzkum zaměřený na studium různých diagnostických, prognostických, prediktivních a monitoračních biomarkerů. Mezi hlavní cíle výzkumu biomarkerů patří: 1) stratifikace onkologických pacientů a sledování účinnosti terapie (prediktivní význam), 2) posouzení rizika progrese nebo generalizace onemocnění (prognostický význam) a 3) porozumění biologii nádorů, jejich metastazování a mechanismů rezistence na léčbu.

Mnoho solidních nádorů uvolňuje do systémové cirkulace biomarkery, jako jsou signální molekuly, makromolekuly, nukleové kyseliny, exozomy, fragmenty nebo dokonce celistvé nádorové buňky. Z biochemického hlediska jsou zkoumány různé druhy molekul – proteiny (CEA, CA19-9, CRP atd.), lipidy (apolipoproteiny), cirkulující nádorová RNA, microRNA, cirkulující nádorová DNA (ctDNA) a cirkulující nádorové buňky. Techniky stanovování těchto biomarkerů jsou označovány jako tzv. „liquid biopsy“ a představují velmi atraktivní miniinvazivní techniky detekce molekulárních biomarkerů z tekutých biologických materiálů (periferní krev, pleurální výpotek, ascites, moč atd.) [3,4].

Cílem překládaného review je prezentovat současné možnosti detekce a zejména pak klinického využití cirkulujících nádorových buněk u pacientů s kolorektálním karcinomem.

Cirkulující nádorové buňky – definice a etiopatogeneze

Cirkulující nádorové buňky (CTC – circulating tumour cells) jsou nádorové buňky identifikované v periferní krvi pacientů se zhoubným onemocněním [3]. CTC pocházejí především ze solidních zhoubných nádorů epiteliálního původu (karcinom prsu, prostaty, kolorekta, plic). Přítomnost CTC v krvi je spojena s horší prognózou pacientů a vysokou pravděpodobností výskytu metastatického procesu [5].

CTC byly poprvé popsány již ve druhé polovině 19. století – Thomas Ashworth zdokumentoval v roce 1869 přítomnost nádorových epitelových buněk v krevním řečišti umírající pacientky s karcinomem prsu. Ashworth vyslovil domněnku, že nález těchto buněk vysvětluje přítomnost četných nádorových metastáz v různých anatomických lokalizacích u dané pacientky [6]. Vzhledem k tomu, že k přítomnosti tak velkého množství CTC v krvi (že je lze identifikovat bez využití pokročilých technik izolace) dochází až ve finálních stadiích nádorových onemocnění, nebyla v následujících 120 letech věnována této oblasti výzkumu žádná pozornost.

CTC pocházející z primárního nádoru nebo metastáz se dostávají do oběhu buď jako jednotlivé buňky, nebo jako shluky buněk. Nádorové buňky mohou tvořit shluky samostatně nebo ve spojení s fibroblasty, leukocyty, endoteliálními buňkami a krevními destičkami, čímž vytvářejí nádorové mikroemboly, které jsou odolnější vůči imunitnímu systému hostitele [7].

Z patofyziologického hlediska představují CTC epiteliální nádorové buňky, které mají po předchozí epiteliálně-mezenchymální transformaci schopnost pohybu, migrace a invaze do cév a jsou považovány za hlavní příčinu metastazování zhoubných nádorů [8,9]. Po dosažení vhodného místa pro „zahnízdění“ mohou CTC získat vlastnosti kmenových buněk, opět v procesu epiteliálně-mezenchymální tranzice. To jim dává předpoklad pro rezistenci na léčbu.

Proces metastazování popsal Stephen Paget již v roce 1889 ve své teorii„semeno a půda“ (seed and soil theory). Podle této teorie závisí metastazování na vzájemné komunikaci mezi nádorovými buňkami („semeno“) a specifickým orgánovým mikroprostředím („půda“)

[10]. V současnosti již víme, že potenciál nádorové buňky metastazovat závisí na její interakci s homeostatickými faktory prostředí, které podporují růst, přežívání, angiogenezi, invazi a metastazování.

Na rozdíl od jiných nádorových biomarkerů jsou CTC živé nádorové buňky, které nesou molekulární a biologické informace o nádoru jako celku a odrážejí probíhající mutační změny. Ve srovnání s konvenční biopsií nádoru pak představuje izolace CTC z periferní krve pro pacienta mnohem jednodušší, šetrnější a lehce opakovatelnou metodu biopsie poskytující komplexní údaje o heterogenitě a dynamice nádoru v různých fázích vývoje [4,5].

V diagnostickém a léčebném managementu pacientů s kolorektálním karcinomem má stanovení přítomnosti/množství CTC několik potenciálních možností využití: screening, predikce prognózy, identifikace molekulárních cílů pro biologickou terapii a monitoring odpovědi nádoru na aplikovanou léčbu (chirurgickou, radiační nebo systémovou).

Způsoby detekce CTC

Množství CTC v periferní krvi pacientů je obvykle velmi malé – v 10 ml krve se nachází 1 až 10 nádorových buněk. Každý mililitr krve přitom obsahuje mnoho milionů/miliard standardních krevních elementů. Je uváděno, že na jednu CTC připadá přibližně 106–107 mononukleárních bílých krvinek a 5×109 erytrocytů [7,8]. Je tedy zřejmé, že detekce a izolace CTC v tak velkém množství krevních buněk představuje velkou technologickou výzvu.

Vzhledem ke skutečnosti, že CTC jsou v krevním oběhu vystaveny působení množství nepříznivých mechanických a environmentálních faktorů (oxidační stres, smyková síla/namáhání, imunologické reakce, nepřítomnost růstových faktorů), je jejich odstranění z oběhu velmi rychlé – poločas rozpadu CTC je obvykle 1–2,4 hodiny [7–9].

Zcela zásadní výhodou měření CTC v klinické praxi je skutečnost, že se jedná o miniinvazivní, snadno opakovatelné procedury vyžadující pouze malé množství periferní krve. Nevýhodou je pak vysoká technologická náročnost procesu jejich detekce a izolace. S náročností procesů detekce a izolace nevyhnutně souvisí také vysoká cena prováděných vyšetření.

Metody izolace CTC jsou založeny na rozdílech mezi CTC a normálními krevními buňkami. Tyto rozdíly zahrnují fyzikální vlastnosti (velikost, hustota, elektrický náboj, deformovatelnost) i specifické biologické vlastnosti (exprese povrchových proteinových antigenů, životaschopnost). CTC jsou ve srovnání s krevními buňkami tužší (hustota CTC je >1,077 g/ml) a mají větší průměr než leukocyty (průměr leukocytů je 8–11 μm, naproti tomu CTC u pacientek s karcinomem prsu dosahují velikosti 30 μm) [5].

Technologie detekce CTC se rozdělují do dvou základních kategorií: separace na základě specifických povrchových antigenů (tzv. label-dependentní metody) a separace na základě biofyzikálních vlastností CTC [11].

• Metody závislé na označení (label-dependentní)

Tyto techniky využívají specifické protilátky cílené na povrchové antigeny exprimované nádorovými buňkami. Nejčastěji používaným antigenem je adhezní molekula epiteliálních buněk (EpCAM), protože její exprese je typická pro buňky epiteliálního původu (v krevních buňkách chybí).

Systém CellSearch (menarini silicon biosystems) je komerční platforma, která je v současnosti celosvětově nejrozšířenější technikou a zlatým standardem detekce CTC. Princip této komerční platformy je založen na zachycení CTC pomocí protilátek proti EpCAM s následným přečištěním zachycených buněk pomocí magnetického pole. Systém CellSearch představuje v současnosti jediný systém defekce CTC, který získal schválení FDA (U.S. Food and Drug Administration) [12,13].

Mezi nevýhody CellSearch patří ekonomická náročnost (podmíněno vysokou cenou protilátek), nemožnost CTC dále analyzovat v reálném čase a skutečnost, že platforma identifikuje pouze CTC exprimující EpCAM. Mezi další label-dependentní metody patří např. Adna-Test, MagSweeper, GEM chip nebo CTC-iChip [4,5].

• Metody nezávislé na označení (label-independentní)

Technologie separace jsou založeny na rozdílných biofyzikálních vlastnostech CTC a krevních elementů (především rozdíly ve velikosti, deformovatelnosti, hustotě a dielektrických vlastnostech). Tyto metody získávají v posledních letech na popularitě díky izolaci, která není závislá na protilátkách – to eliminuje potřebu řešit heterogenitu exprese povrchových antigenů buněk. CTC izolované pomocí těchto technik jsou navíc vhodnější pro další analýzu [14].

Nejběžnější metody nezávislé na označení jsou separace pomocí optické mikroskopie a průtoková cytometrie. Jednou z prvních metod pro izolaci CTC byla centrifugace; v současnosti ji využívá např. systém OncoQuick, který kombinuje centrifugaci s filtrací přes mikroporézní membránu [5,11]. Detekční systém MetaCell, který byl vytvořen v ČR, využívá k detekci CTC rozdílnou velikost buněk [15,16].

Metody detekce CTC pomocí obou výše uvedených kategorií mají své výhody a omezení. Za velmi zajímavý lze proto považovat vznik integrovaných mikrofluidních zařízení, která kombinují výhody obou technologií a zvyšují citlivost a specifičnost detekce. Mikrofluidní systémy navíc umožňují identifikaci, separaci a analýzu CTC na jedné platformě, což šetří čas a snižuje poškození a ztráty CTC během procesů přenosu [8,17].

Problémem pro analýzu CTC může být kromě jejich nízké koncentrace v krvi také nízký nebo nedostatečný objem krve u onkologických pacientů. Proto byla vyvinuta zařízení (jako je nanodetektor GILUPI) pro přímou izolaci CTC in vivo. Během 30minutového napojení zařízení na žíly předloktí projde zařízením velký objem krve (až 1,5 l krve). Povrch nanodetektoru je potažen protilátkami cílenými na EpCAM, což umožňuje separaci CTC pro následnou imunocytochemickou nebo molekulární analýzu [18].

CTC – screening

Včasná diagnostika a efektivní sledování dispenzarizovaných pacientů jsou zásadní pro snížení úmrtnosti a zlepšení výsledků léčby kolorektálního karcinomu. Screening kolorektálního karcinomu (sekundární prevence onemocnění) je založen na screeningových TOKS (test na okultní krvácení do stolice) a koloskopiích. Terciální prevence spočívá ve sledování standardních proteinových onkomarkerů (CEA, CA 19-9) a v opakovaných kontrolních endoskopických a zobrazovacích vyšetřeních (CT, MR, event. PET CT). Využití CTC v rámci screeningu kolorektálního karcinomu je v současnosti velmi problematické – hlavním důvodem je poměrně nízká pravděpodobnost přítomnosti CTC v krvi nemocných s časným stadiem kolorektálního karcinomu. Screeningové metody založené na detekci CTC vyžadují jednak použití ultrasenzitivní metody, jednak přímé srovnání s TOKS [19].

CTC – predikce prognózy

Jednou z hlavních možností klinického využití CTC u pacientů s kolorektálním karcinomem je stanovení prognózy a predikce rizika tvorby metastáz. Pokud totiž spolehlivě identifikujeme pacienty, kteří mají horší prognózu (karcinom s vyšším zhoubným potenciálem), můžeme jim v rámci individualizovaného léčebného plánu nabídnout intenzivnější/agresivnější léčbu s vyšší nadějí na úspěch. Naopak pro část pacientů s nízkým rizikem progrese je podání systémové léčby zbytečné a zatěžující.

Korelace mezi přítomností/množstvím CTC a špatnou prognózou pacienta byla v doposud publikovaných pracích jednoznačně prokázána. Přehledně to demonstrují výsledky metaanalýzy, která zahrnovala 3094 pacientů s primárním kolorektálním karcinomem [20]. Pacienti s CTC detekovanými v periferní krvi měli signifikantně horší dlouhodobé onkologické výsledky (kratší celkové přežívání a kratší přežívání bez nemoci). Huang a kol. v recentní práci analyzovali data 1847 pacientů z 11 klinických studií, u kterých byly CTC stanovovány pomocí CellSearch systému. Do metaanalýzy byli zahrnuti pacienti všech stadií kolorektálního karcinomu. Autoři prokázali, že zvýšené hladiny CTC představují silný nezávislý prognostický faktor pro horší přežívání pacientů (signifikantně kratší overal survivall a progression-free survival) [13].

Katsuno a kol. prezentovali výsledky zajímavé práce zahrnující 646 pacientů s kolorektálním karcinomem. Přítomnost CTC byla detekována signifikantně častěji v podskupině pacientů s maligní lymfadenopatií než v podskupině pacientů bez lymfadenopatie (50 % vs. 21 %). Přežívání bez nemoci bylo signifikantně vyšší u pacientů bez CTC po jednom, dvou i třech letech od radikální resekce [21].

U pacientů s kolorektálním karcinomem ve IV. stadiu onemocnění lze diagnostikovat CTC významně častěji a ve větším množství než u pacientů s nižším stadiem nemoci [7,8,20−22]. Tato korelace je podmíněna především skutečností, že cirkulující nádorové buňky jsou reálným zdrojem a zároveň produktem metastatického procesu.

Na prognózu pacientů s generalizovaným kolorektálním karcinomem byla zaměřena metaanalýza Groot Koerkampa a kol. (1329 pacientů z 12 klinických studií) [22]. Přítomnost CTC v krvi pacientů s generalizovaným kolorektálním karcinomem byla asociována s významně horší prognózou. Nemocní s CTC měli přibližně 2,5× vyšší pravděpodobnost úmrtí a 2× vyšší pravděpodobnost progrese nebo recidivy onemocnění.

CTC – monitoring léčebné odpovědi

Léčebný management pacientů s kolorektálním karcinomem je založen na multimodálním přístupu, který je aplikován formou individualizovaného léčebného plánu. Je proto velmi potřebné spolehlivě monitorovat a zhodnotit účinnost jednotlivých léčebných modalit a provést časnou změnu při chybějící/nedostatečné odpovědi na podávanou léčbu. V současnosti je změna systémové léčby obvykle indikována až při průkazu progrese tumorózních/metastatických lézí na zobrazovacích metodách, což znamená několikaměsíční zpoždění.

Dostupná data naznačují, že radikální chirurgická resekce nebo efektivní systémová léčba jsou asociovány s vymizením/snížením množství detekovatelných CTC. Elevace nebo setrvání hladin CTC znamená progresi nemoci, resp. rezistenci vůči podávané léčbě [20–23].

Detekce CTC v periferní krvi více než 24 hodin po chirurgické resekci představuje nezávislý prognostický ukazatel recidivy nemoci a/nebo špatné prognózy. Yang a kol. ve studii zahrnující 138 pacientů po radikální resekci kolorektálního karcinomu prokázali, že detekce CTC v krvi v pooperačním období je asociována se špatnou prognózou (signifikantně kratší přežívaní pacientů a kratší přežívání bez nemoci) [24]. Výsledky této studie ukazují, že pooperační hodnocení CTC je přínosné pro přesnější odhad rizika a úpravu individuálních strategií sledování a léčení. Ve srovnání se standardními nádorovými biomarkery (CEA, CA19-9) jsou změny v počtu CTC citlivější a obvykle pozitivně korelují s progresí onemocnění.

U pacientů po radikální resekci primárního nádoru přetrvává metastatický potenciál onemocnění ve formě CTC a diseminovaných nádorových buněk. Tyto buňky mohou dát základ vzniku makroskopických metastáz a tím i špatné prognóze. Je proto potřebné identifikovat a preferovat takové léčebné modality, které snižují hladiny CTC a tím snižují riziko vzniku lokální či vzdálené recidivy onemocnění.

Pro chirurgickou praxi velmi zajímavé výsledky detekce CTC publikoval Papavasiliou a kol. U pacientů podstupujících radiofrekvenční ablaci jaterních metastáz kolorektálního karcinomu bylo zjištěno zvýšení množství CTC v krvi až na sedminásobek pooperačních hodnot [25]. Tento výsledek naznačuje, že poškození nádoru může mít za následek vyšší riziko generalizace onemocnění hematogenním metastazováním. Riziko peroperačního poškození nádoru velmi úzce souvisí s konceptem totální mezorektální excize (TME) a kompletní mezokolické excize (CME). Exaktní preparace ve správných embryonálních vrstvách snižuje riziko traumatizace nádoru a tím i riziko uvolnění CTC a vzniku metastáz.

Na základě těchto experimentálních výsledků by počet CTC mohl být v budoucnu hodnotícím kritériem pro posouzení kvality chirurgické resekce. Při srovnání předoperačních a pooperačních hodnot CTC by pak bylo možné stanovit riziko hematogenních metastáz a potřebu, resp. intenzitu adjuvantní léčby.

V odborné literatuře nacházíme množství prací, které přesvědčivě dokumentují spolehlivost CTC jako ukazatele rezistence na podávanou systémovou léčbu. Například Kawahara a kol. demonstrovali vztah mezi CTC a odpovědí na chemoterapii u pacientů s generalizovaným kolorektálním karcinomem. Pokud byly CTC detekovatelné před zahájením léčby a po léčbě detekovatelné nebyly, pacienti měli významně delší celkové přežívání [26]. Tol a kol. publikovali studii zahrnující 413 pacientů s metastazujícím kolorektálním karcinomem, kteří byli léčeni první, druhou nebo třetí linií systémové léčby. Pacienti s více než 3 CTC v 7,5 ml periferní krve po zahájení léčby měli signifikantně kratší progression-free survival a overal survivall [27].

Mezi první práce dokumentující využití CTC jako důvodu ke změně podávané systémové léčby patří studie publikovaná Gaudagnim a kol. v roce 2020. O léčbě pacientů s neresekovatelným kolorektálním karcinomem bylo rozhodováno na základě CTC, věku a komorbidit pacientů. Podskupina pacientů, u kterých byla léčba podávána na základě CTC, měla signifikantně delší medián přežití a progression-free survival (ve srovnání s podskupinou léčenou na základě věku a komorbidit). Autoři konstatují, že CTC lze efektivně využít k výběru terapie u neresekovatelného kolorektálního karcinomu [28].

V klinické praxi se již setkáváme s využitím ctDNA v případech, kdy není možná/dostupná standardní tkáňová biopsie nádoru. U těchto pacientů ESMO guidelines doporučují vyšetření ctDNA, aby tak bylo možné provést genotypizaci nádoru a dle výsledků nasadit cílenou (biologickou) protinádorovou léčbu [29].

Monitorování přítomnosti/dynamiky CTC zatím není v klinické praxi ekvivalentem zavedených onkologických parametrů, jako jsou celkové přežití, 5leté přežití nebo disease-free interval. Nespornou výhodou CTC proti standardním parametrům přežívání je jednoduchost jejich stanovení a především rychlá (téměř okamžitá) dostupnost výsledků. Vzhledem k neustálému rozvoji biomedicínských technologií lze předpokládat, že v průběhu nejbližších let se CTC stanou dostatečně senzitivním biomarkerem účinnosti jednotlivých léčebných modalit na prognózu pacientů.

ZÁVĚR

Klinický význam detekce CTC u pacientů s kolorektálním karcinomem v posledních letech narůstá. Přítomnost/množství CTC velmi dobře koreluje s prognózou a přežitím pacientů. Vzhledem k tomu, že CTC mají metastatický potenciál, jeví se znalost vlivu jednotlivých léčebných modalit na množství CTC v krvi jako velmi důležitá. Lze předpokládat, že efektivnější léčebný režim bude asociován se snížením hladin CTC v krvi a také s lepší prognózou. Zvýšení nebo setrvání hladin CTC bude naopak spojeno s rezistencí vůči aplikované léčbě. Rutinní využívání CTC v klinické praxi je limitováno především vysokou cenou vyšetření a velkou variabilitou publikovaných dat (různé metody stanovení CTC, odlišné cut off/nonexistence cut-off, různá úroveň evidence a vysoká heterogenita studijních souborů). Dosud publikované práce sice prokázaly slibný potenciál CTC, nicméně pro jejich využívání v klinické praxi (jako neinvazivní diagnostické a monitorovací modality) bude potřebný další výzkum.

Podpořeno MZ ČR – RVO (FNOs/2023).

Konflikt zájmů
Autoři článku prohlašují, že nejsou v souvislosti se vznikem tohoto článku ve střetu zájmů a že tento článek nebyl publikován v žádném jiném časopise, s výjimkou kongresových abstrakt a doporučených postupů.

prof. MUDr. Peter Ihnát, Ph.D., MBA
Chirurgická klinika FN Ostrava
17. listopadu 1790 
708 52 Ostrava
e-mail: peter.ihnat@fno.cz