Sinusoidální obstrukční syndrom indukovaný monokrotalinem v experimentu na velkém zvířeti – pilotní studie

Overview

Úvod:
Sinusoidální obstrukční syndrom (SOS) je onemocnění vznikající na základě toxického poškození jaterních sinusoid. Tento syndrom bývá nejčastěji navozen myeloablativní radiochemoterapií u pacientů před transplantací hematopoetických kmenových buněk, dále pak oxaliplatinou především u pacientů s jaterními metastázami kolorektálního karcinomu. Cílem naší studie bylo etablovat model SOS na velkém zvířeti, který by umožnil další studium tohoto onemocnění a usnadnil translaci experimentálních výsledků do humánní medicíny.

Metody:
Do této pilotní studie bylo zařazeno celkem 27 prasat domácích (plemeno – přeštické černostrakaté prase) (12 samic). Z toho 5 zvířat tvořilo skupinu s vyšším dávkováním monokrotalinu (180 mg/kg) a u zbylých 22 byla podaná dávka monokrotalinu nižší (36 mg/kg). Monocrotalin byl aplikován intraportálně a za týden po jeho aplikaci byla provedena resekce levého laterálního laloku jater. Zvířata byla sledována celkem 3 týdny po aplikaci monokrotalinu. Byla prováděna pravidelná ultrasonografická vyšetření, stanovovány biochemické markery jaterních a ledvinných funkcí a ze získaných bioptických vzorků jaterního parenchymu provedeno histologické vyšetření.

Výsledky:
Charakter toxického postižení jater, které jsme zaznamenali u všech zvířat, odpovídal jak makroskopicky, tak mikroskopicky obrazu SOS. Zaznamenali jsme elevaci AST, ALT, bilirubinu a amoniaku po aplikaci monokrotalinu. Při ultrasonografickém vyšetření byla patrná vyšší echogenita poškozeného jaterního parenchymu v porovnání s parenchymem zdravým. Ze skupiny prvních pěti zvířat, kterým byla aplikována dávka 180 mg/kg, uhynula všechna zvířata ještě před resekcí levého laterálního laloku jater (1. až 3. den po aplikaci). Ve druhé skupině 22 prasat s nižším dávkováním došlo k úmrtí před provedením jaterní resekce ve 3 případech (6. a 7. den). K předčasnému úmrtí po resekci jater došlo v 8 případech (7. až 17. den po aplikaci). 11 zvířat přežívalo po celou dobu experimentu. Příčinou úmrtí (v rámci obou skupin) byl u 10 zvířat metabolický rozvrat a u 4 zvířat exsanguinace. V obou případech se jednalo o důsledek těžké hepatopatie. 2 ze zvířat zemřela z důvodu nesouvisejícího přímo s intoxikací monokrotalinem (strangulace tenkého střeva, gastrektázie).

Závěr:
Etablovali jsme model SOS na velkém zvířeti navozený aplikací monokrotalinu o dávce 36 mg/kg cestou portální žíly. Jedná se o první nám známý model SOS navozeného monokrotalinem na velkém zvířeti. Tento model může pomoci při výzkumu jak terapeutického ovlivnění, tak pro hodnocení efektu chirurgické léčby v terénu SOS.

Klíčová slova:
sinusoidální obstrukční syndrom − monokrotalin − oxaliplatina − hepatotoxicita − experimentální model

ÚVOD

Sinusoidální obstrukční syndrom (SOS), známý také jako blue liver syndrome a dříve jako jaterní veno-okluzivní choroba, vzniká na základě toxického poškození jaterních sinusoid. Nejčastěji se lze s tímto onemocněním setkat u pacientů po transplantaci hematopoetických kmenových buněk, kde je navozeno myeloablativní radiochemoterapií [1]. Další z příčin pak bývá léčba oxaliplatinou nejčastěji u pacientů s jaterními metastázami kolorektálního karcinomu [2,3]. Podstatou tohoto syndromu je ztráta integrity stěny jaterních sinusoid vedoucí k jejich obstrukci. Později se může rozvinout i perisinusoidální fibróza či fibrotická obstrukce centrilobulárních žil a nodulární regenerativní hyperplazie [4].

Jsou popsány modely SOS u hlodavců za použití různých pyrolizidinových alkaloidů. Nejčastěji je však uváděn monokrotalin, a to u studií, které se zabývají studiem jeho etiopatogeneze, diagnostikých markerů a případného terapeutického ovlivnění [5,6,7]. Některé ze studií dokonce poukazují na možné lepší přihojení transplantovaných hepatocytů v játrech s SOS navozeným monokrotalinem [8,9]. Doposud však nebyl vytvořen model SOS na velkém zvířeti.

Díky zmíněným modelům u hlodavců byla popsána patofyziologie SOS navozeného monokrotalinem. Primárními cílovými buňkami poškozenými monokrotalinem jsou sinusoidální endoteliální buňky jater. Reaktivní metabolit monokrotalinu poškozuje F-aktin v těchto buňkách. Dochází ke ztrátě jejich fenestrace. Vznikají mezi nimi mezery a ztrácí se tak integrita endotelu sinusoid. Erytrocyty protékající sinusoidou tak pronikají do Disseho prostoru, způsobují mikrodisekci endotelu a embolizaci s obstrukcí jaterních sinusoid. Tyto změny jsou patrné již v průběhu prvních 48 hodin po aplikaci monokrotalinu. V důsledku porušené mikrocirkulace na úrovni jaterních sinusoid dochází mezi třetím a pátým dnem po aplikaci k centrilobulárním hemoragickým nekrózám. V tomto stadiu jsou již přítomny klinické známky v podobě hepatomegalie, ascitu a hyperbilirubinemie. Šestý a sedmý den po aplikaci dochází k subendoteliální a adventiciální fibrotizaci centrilobulárních žil s přetrváváním klinických symptomů. Od osmého až desátého dne dochází u některých zvířat k postupné úpravě jaterního parenchymu, u jiných SOS perzistuje [3,5].

Pokud je u pacientů s jaterními metastázami kolorektálního karcinomu indikována chemoterapie na bázi oxaliplatiny, může dojít ke vzniku SOS, který je pak limitací extenzivní jaterní resekce, může snižovat pooperační regenerační kapacitu jater a zvyšovat pooperační morbiditu a mortalitu [10,6].

Cílem naší studie bylo etablovat model SOS na velkém zvířeti, který by umožnil další studium tohoto onemocnění a usnadnil translaci experimentálních výsledků do humánní medicíny.

METODY

Experiment byl proveden dle platné legislativy a s povolením Ministerstva zemědělství ČR. Byly dodrženy stávající předpisy a směrnice pro chov a experimentální používání zvířat v souladu se zákonem č. 246/1992 upraveným vyhl. č. 207/2004 s následným výkladem k vyhlášce č. 39/2009. Jako experimentální zvíře bylo zvoleno prase domácí (plemeno – přeštické černostrakaté prase), pracovali jsme s jedinci z jatečního chovu o průměrné hmotnosti 28 kg (20,6–40 kg, směrodatná odchylka 6,86 kg).

Do této pilotní studie bylo zařazeno celkem 27 zvířat (12 samic). Z toho 5 zvířat tvořilo skupinu s vyšším dávkováním monocrotalinu (180 mg/kg) a u zbylých 22 byla podaná dávka monocrotalinu nižší (36 mg/kg). Zvířata byla operována v celkové anestezii za použití mechanické ventilace. Na začátku experimentu byl u všech zvířat zaveden port katétr (Smith Medical, Minnesota, USA) cestou v. jugularis. Následně byla provedena střední laparotomie, z levého laterálního laloku jater odebrán bioptický vzorek zdravé jaterní tkáně a poté intraportálně aplikován roztok monokrotalinu (Oakwood Products, Inc., South Carolina, USA). Krystalky monokrotalinu byly rozpuštěny v roztoku 1M HCl (3–4 ml HCl na 1 g monocrotalinu) a následně rozředěny ve fosfátovém pufru (phosphate-buffered saline – PBS) v celkovém množství odpovídajícímu dosažení pH 7,4 [11,12]. U skupiny prvních pěti zvířat jsme aplikovali dávku 180 mg/kg váhy zvířete. Tato dávka byla převzata ze studií zabývajících se přípravou modelu SOS u myší [8,5]. Z důvodu předčasného úmrtí (1x první den po aplikaci, 1x druhý den po aplikaci a 2x třetí den po aplikaci) čtyř zvířat pod obrazem jaterního selhání po aplikaci této vysoké dávky byla dávka snížena. (Jedno zvíře z této skupiny zemřelo první pooperační den z důvodu chirurgických komplikací.) Monokrotalin je využíván také k přípravě modelu plicní arteriální hypertenze (PAH), a to jak u hlodavců, tak u prasat. U hlodavců je dávka potřebná k navození SOS třikrát vyšší než dávka dostatečná k navození PAH [13,14]. U prasat je popsána dávka monokrotalinu pro navození PAH 12 mg/kg [15]. Byl zachován stejný vztah mezi dávkami jako u hlodavců a pro navození SOS u následujících 22 prasat v tomto experimentu byla tedy zvolena dávka 36 mg/kg.

Po aplikaci monocrotalinu byla uzavřena laparotomie, zvířata extubována a v následujícím týdnu sledována. První tři dny po aplikaci měla zvířata úplnou restrikci stravy z důvodu snížení příjmu dusíkatých látek a byly jim jednou denně podávány infuzní roztoky (Hartmanův roztok – 15 ml/kg, 10% roztok glukózy − 15 ml/kg). V následujících dnech došlo k postupné realimentaci. Přístup k pitné vodě byl zvířatům umožněn v průběhu celého experimentu.

7. den po aplikaci byla zvířata opět operována v celkové anestezii, byla provedena resekce levého laterálního laloku jater. Po tomto výkonu byla zvířata sledována další 2 týdny. 21. den po aplikaci monokrotalinu pak byla zvířata v celkové anestezii usmrcena a byly odebrány bioptické vzorky jater.

V průběhu experimentu byly prováděny pravidelné náběry krve cestou port katétru, a to: 1) před aplikací monocrotalinu, 2) 3. den po aplikaci monokrotalinu, 3) 7. den – před provedením jaterní resekce, 4) 7. den – ihned po resekci a 5) 7. den – 2 hodiny po resekci, dále 6) 8., 7) 10., 8) 14., 9) 17. a 10) 21. poaplikační den. Byly stanoveny tyto biochemické parametry: bilirubin, alkalická fosfatáza (ALP), gamaglutamyltransferáza (GGT), cholinesteráza (CHE), aspartátaminotransferáza (AST), alaninaminotransferáza (ALT), amoniak, urea a kreatinin.

Ultrasonografická vyšetření byla provedena před aplikací monokrotalinu a 7., 10., 14., 17. a 21. den po aplikaci. Při ultrasonografických kontrolách byly sledovány změny charakteru jaterního parenchymu a případný výskyt komplikací uvedeného výkonu.

V rámci histologického vyšetření vzorků jaterní tkáně jsme porovnávali zdravý jaterní parenchym před aplikací monokrotalinu a parenchym poškozený SOS týden a 3 týdny po aplikaci monokrotalinu. U zvířat, která předčasně zahynula, jsme vyšetřili jaterní tkáň získanou při pitvě. Tkáňové bločky byly zpracovány standardní histologickou technikou parafínových řezů o síle 4 µm. Pro histologické hodnocení byly vybrány vždy dva náhodné řezy z jednoho bločku pro každou z metod barvení: hematoxylin a eosin (přehledné barvení) a anilinová modř s jádrovou červení (detekce vaziva).

Výsledky biochemického vyšetření byly převedeny do krabicových grafů. Vyhodnocení časového vývoje jednotlivých biochemických parametrů bylo provedeno porovnáním hodnot těchto parametrů v jednotlivých časových úsecích za pomoci Wilcoxonova testu. Za hladinu významnosti testu byla stanovena hodnota p=0,05.

VÝSLEDKY

U všech 27 prasat, kterým byl aplikován monokrotalin, jsme pozorovali známky toxického postižení jaterního parenchymu. Charakter tohoto postižení odpovídal obrazu SOS (Obr. 1). Ze skupiny prvních pěti zvířat, kterým byla aplikována dávka 180 mg/kg, uhynula všechna zvířata ještě před resekcí levého laterálního laloku jater, tedy v průběhu prvního týdne po aplikaci alkaloidu (1. až 3. den po aplikaci) (Tab. 1). V jednom z případů se nejednalo o úmrtí způsobené aplikací monokrotalinu a bude vysvětleno dále. Mortalita v důsledku intoxikace v první skupině pěti zvířat s vyšším dávkováním tedy činila 80 %. Ve druhé skupině 22 prasat s nižším dávkováním došlo k úmrtí před provedením jaterní resekce ve 3 případech (6. a 7. den po aplikaci). K předčasnému úmrtí po resekci jater došlo v 8 případech (7. až 17. den po aplikaci). 11 zvířat přežívalo po celou dobu experimentu. V celém souboru zvířat jsme zaznamenali následující příčiny úmrtí. U 10 zvířat byl příčinou metabolický rozvrat v důsledku jaterního selhání vyvolaného intoxikací monokrotalinem. Ve čtyřech případech zvířata uhynula z důvodu exsanquinace do dutiny břišní při koagulopatii způsobené těžkou hepatopatií při SOS. Jedno ze zvířat uhynulo první den po aplikaci monokrotalinu kvůli strangulaci tenkého střeva při rotaci mezenteria, další zvíře pak 17. den po aplikaci pro vysoký ileus a gastrektázii způsobené adhezemi v dutině břišní. V těchto dvou případech se jednalo o komplikace samotného chirurgického výkonu, ne tedy o úmrtí způsobené intoxikací monokrotalinem.

USG nález

Při ultrasonografických kontrolách jsme zaznamenali vyšší echogenitu jaterního parenchymu poškozeného SOS v porovnání s parenchymem zdravým (Obr. 2).

Biochemické vyšetření

Biochemické markery jaterních funkcí korelovaly s rozvojem SOS. Zaznamenali jsme peak sérové hladiny AST a ALT třetí den po aplikaci monokrotalinu a dále první den po jaterní resekci (Obr. 3a, 3b). Hladina bilirubinu byla zvýšena oproti stavu před aplikací monokrotalinu a nejvyšší hladinu bilirubinu jsme u zvířat zjistili třetí den po resekci jater (Obr. 3c). Hladina amoniaku byla po aplikaci alkaloidu rovněž zvýšena a korelovala s tíží klinického stavu operovaných zvířat (Obr. 3d). U ostatních stanovovaných biochemických parametrů jsme nezaznamenali signifikantní změny po aplikaci monokrotalinu ani po jaterní resekci.

Histologické vyšetření

Bioptické vzorky jater získané při jaterní resekci prováděné týden po aplikaci monokrotalinu vykazovaly histologický obraz odpovídající SOS. Bylo pozorováno mozaikovité poškození jater s hemoragickými nekrózami center lobulů. V jiných lobulech pak byly zastiženy jen drobné hemoragie a překrvení sinusoid (Obr. 4c). U zvířat uhynulých předčasně (před jaterní resekcí) jsme zaznamenali výraznější postižení jaterního parenchymu oproti tkáni získané u ostatních zvířat při resekci, a to v podobě rozsáhlých hemoragických nekróz center lobulů až celého objemu lobulů (Obr. 4b). Na bioptických vzorcích získaných 3 týdny po aplikaci monokrotalinu (2 týdny po jaterní resekci) byla patrná částečná regrese jaterního poškození s akcentací fibrotizace jater. V některých lobulech přetrvala hemoragická nekróza, jiné byly bez nekróz pouze s drobnými hemoragiemi. V těchto vzorcích byla také zastižena mononukleární infiltrace periportálního vaziva (Obr. 4d).

DISKUZE

Rozvoj SOS navozeného aplikací monokrotalinu cestou vena portae u prasete domácího odpovídal rozvoji SOS v případě myšího modelu [5,16]. Struktura našeho experimentu neumožňovala z důvodu použití co možná nejnižšího počtu zvířat získání bioptického vzorku jater dříve než 7. den po aplikaci monokrotalinu při provedení jaterní resekce. Tyto vzorky jsme získali pouze od předčasně uhynulých zvířat. Závažnost postižení jsme proto před samotnou resekcí posuzovali pomocí biochemických parametrů. Zaznamenaný peak hladin ALT a AST třetí den po aplikaci alkaloidu odpovídá periodě 3. až 5. dne, ve které DeLeve zastihl u myšího modelu nejtěžší postižení jaterního parenchymu, dokumentované pomocí in vivo mikroskopie i histologického vyšetření [5,16]. Vzestup hladin ALT a AST po aplikaci monokrotalinu uvádí ve své studii i Srinivasan, který však myši usmrcoval již po 24 hodinách [12]. Další peak hladiny AST a ALT spolu s nárůstem hladiny bilirubinu jsme zaznamenali den po provedení jaterní resekce, stejně jako uvádí ve své studii na myších Schiffer [10]. Schiffer ovšem prováděl resekci jater již čtvrtý den po aplikaci monokrotalinu. Námi zaznamenaná elevace hladiny bilirubinu také odpovídá ostatním studiím a je jednou ze známek rozvinutého SOS [10,17]. Insuficience jaterních funkcí při SOS pak vysvětluje zvýšenou hladinu amoniaku.

Histologický obraz jaterní tkáně získané při předčasném úmrtí nebo při jaterní resekci odpovídal popisu jaterního parenchymu u myších modelů SOS [16]. Částečná regrese poškození jater, kterou jsme pozorovali na vzorcích odebraných na konci experimentu, tedy 3 týdny po aplikaci monokrotalinu, odpovídá popisovanému zlepšení stavu v ostatních studiích [3,5].

Makroskopické změny sledované při pitvě, jaterní resekci či ukončení experimentu odpovídají makroskopickému obrazu lidských jater postižených SOS [4].

Zmíněná vysoká úmrtnost u prasat, kterým byla aplikována dávka monokrotalinu 180 mg/kg, byla zaznamenána i ve studii Masabuchiho, který navozoval model SOS u křečků a při perorální dávce 180 mg/kg dosáhl téměř 100% úmrtnosti první den po aplikaci [18]. Joseph naopak ve své studii na myších používal dávku monokrotalinu 200 mg/kg, aplikovanou injekčně do sleziny a nezaznamenal vysokou úmrtnost [8]. Demonstrované velké rozdíly v toleranci dávky monokrotalinu i mezi jednotlivými druhy hlodavců poukazují na význam etablování modelu monokrotalinem indukovaného SOS u vyššího taxonu, kde předpokládáme ještě větší mezidruhové fyziologické rozdíly. 

Robinson publikoval jako první model SOS u myší indukovaný přímo oxaliplatinou slibující podobnější patofyziologii lidskému SOS, také navozenému oxaliplatinou [19].

Byly zkoumány možnosti farmakologické prevence či terapie SOS, a to jak na zvířecích modelech, tak v humánní medicíně. Například Nakamura ve své studii popisuje použití lidského rekombinantního trombomodulinu, který v případě myšího modelu zmírnil SOS a zvýšil přežití po resekci jater [20]. Další zkoumanou látkou je regorafenib – nízkomolekulární kinázový inhibitor, který se používá jako monoterapie metastatického kolorektálního karcinomu nebo i v kombinaci s oxaliplatinou. Účinky regorafenibu u myšího modelu SOS zkoumal Okuno a došel k podobným výsledkům jako Nakamura, tedy ke zmírnění SOS a zlepšení pooperační mortality po resekci jater [21]. Klinické studie prokázaly příznivý účinek defibrotidu, antitrombinu III, prostaglandinu E1, nízkomolekulárního heparinu a kyseliny ursodeoxycholové, vzhledem k jejich vedlejším účinkům a horší dostupnosti některých z nich však nejsou příliš využívány [20].

Poznatky z modelu na zvířeti vyššího taxonu, jako je prase domácí, mohou být snáze přeneseny do humánní medicíny. Model SOS na velkém zvířeti umožňuje hodnocení efektu chirurgické léčby, kterou vyžadují pacienti s jaterními metastázami a SOS. Dále lze tento model využít pro testování farmakologického ovlivnění samotného SOS. Význam studia SOS v experimentu umocňuje vysoké procento pacientů v současné době přeléčených chemoterapeutickými režimy obsahujícími oxaliplatinu, a tedy i potenciálních adeptů chirurgické léčby.

ZÁVĚR

Etablovali jsme model SOS na velkém zvířeti navozený aplikací monokrotalinu o dávce 36 mg/kg cestou portální žíly. Tento model může pomoci ve výzkumu terapeutického ovlivnění tohoto syndromu či posloužit jako model pro hodnocení efektu chirurgické léčby v terénu SOS. V rámci další studie na rozšířeném počtu zvířat bude potřeba hlouběji zkoumat histologické a ultrasonografické nálezy.

Tato studie byla podpořena programem UNCE/MED/006 „Centrum klinické a experimentální jaterní chirurgie“ Univerzity Karlovy a Národním programem udržitelnosti I (NPU I) č. LO1503 poskytovaným Ministerstvem školství, mládeže a tělovýchovy.

Konflikt zájmů

Autoři článku prohlašují, že nejsou v souvislosti se vznikem tohoto článku ve střetu zájmů a že tento článek nebyl publikován v žádném jiném časopise.

MUDr. Richard Pálek

Chirurgická klinika, UK, LF v Plzni, FN Plzeň

alej Svobody 80

304 60 Plzeň

e-mail: palekr@fnplzen.cz