Stanovení exprese CEA, EGFR a hTERT v peritoneální laváži u pacientů s adenokarcinomem pankreatu metodou RT-PCR

Overview

Úvod:
Cílem práce je posoudit význam CEA, EGFR a hTERT jako markerů okultních nádorových buněk v břišní laváži v predikci léčebných výsledků u adenokarcinomu pankreatu, včetně stanovení jejich cut-off hodnot.

Metoda:
Práce porovnává skupinu 87 pacientů operovaných pro duktální adenokarcinom pankreatu ve stadiu III - IV (UICC) u nichž byl proveden paliativní výkon (biliodigestivní spojka, odběr biologického materiálu pro následnou onkologickou léčbu) s kontrolní skupinou 24 pacientů. U všech pacientů byly odebrány vzorky peritoneální laváže za použití 100 ml fyziologického roztoku (phosphate buffered saline, pH=7,2) do transportních lahví obsahujících 1,5 ml 0,5M EDTA a 10 ml fetálního bovinního séra. Celková RNA všech vzorků byla purifikována a zpracována procesem reverzní transkripce. Okultní nádorové buňky v peritoneální laváži byly detekovány RT-PCR metodou využitím CEA, EGFR a hTERT. Sekundárním cílem studie bylo stanovení cut-off hodnot exprese těchto markerů. Pro statistické analýzy byly použity softwary R (www.r-project.org) a Statistica (StatSoft, Inc., USA).

Výsledky:
Průměrná exprese CEA, EGFR a hTERT v peritoneální laváži kontrolní skupiny byla 2501, 716749, resp. 104 kopií mRNA/µg RNA. Prahové, cut-off hodnoty, byly stanoveny jako „průměr + 2x směrodatná odchylka“. Hodnoty absolutní exprese byly dále normalizovány na expresi house-keepingového genu glyceraldehdyd-3-fosfát dehydrogenázy (GAPDH). Cut-off hodnoty testovaných markerů po normalizaci byly 4,89; 115,88 resp. 0,02 kopií mRNA genu/kopií mRNA GAPDH. V případě absolutní exprese testovaných markerů, pouze hTERT dokáže statisticky významně (p <0,001) odlišit obě analyzované skupiny, kdy pacienti s pokročilým adenokarcinomem pankreatu mají vyšší hodnotu exprese hTERT. Absolutní exprese CEA ani EGFR nevykazovala statisticky signifikantní rozdíly mezi skupinou s pokročilým karcinomem pankreatu a kontrolní skupinou. Použitím přesnějších - normalizovaných hodnot exprese testovaných markerů byla prokázána statisticky významně vyšší exprese CEA a hTERT (p<0,005, resp. p<0,001) u pacientů s pokročilým adenokarcinomem pankreatu v porovnání s kontrolní skupinou.

Závěr:
Absolutní exprese hTERT v peritoneální laváži pacientů s pokročilým adenokarcinomem pankreatu byla signifikantně vyšší v porovnání s kontrolní skupinou. Naopak absolutní exprese CEA a EGFR nebyla signifikantně rozdílná.

Klíčová slova:
karcinom pankreatu − okultní nádorové buňky − peritoneální laváž − RT-PCR – CEA – EGFR − hTERT

Úvod

Vedle uzlin, systémové krve a kostní dřeně je peritoneální dutina dalším sledovatelným kompartmentem v procesu šíření karcinomu pankreatu. Studie exprese markerů okultních epiteliálních nádorových buněk (karcinoembryonálního antigenu − CEA, receptoru pro epidermální růstový faktor − EGFR a lidské telomerázy − hTERT) v abdominální laváži nemocných s různými stádii adenokarcinomu pankreatu ukázala, že zvýšenou expresi EGFR a CEA v tomto kompartmentu je možno považovat za negativní prognostický faktor přežívání, korespondující s klinickým stadiem a gradem tumoru [1]. Publikací zaměřených na prognosticky významné markery okultních nádorových buněk metodou PCR v peritoneální laváži u pacientů s karcinomem pankreatu není mnoho a výsledky jsou často nejednoznačné [1,2,3,4,5,6,7,8,9]. Eguchi a spol. prokázal metodou PCR pozitivitu CEA ve vzorcích peritoneální laváže u 21,7 % (15/69) radikálně operovaných pacientů s rakovinou slinivky břišní, a tito pacienti měli kratší dobu přežití bez progrese onemocnění i celkovou dobu přežití (p=0,004 a p=0,01) [3]. Broll a spol. rovněž referuje o vysoké pozitivitě CEA (63 %) v peritoneální laváži pacientů s karcinomem pankreatu, ale současně nedoporučuje metodu PCR založenou na analýze CEA transkriptů pro detekci okultních nádorových buněk v peritoneální laváži pro vysokou míru falešně pozitivních výsledků (38 %) u kontrolních vzorků peritoneální laváže u zdravých osob [7]. Příčinou rozdílných výsledků i závěrů mohou být různé použité metody, různý výběr markerů a malé soubory testovaných vzorků (pacientů).  Klos a spol. zjistili statistickou souvislost mezi expresí EGFR v portální krvi a klinickým stadiem (p<0,006), expresí EGFR v portální krvi a stupněm diferenciace primárního tumoru (p<0,045) a vysokou míru exprese EGFR v peritoneální laváži u pacientů s metastatickým postižením oproti pacientům bez přítomnosti metastáz (p<0,015), exprese EGFR (p=0,01) byla spojena s kratším celkovým přežíváním pacientů s adenokarcinomem pankreatu [4]. V peritoneální laváži byly testovány markery CEA a CA 19-9 jak RT-PCR tak biochemickými metodikami [10]. EGFR a hTERT dosud testovány nebyly.

Současná studie předkládá výsledky srovnání exprese markerů CEA, EGFR a hTERT v abdominální laváži u nemocných s pokročilým duktálním adenokarcinomem pankreatu a u kontrolní skupiny nemocných bez nádoru či zánětlivého onemocnění. Cílem studie bylo i stanovení a ověření cut-off hodnot pro tyto markery v peritoneální laváži.

Metoda

Pacienti s adenokarcinomem pankreatu

Do studie bylo zařazeno 87 pacientů operovaných na I. chirurgické klinice FN Olomouc v letech 2007−2010 pro vývodový adenokarcinom pankreatu ve stadiu III - IV (UICC) – lokálně inoperabilní či generalizovaný, u nichž byl proveden paliativní výkon (bypassová operace, odběr biologického materiálu pro následnou onkologickou léčbu) a zároveň byl získán materiál z laváže dutiny břišní. Diagnóza adenokarcinomu pankreatu byla ověřena histologicky a do studie byli zahrnuti pouze pacienti s pooperačním statusem R2 výkonu (Tab. 1).

Kontrolní skupina

Kontrolní skupinu tvořilo 24 elektivně operovaných pacientů pro cholecystolithiasu bez známek akutního zánětu a bez nádorového onemocnění či anamnézy nádorového onemocnění, u nichž byla provedena v úvodu výkonu laváž dutiny břišní (Tab. 1). Studie byla schválena Etickou komisí Fakultní nemocnice v Olomouci, pacienti podepsali informovaný souhlas.

Odběr peritoneální laváže

Vzorky peritoneální laváže byly získány u všech 87 nemocných s pokročilým adenokarcinomem pankreatu a u všech 24 kontrolních subjektů použitím 100 ml fyziologického roztoku (phosphate buffered saline, pH=7,2) ihned po otevření břišní dutiny či v úvodu laparoskopického výkonu. Peritoneální laváž byla získána aspirací do sterilní stříkačky a poté přenesena do transportních lahví obsahujících 1,5 ml 0,5M EDTA a 10 ml fetálního bovinního séra. Odebraný materiál byl následně ihned transportován do laboratoře.

RNA purifikace a reverzní transkripce

Celková RNA byla izolována ze sedimentu peritoneální laváže fenol-chloroformovou metodou za použití kitu TRI Reagent (Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA), postupovalo se dle návodu výrobce. Pro reverzní transkripci byl použit 1µg získané RNA, po inkubaci s náhodnými hexamery (Promega, Madison, WI, USA) byla provedena reverzní transkripce za použití RevertAid Moloney Murine Leukemia Virus reverzní transkriptázy (Fermentas, Vilnius, Lithuania).

Real-time PCR

Real-time PCR amplifikace 100ng cDNA získané reverzní transkripcí byla provedena na přístroji Rotor Gene 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia). Pro amplifikaci karcinoembryonálního antigenu (CEA, NM 004363), receptoru pro epidermální růstový faktor 1 (EGFR, NM_005228) a lidskou telomerázu (hTERT, NM_198253) byly navrženy specifické primery a taq-man sondy (Generi-Biotech, Hradec Králové, Česká republika) [3]. Samotná PCR reakce byla amplifikovaná polymerázou HotStart Taq Polymerase (AB Gene, Epsom, UK). Pro absolutní kvantifikaci byly připraveny plazmidové standardy pCR 2.1Topo (Invitrogen, Carlsbad, California, USA), které v ředění sloužily k sestavení kalibrační křivky. Změřené hodnoty genové exprese testovaných markerů byly normalizovány jak na množství RNA vstupující do reverzní transkripce, tak vzhledem k expresi housekeepingového genu glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázy (GAPDH).

Statistická analýza

Prahové, cut-off, hodnoty exprese CEA, EGFR a hTERT v peritoneální laváži byly stanoveny jako aritmetický průměr plus dvojnásobek směrodatné odchylky v souboru kontrolních zdravých subjektů. Exprese testovaných markerů u pacientů s adenokarcinomem pankreatu byly srovnány s hodnotami v kontrolním souboru prostřednictvím Wilcoxonova exaktního dvouvýběrového testu. Obě skupiny jsou porovnány rovněž graficky prostřednictvím krabicových grafů s vyznačenou prahovou hodnotou. Pro statistické výpočty a grafy byly použity softwary R (www.r-project.org) a STATISTICA (StatSoft, Inc., USA).

Výsledky

Průměrná exprese CEA, EGFR a hTERT v peritoneální laváži kontrolní skupiny byla 2501, 716749, resp. 104 kopií mRNA/µg RNA (Tab. 2). Hodnoty absolutní exprese byly dále normalizovány na expresi house-keepingového genu glycealdehdyd-3-fosfát dehydrogenázy (GAPDH). Cut-off hodnoty testovaných markerů po normalizaci byly 4,89, 115,88, resp. 0,02 kopií mRNA genu/kopií mRNA GAPDH.

Bylo provedeno porovnání exprese CEA, EGFR a hTERT mezi kontrolní skupinou a pacienty s pokročilým adenokarcinomem pankreatu (R2). V případě absolutní exprese testovaných markerů (Graf 1,2,3), pouze hTERT dokáže statisticky významně (p<0,001) odlišit obě analyzované skupiny, kdy pacienti s pokročilým adenokarcinomem pankreatu (R2) mají vyšší hodnotu exprese hTERT (Obr. 3). Absolutní exprese CEA ani EGFR nedokáže odlišit obě skupiny, hodnoty exprese obou markerů nevykazují statisticky signifikantní rozdíly mezi kontrolní skupinou a skupinou s pokročilým adenokarcinomem pankreatu.

Za využití přesnějších, normalizovaných hodnot exprese testovaných markerů Graf 4,5,6) byla prokázána statisticky významně vyšší exprese CEA a hTERT (p<0,005, resp. p<0,001) u pacientů s pokročilým adenokarcinomem pankreatu (R2) v porovnání s kontrolní skupinou (Graf 4 a 6).

Diskuze

Cílem studie bylo stanovit hodnoty exprese CEA, EGFR a hTERT jako potenciálních markerů okultních nádorových buněk u nemocných s pokročilým karcinomem pankreatu v abdominální laváži – kompartmentu břišní dutiny – a hodnoty exprese týchž markerů u kontrolní skupiny [2,3,4,5]. Ke stanovení bylo využito metod založených na principu RT – PCR.

Předpokladem studie byla hypotéza, že přítomnost markerů nádorových buněk v populaci zdravé a v populaci s pokročilým karcinomem pankreatu bude rozdílná. Záměrem je využitím zmíněné metodiky ověřit diskriminační schopnosti těchto markerů pro skupinu nemocných s pokročilým karcinomem.

Ačkoliv část naší skupiny prokázala nedávno statisticky významné rozdíly v expresi EGFR u nemocných s metastatickým postižením oproti nemocným s lokalizovaným onemocněním jak v portální krvi, tak v abdominální laváži, současná studie porovnáním těchto výsledků s kontrolní zdravou skupinou zjišťuje, že není statisticky významný rozdíl v expresi tohoto markeru mezi oběma nyní sledovanými skupinami [1,4]. Klos a spol. prokázali zvýšenou expresi EGFR u pokročilých stadií karcinomu pankreatu a statisticky významně vyšší u pokročilých stadií oproti méně pokročilým stadiím, i v korelaci s dobou přežití. Havlík a spol. prokázali, že EGFR a CEA pozitivita v peritoneální laváži koresponduje s klinickým stadiem a gradem tumoru ale i kratším přežitím u pokročilých stadií. Za překvapivý výsledek považujeme zjištění zejména u EGFR v naší studii. Ta ukazuje na srovnatelnou expresi jak absolutní tak normalizovanou v obou skupinách a tím velmi limituje využití exprese EGFR jako markeru okultních nádorových buněk v abdominální laváži. U markeru CEA jsme prokázali sice rozdílnou expresi v kontrolní skupině a u nemocných s pokročilým karcinomem pankreatu jak absolutní tak normalizovanou, nicméně statisticky významný rozdíl byl jen u normalizované. Toto je ve shodě s publikovanými závěry Brolla a spol., který rovněž referuje o vyšší pozitivitě CEA (63 %) v peritoneální laváži pacientů s karcinomem pankreatu, ale současně poukazuje na vysokou míru falešně pozitivních výsledků (38 %) u kontrolních vzorků peritoneální laváže u zdravých osob [7]. Výsledky naší studie potvrzují schopnosti diferenciace mezi zdravou skupinou a skupinou s pokročilým karcinomem pankreatu (stadia III a IV) jen u markeru hTERT, kdy byla prokázána statisticky významně vyšší absolutní exprese hTERT (p<0,001) i normalizovaná exprese hTERT (p<0,001) a u markeru CEA jen normalizovaná exprese CEA (p<0,005) v peritoneální laváži u pacientů s pokročilým adenokarcinomem pankreatu (R2) v porovnání s kontrolní skupinou. Aktuálně Campa a spol. potvrdil, že polymorfismus v genu TERT je spojený s rizikem karcinomu pankreatu na základě hloubkové analýzy genetické variability TERT u subjektů s karcinomem pankreatu a kontrolního souboru [11]. Expresi EGFR jak absolutní tak normalizovanou v naší studii nelze použít k odlišení obou studovaných skupin. Absolutní exprese CEA též nevykazovala statisticky signifikantní rozdíly u obou skupin. Konvenční cytologie, imunohistochemie i molekulárně-biologické metody zatím tedy poskytují rozporuplné výsledky v případě prognostického významu okultních nádorových buněk v peritoneální laváži u pacientů s adenokarcinomem pankreatu. Je zřejmé, že další pokrok v této oblasti úzce souvisí s potřebou standardizace metod a postupů, s validací výsledků v nezávislých ověřovacích studiích a s vývojem nových detekčních metod s optimální senzitivitou a specifitou umožňující přímou vizualizaci a následnou charakterizaci detekovaných nádorových buněk.

Lze tedy říci, že na základě prezentovaných výsledků pro detekci nádorových buněk u adenokarcinomu pankreatu v abdominální laváži využitím RT-PCR by mohl být použitelný marker hTERT, naopak průkaz exprese CEA a EGFR nesplňuje požadavky na odlišení kontrolní zdravé skupiny od skupiny s pokročilým adenokarcinomem pankreatu.

Závěr

Exprese hTERT v peritoneální laváži, jak absolutní tak normalizovaná, dosahuje statisticky signifikantního rozdílu a mohla by tak být kandidátním markerem pro identifikaci pacientů s pokročilým pankreatickým adenokarcinomem a s malým benefitem z radikálního chirurgického výkonu. Další studie se zaměřením na hTERT budou nutné k potvrzení tohoto závěru. V dané studii však byl zjištěn prakticky zanedbatelný rozdíl jak v absolutní, tak normalizované expresi EGFR v peritoneální laváži a též nebyl zjištěn statisticky významný rozdíl v absolutní expresi CEA u kontrolní skupiny a u nemocných s pokročilým adenokarcinomem pankreatu.

Zkratky

UICC        Union for International Cancer Control

EDTA       ethylenediaminetetraacetic acid

RT-PCR    reverse transcription polymerase chain reaction

RNA         ribonucleic acid

DNA         deoxyribonucleic acid

Práce byla podpořena granty: IGA_LF_2015_002, IGA_UP_2015_010, IGA LF 2014_030, CZ.1.07/2.3.00/30.0004, NPU LO1304 a TAČR TE0200005.

Konflikt zájmů

Autoři článku prohlašují, že nejsou v souvislosti se vznikem tohoto článku ve střetu zájmů a že tento článek nebyl publikován v žádném jiném časopise.

MUDr. Martin Loveček, Ph.D.

I. chirurgická klinika LF UP a FN Olomouc

I. P. Pavlova 6

775 20 Olomouc

e-mail: mlovecek@seznam.cz

---

Komentář k článku

„Stanovení exprese CEA, EGFR a hTERT jako markerů nádorových buněk v peritoneální laváži u pacientů s adenokarcinomem pankreatu metodou RT-PCR“ autorů Ghothim a kolektiv

Článek srovnání hladin exprese uvedených genů detekovaných v peritoneální laváži mezi skupinou 87 pacientů s pokročilým karcinomem pankreatu a kontrolní skupinou 24 pacientů operovanou pro žlučové kameny. Jako výsledek byl získán statisticky významný rozdíl exprese mezi oběma skupinami, a to při porovnání absolutní exprese u genu hTERT a při porovnání normalizovaných expresí u genů CEA a EGFR.

Jedná se čistě o metodickou práci, která sice nenaplňuje rysy nového postupu či nového využití metodologie, avšak která je po technické stránce precizně provedena. Otázkou je využitelnost získaných výsledků pro diagnostiku či terapii onemocnění, což, bohužel, bývá častým problémem u obdobně koncipovaných článků. Nadšení z prostého faktu odhalení statistické významnosti výskytu studovaných biomarkerů tak poněkud zastiňuje klinickou využitelnost (clinical utility). Je cílem práce zjistit prostou přítomnost okultních nádorových buněk v peritoneální laváži? Či je cílem zjistit, zda okultní nádorové buňky přítomné v laváži vykazují právě tyto a nikoli jiné markery? Jaká je potom prognostická hodnota hladin těchto genů v pankreatické tkáni, a v čem je tedy výhoda vyšetřování laváže? Jaký klinický smysl dává volba kontrolní skupiny tvořená pacienty s předpokladem normální zdravé tkáně v případě peritoneální laváže prováděné u pacientů operovaných pro suspektní pankreatické léze?

Je nepochybné, že v případě maligního onemocnění vykazuje velké množství genů významné rozdíly v expresi při srovnání s nenádorovou tkání, a proto fakt statistické významnosti nalezených rozdílů u pacientů a „zdravých“ kontrol není bez hlubšího klinického kontextu sledovaných biomarkerů nikterak překvapivý.

Výsledkem zcela legitimního a po metodické stránce špičkově provedeného výzkumného záměru je tak solidní technická zpráva demonstrující schopnost vyšetřování exprese několika vybraných genů v peritoneální laváži, nikoli zjištění zasazující danou metodiku do klinického kontextu. K obhajobě autorů je však třeba říci, že výše uvedené výhrady lze aplikovat i na řadu současných prací vycházejících v renomovaných časopisech s vysokým impakt faktorem, tedy se jistě nejedná o odchylku, nýbrž o poněkud nešťastný trend současné doby, pro kterou je okouzlení nově nastupujícími technikami tak typické.

RNDr. Marek Minárik Ph.D.

Genomac výzkumný ústav, s.r.o.

e-mail: mminarik@genomac.cz