Vyšetření mutace KRAS v EUS-FNA preparátech pacientů s tumorem pankreatu

Overview

Diferenciální diagnostika pankreatických solidních tumorů pomocí EUS-FNA je asi v 10–15 % případů náročná. Slibnou metodou, která v těchto případech pomáhá rozlišit chronickou pankreatitidu a karcinom, je vyšetření bodové mutace proto-onkogenu KRAS. Doposud však není zavedená do klinické praxe.

Cílem zkoumání bylo stanovení senzitivity testu KRAS s použitím různých typů vzorků pacientů s tumory pankreatu a testování vlivu přítomnosti mutace KRAS na prognózu přežití těchto pacientů. 147 pacientů podstoupilo EUS-FNA vyšetření pankreatického tumoru doplněné o odběr vzorku krve s následnou separací plazmy pro detekci cirkulující tumorové DNA. Část bioptického vzorku byla ponechána nativní ve stabilizačním roztoku a část byla zpracována do cytologického nátěru. Vzorky (nativní aspiráty, cytologické nátěry, plazma) byly vyšetřeny na přítomnost mutace genu KRAS metodou heteroduplexní analýzy pomocí denaturační kapilární elektroforézy.

V souboru 147 pacientů s ložiskovým procesem pankreatu byl diagnostikován 118x karcinom, 26x chronická pankreatitida, 3x neuroendokrinní tumor. Celkem bylo vyšetřeno 147 nativních aspirátů, 118 cytologických nátěrů a 94 vzorků plazmy. Ve skupině pacientů s karcinomem pankreatu bylo nejvyšší senzitivity vyšetření mutace KRAS dosaženo při použití cytologických preparátů, kdy byla mutace detekována v 90 % (106/118) vzorků. Při použití nativních buněčných aspirátů byla mutace detekována v 78 % (92/118) a vyšetření plazmy bylo pozitivní ve 27 % (24/90) případů. U čtyř pacientů s chronickou pankreatitidou byla detekována mutace KRAS, ačkoliv u žádného z nich nebyl karcinom potvrzen cytologicky. U dvou z těchto pacientů byl v dalším průběhu potvrzen karcinom, jeden pacient zemřel předčasně na komplikace alkoholového deliria a poslední byl indikován k radikálnímu chirurgickému zákroku.

Vyšetření mutace KRAS lze provádět u všech pacientů podstupujících EUS-FNA, přičemž nejvhodnějším typem vzorků pro toto vyšetření jsou cytologické preparáty. Vyšetření KRAS je vhodné aplikovat ve skupině pacientů s nejasnou diferenciální diagnostikou, zvláště pak u nemocných s chronickou pankreatitidou, kde metoda umožňuje identifikovat časný karcinom pankreatu v nepřehledném terénu zánětlivých změn.

Klíčová slova:
karcinom pankreatu, chronická pankreatitida, mutace KRAS , EUS-FNA

Úvod

Tumory pankreatu přestavují diagnostické dilema asi v 10-15% případů (1-4). Zejména rozlišení benigní a maligní etiologie je pro další léčbu pacientů zcela zásadní. Pacienti s časně diagnostikovaným karcinomem pankreatu mají největší šanci na vyléčení (tab 1.) (5, 6). Přibližně v 90% případů, je diagnóza stanovena v pozdním stádiu, a tedy s minimální šancí na přežití (7). Hlavním důvodem pozdní diagnózy je absence časných příznaků tohoto onemocnění (8).  

V časné fázi procesu karcinogeneze, ještě před morfologickými změnami pankreatického duktálního epitelu, bylo zjištěno několik genetických alterací včetně mutace protoonkogenu KRAS (9), která je nalézána až v 93% karcinomů pankreatu (10), zatímco v tkáni chronické pankretitidy přítomna nebývá (11). Stanovení mutace KRAS tedy může tedy v diagnostickém procesu pankreatických lézí pomoci odlišit chronickou pankreatitidu a karcinom. I přes značný pokrok v genetickém testování však nadále není vyšetření KRAS mutace zavedeno do běžné klinické praxe. Obzvlášť testování KRAS ze vzorků získaných endosonograficky tenkojehlovou aspirací (EUS-FNA) je výjimečné, což je dané pravděpodobně obavou z nedostatečné velikosti EUS-FNA vzorků pro genetické analýzy. Z tohoto důvodu jsme se rozhodli v rámci této studie otestovat využitelnost dvou typů bioptických vzorků, nativních aspirátů a cytologických preparátů, pro rutinní stanovení KRAS mutace. Nově se nabízí také možnost vyšetřování molekulárních markerů z cirkulující tumorové DNA (ctDNA) (8, 12), proto jsme možnost rutinního vyšetřování KRAS mutace testovali také ve vzorcích plazmy. Senzitivitu KRAS testu jsme stanovili ve všech třech typech použitých vzorků a zaměřili jsme se také na prověření často diskutované prognostické role KRAS mutace.

Materiál a metody 

Pacienti 

Do studie bylo zahrnuto celkem 147 pacientů s tumorem pankreatu, kteří podstoupili vyšetření EUS s FNA a následný odběr krve. V souboru bylo 118 pacientů s karcinomem pankreatu, 26 pacientů s chronickou pankreatitidou a 3 pacienti s neuroendokrinním tumorem. Skupinu pacientů s karcinomem tvořilo 64 mužů ve věku průměrně 69 ± 9 let (rozmezí 44–92 let) a 54 žen ve věku průměrně 66 ± 9 let (rozmezí 44–87 let) s PDAC ve stadiu II (n = 3), III (n = 53) a IV (n=58), u čtyř pacientů nebylo stadium onemocnění určeno. Studie byla provedena v souladu se zásadami uvedenými v Helsinské deklaraci a schválena Etickou komisí Ústřední vojenské nemocnice – Vojenské fakultní nemocnice v Praze. Všichni jedinci zařazení do studie podepsali informovaný souhlas s vyšetřením.

Metody

Endosonografické vyšetření prováděli dva endoskopisté. K vyšetření byl použit lineární elektronický echoendoskop GF-UCT 180 Olympus a ultrazvukový přístroj Aloka Prosound Alpha 10. K EUS-FNA byly použity jehly Pro-Core 19 G a 22 G (Cook Medical), Expect 19 G a 22 G (Boston Scientific) a standardní jehly Olympus 22 G. Při konvenčním EUS byla u každé léze popsána lokalizace, velikost, homogenita, echogenita a okraje. Jako karcinom bylo označeno ložisko hypoechogenní a nehomogenní a/nebo s nepravidelnými okraji (13). Pro diagnózu chronické pankreatitidy byla použita Rosemontská kritéria (14).

Část bioptického vzorku byla uchována nativní ve stabilizačním roztoku při -20 °C, část byla zpracována do cytologického nátěru. Suché cytologické nátěry byly doručeny na patologii, kde byly vzorky fixovány a barveny roztokem Giemsa Romanovski a cytolopatolog se specializací v pankreatobiliární diagnostice následně provedl jejich zhodnocení. Na cytologických preparátech byla cytopatologem vyznačena oblast s majoritním výskytem nádorových buněk (minimálně 80 %) a vzorky byly poté odeslány na genetickou analýzu.

Izolace DNA a detekce mutace KRAS

V případě aspirátů byl materiál ve stabilizačním roztoku rozmražen, centrifugován pro vytvoření pelety a peleta byla využita pro izolaci DNA. Z cytologických preparátů byl mikrodisekován materiál z vyznačené oblasti nádorových buněk a přenesen do mikrozkumavky. DNA pak byla z obou typů materiálu izolována kitem Recover All Total Nucleic Acid isolation (Ambion) podle pokynů výrobce, pouze 1. krok izolace (deparafinizace) byl vynechán. Ze vzorku krve byla nejprve dvojí centrifugací separována plazma a bezprostředně zmražena na -20 °C. Ve zmraženém stavu byla dopravena do genetické laboratoře, kde byla z plazmy izolována ctDNA kitem NucleoSpin Plasma XS (Macherey-Nagel, Dueren, Německo).

Detekce somatických mutací genu KRAS byla ve všech třech typech vzorků provedena metodou PCR s následnou heteroduplexní analýzou pomocí kapilární gelové elektroforézy při teplotním gradientu na přístroji ABI Prism 3100 (Applied Biosciences), stejně jako v předchozích studiích (15, 16). Výsledky heteroduplexní analýzy byly vizualizovány pomocí softwaru Gene Marker v2.4.2.

Test prognostické role mutace KRAS 

K této analýze byly využity pouze cytologické preparáty,ve kterých bylo dosaženo nejvyšší senzitivity. Pacienti byli rozděleni do skupiny s mutací KRAS  a bez této mutace. Byla stanovena korelace přítomnosti mutace KRAS  s prognózou (celkovým přežitím) pomocí Kaplanovy-Meierovy metody a křivky přežití obou skupin pacientů byly porovnány pomocí log-rank testu. Za statisticky významné byly považovány hodnoty p ˂ 0,05.

Výsledky

Endosonografie

Endosonografie je považována za metodu s nejvyšší senzitivitou pro stanovení diagnózy fokální pankreatické léze i pro staging pankreatického karcinomu (13). Všichni pacienti podstoupili EUS vyšetření. Byla vypočtena senzitivita, specificita, pozitivní prediktivní hodnota a negativní prediktivní hodnota pro EUS, které dosahovali 82,9%, 45,5%, 82,9% a 45,5%. 

Tenkojehlová aspirace (FNA)

Tenkojehlová aspirace je bezpečná metoda zavedená pro vyšetření všech pacientů s podezřením na karcinom při EUS vyšetření. V této studii dosahovala celková senzitivita FNA, bez přítomnosti patologa při EUS vyšetření, pro karcinom pankreatu 88 %, specificita 100 %, PPV 100 %, NPV 20 %. Jako nekonkluzivních bylo patologem označeno 13 % vzorků.

Genetická analýza

Celkem bylo na přítomnost mutace KRAS  testováno 147 nativních aspirátů všech pacientů podstupujících EUS-FNA, 118 cytologických preparátů a 94 vzorků plazmy pacientů s karcinomem pankreatu. Úspěšnost stanovení mutace KRAS  je shrnuta v tab. 2. U pacientů s NET a CHP byly k testu KRAS  použity pouze nativní buněčné aspiráty se záchytem 0/3 (0 %), respektive 4/26 (15 %).

Pro skupinu pacientů s karcinomem pankreatu byly k dispozici všechny 3 typy vzorků, přičemž nejvyšší senzitivity detekce (záchytu) mutace KRAS  bylo dosaženo při použití cytologických preparátů (90 %). V nativních aspirátech byla mutace detekována pouze v 78 % případů, výsledky vyšetření v těchto vzorcích tedy byly ve 12 % případů falešně negativní. Nejnižšího záchytu bylo dosaženo při detekci z plazmy, kde bývá DNA pocházející z nádoru (ctDNA) obecně přítomna ve velmi nízkých koncentracích. Výsledný záchyt mutace KRAS  v ctDNA činil pouze 27 % (obr.1).

U 4 z 28 pacientů s CHP byla detekována mutace KRAS. U žádného nebyl karcinom iniciálně cytologicky diagnostikován. V průběhu klinického sledování byl potvrzen karcinom pankreatu u 2 pacientů, 1 pacient předčasně zemřel pro komplikace alkoholového deliria, 1 pacient byl aktuálně indikován k resekčnímu výkonu, který odmítl. Srovnání přežití pacientů s mutovaným KRAS oproti nemutovanému (wt) nepřineslo statisticky významný rozdíl v prognóze (obr. 2).

Diskuse

V diagnostice se genetické testování mutace KRAS  a dalších testů včetně jejich kombinace uplatňuje již řadu let. Specificita samotného testu KRAS je natolik vysoká, že jeho pozitivita s vysokou přesností signalizuje malignitu (15, 17). Mutace KRAS  byla opakovaně detekována u 74 % karcinomů pankreatu (18), 77 % (17), 70 % (16), 77–84 % (19) a 92 % (20). V našem souboru bylo nejvyšší senzitivity EUS-FNA detekce mutace KRAS  dosaženo při použití cytologických preparátů (90 %); byla dokonce vyšší, než je doposud uvedeno ve většině recentních publikací. Kromě toho, že byly nádorové buňky na cytologických vzorcích před genetickou analýzou označeny cytopatologem, se na vysoké senzitivitě podílí jistě i metodika zpracování popsaná již v dřívějších pracích publikovaných naším pracovištěm (15, 16).

Samotný fakt, že v terénu chronické pankreatitidy byl v naší studii detekován KRAS bez náležité  cytopatologické verifikace, je velmi zajímavý. V doposud publikovaných pracích byl zaznamenán pouze jeden případ pozitivity mutace KRAS  v terénu chronického zánětu pankreatu. Bournet et al. (2014) doporučují zapojit do vyšetřovacího procesu nejasné pankreatické masy testování mutace KRAS. V případě klinické či radiologické prezentace pseudotumorózní formy chronické pankreatitidy (nebo nejistého závěru cytopatologa) může identifikace KRAS bez mutace vyloučit maligní transformaci (21). V praxi může indikace resekčního výkonu pouze na podkladě mutace KRAS činit jisté potíže, proto je doporučováno před definitivním rozhodnutím o chirurgické léčbě opakovat EUS s FNA (21).

Přehled studií vyšetření mutace KRAS u vzorků získaných pomocí EUS-FNA v rámci diferenciální diagnostiky karcinomu pankreatu a chronické pankreatitidy uvádí tab. 3.

Prognostický význam KRAS byl hodnocen v několika recentních studiích, avšak výsledky jsou značně rozporuplné. Mutace KRAS je prokazatelně asociovaná s horším přežíváním ve srovnání s nemutovaným KRAS (wtKRAS), nicméně se jedná o statisticky hraničně významné asociace. Práce, které hodnotily prognostický význam mutace KRAS z EUS-FNA, neidentifikovaly studované molekulární markery jako prognostické ukazatele. Naproti tomu jsou známé závěry studií genetické analýzy resekátů karcinomu pankreatu, které naznačují, že obzvlášť některé typy mutací KRAS, např. G12D, jsou asociovány s horším přežíváním (22). Pravděpodobně proto jsou v současnosti většinou geneticky vyšetřovány zejména tkáně tumoru z resekátů, přestože jsou k dispozici jen u omezeného množství pacientů. V našem zkoumání korelací přežití pacientů s mutovaným KRAS a wtKRAS nebyl zjištěn významný rozdíl v prognóze. Do hodnocení ovšem nebyly zahrnuty výsledky mutací jednotlivých typů KRAS, které vyžadují podrobnější analýzu.

Závěr

Vyšetřování mutace KRAS z EUS-FNA preparátů je dostatečně senzitivní. Specificita testu KRAS je natolik vysoká, že jeho pozitivita s vysokou přesností signalizuje malignitu, naproti tomu negativní výsledek svědčí spíše pro benigní etiologii. Přínos je zaznamenán především u pacientů s chronickou pankreatitidou, kde nebyla na základě ostatních klinických faktorů indikována resekce. V případě průkazu přítomnosti KRAS by měla být resekce znovu zvážena vzhledem k vysokému riziku skrytého karcinomu pankreatu.

Pro využití KRAS jakožto prediktivního markeru nejsou dostatečné klinické důkazy.

Dedikace

Tato práce byla podpořena granty Ministerstva zdravotnictví ČR, projekty NT 13638 a NT 14 254-3, a Grantové agentury Ministerstva obrany ČR – projekt MO 1012.

Adresa pro korespondenci

MUDr. Bohuš Bunganič

Interní klinika 1. lékařské fakulty UK a Ústřední vojenské nemocnice − Vojenské fakultní nemocnice

U Vojenské nemocnice 1200

160 00  Praha 6

e-mail: bohus.bunganic@uvn.cz