Vliv nízkokalorické diety na sérové koncentrace a expresi cytoadhezivních molekul v tukové tkáni u obézních žen

Overview

Východisko.
Cytoadhezivní molekuly (CAM), proteiny exprimované na povrchu endotelových buněk, se účastní iniciálních fází rozvoje endoteliální dysfunkce. Vyšší hladiny solubilních CAM byly zjištěny u pacientů s aterosklerózou, obezitou a diabetes mellitus 2. typu. Cílem práce bylo stanovit cirkulující koncentrace a mRNA expresi ICAM-1 (intercellular adhesion molecule 1), VCAM-1 (vascular adhesion molecule 1) a E-selektinu v subkutánní tukové tkáni obézních žen a vyhodnotit vliv třítýdenní nízkokalorické diety na tyto parametry.

Metody a výsledky.
Do studie bylo zařazeno 20 obézních žen (BMI 46,2 ± 9,7 kg/m²) a 13 štíhlých zdravých žen (BMI 23,8 ± 2,3 kg/m²). Genová exprese CAM ve vzorcích subkutánní tukové tkáně získaných jehlovou biopsií byla stanovena metodou RT-PCR, sérové koncentrace CAM multiplexovou imunoanalýzou. Sérové hladiny E-selektinu byly bazálně vyšší u obézních žen oproti kontrolní skupině (24,4 ± 2,3 vs. 15 ± 1,5 ng/ml, p < 0,05). Po třítýdenním podávání nízkokalorické diety došlo u obézních žen k významnému poklesu BMI a koncentrace E-selektinu. Exprese mRNA pro E-selektin, ICAM-1 a VCAM-1 v subkutánní tukové tkáni byla bazálně nižší u obézních žen proti kontrolní skupině (p < 0,05). Po dietě došlo u obézních ke zvýšení exprese ICAM-1 a VCAM-1 (p < 0,05).

Závěry.
Výsledky nasvědčují tomu, že subkutánní tuková tkáň pravděpodobně není u obézních jedinců významným zdrojem cirkulujících koncentrací vybraných cytoadhezivních molekul a jejich lokální exprese v subkutánní tukové tkáni je regulována odlišně od sérových koncentrací.

Klíčová slova:
obezita, cytoadhezivní molekuly, ICAM-1, VCAM-1, E-selektin, mRNA exprese.

Cytoadhezivní molekuly (CAM) jsou proteiny exprimované na povrchu endotelových buněk cévní stěny s významnou úlohou v iniciálních fázích rozvoje endoteliální dysfunkce a aterosklerózy. V počátečních stádiích zánětlivého procesu adherují monocyty na endotel, infiltrují cévní stěnu a aktivují buňky endotelu (1). Adheze je umožněna interakcí monocytů se selektíny a cytoadhezivními molekulami na povrchu aktivovaných endotelových buněk (2, 3). Endotel reaguje na zánětlivé podněty zvýšenou produkcí cytoadhezivních molekul, např. ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1), VCAM-1 (vascular adhesion molecule-1) a E-selektinu, které umožňují další migraci monocytů do intimy cévní stěny (4). V experimentálních studiích byla popsána souvislost mezi hladinami CAM a adhezí monocytů in vitro u zdravých osob a pacientů s hypertriglyceridémií (5). V jiné studii korelovala schopnost vazby monocytů v kultuře endotelových buněk s hladinami solubilního E selektinu a VCAM-1 (6). Působením M-CSF (macrophage colony-stimulating factor), který je produkován monocyty, makrofágy, endotelem a fibroblasty, dochází v cévní stěně k diferenciaci monocytů v makrofágy (7). Řada dalších působků se podílí na zánětlivých změnách a endotelové dysfunkci (růstové faktory, prozánětlivé cytokiny a další) (2).

Prevalence nadváhy a obezity již před několika lety dosáhly ve vyspělých zemích úrovně epidemie a zařadily se mezi nejvýznamnější příčiny morbidity a mortality (8, 9). Ve velkých epidemiologických studiích se ukázalo, že obezita představuje významný rizikový faktor kardiovaskulárních onemocnění (10). U obézních jedinců a zejména obézních s viscerální akumulací tuku byla popsána řada metabolických poruch jako hypertriglyceridémie, snížená hladina HDL-cholesterolu, hyperinzulinémie, inzulinová rezistence a přítomnost známek systémového zánětu (11, 12). Další studie postupně rozšiřují toto spektrum o zvýšené markery oxidace lipoproteinů a aktivace endotelu resp. endoteliální dysfunkce (13, 14). U diabetiků 2. typu s nadváhou a obezitou byla zjištěna pozitivní korelace BMI, obvodu pasu a inzulinové rezistence (vyjádřené HOMA IR) se známkami zánětu a aktivace endotelu (zvýšení hladin CRP, IL-6, ICAM-1, E selektinu). U stejné skupiny pacientů také významně korelovala hladina glykovaného hemoglobinu s CRP, ICAM-1 a E-selektinem (15).

V průběhu aktivace endotelu jsou solubilní formy cytoadhezivních molekul uvolňovány do cirkulace. Řada klinických studií popsala vyšší hladiny solubilních CAM v séru u pacientů s aterosklerózou, anginou pectoris, diabetes mellitus 2. typu nebo obezitou (3, 16, 17). V experimentálních studiích bylo množství proteinu VCAM-1 a exprese její mRNA zvýšena po podání TNF-α (tumor necrosis factor α), jak popsal Swerlick et al. u lidských endoteliálních buněk, pocházejících z mikrocirkulace v kůži a podobně i u endoteliálních buněk z lidské pupeční žíly. Podobné stimulační účinky byly popsány i pro IL-1, vedoucí k přechodnému nebo trvalému zvýšení exprese proteinu a mRNA VCAM-1 nebo ICAM-1 na povrchu endotelu, a to v závislosti na čase a podané dávce. Tato pozorování svědčí pro rozdílnou regulaci cytoadhezivních molekul a odlišnost mezi jednotlivými typy endotelu (18).

Tuková tkáň je významným endokrinním orgánem, který kromě hormonů produkuje i řadu dalších látek včetně cytoadhezivních molekul. Dosud nebyly publikovány práce zaměřené na vyšetření exprese těchto molekul v lidské tukové tkáni a jejich ovlivnění dietní intervencí. Je přitom možné, že tuková tkáň může zejména u pacientů s obezitou produkovat zvýšená kvanta cytoadhezivních molekul a přímo se tak podílet na vzniku a rozvoji endoteliální dysfunkce spojené s obezitou.

Cílem práce bylo stanovit cirkulující koncentrace a mRNA expresi ICAM-1, VCAM-1 a E-selektinu v subkutánní tukové tkáni obézních žen a štíhlých žen a vyhodnotit vliv třítýdenní nízkokalorické diety na tyto parametry.

Soubor nemocných a použité metody

Do studie bylo zařazeno 20 obézních žen (BMI 46,2 ± 9,7 kg/m²), s obezitou 2. a 3. stupně dle BMI, a 13 štíhlých zdravých žen (BMI 23,8 ± 2,3 kg/m²). Ze studie byly vyloučeny pacientky s některou z následujících komorbidit: závažné kardiovaskulární onemocnění, renální nebo jaterní selhání, akutní infekční onemocnění nebo nádorové onemocnění. Váha obézních pacientek i zdravých subjektů byla stabilní v posledních 3 měsících před zařazením do studie a ženy neužívaly léky ovlivňující váhu. Všechny osoby zařazené do studie podepsaly informovaný souhlas. Studie byla provedena se souhlasem Etické komise Všeobecné fakultní nemocnice v Praze.

Pacientky byly vyšetřeny ráno po dvanáctihodinovém lačnění, bylo provedeno antropometrické měření a odběr krve na stanovení základních biochemických parametrů, dále odběry na stanovení hladin solubilních cytoadhezivních molekul v séru. U všech pacientek byla provedena jehlová biopsie subkutánního tuku z oblasti břicha po lokální anestezii 1% Mesocainem. Vzorky pro stanovení expresí byly uloženy ve stabilizačním roztoku (RNA later, Qiagen GmbH, SRN, kat .č. 76106) a následně zmraženy a uchovány v  70 °C do dalšího zpracování. U obézních pacientek bylo vyšetření provedeno před zahájením redukční diety a po 3 týdnech před propuštěním z nemocnice, u kontrolní skupiny pouze jednou. Obézní pacientky dodržovaly za hospitalizace redukční dietu s velmi nízkým obsahem kalorií (VLCD – very low-calorie diet), tj. 600 kcal denně, a byly pod stálým lékařským dohledem.

Sérové koncentrace solubilních cytoadhezivních molekul VCAM-1 (sVCAM-1), ICAM-1 (sICAM-1) a E-selektinu (sE selektin) byly stanoveny multiplexovou imunoanalýzou soupravou firmy LINCO Research, USA (kat.č. HCVD1-67AK). Celková RNA byla izolována ze subkutánní tukové tkáně kitem MagNA Pure Compact RNA Isolation Kit (Tissue) (Roche, SRN). Genová exprese ICAM-1, VCAM-1 a E-selektinu byla stanovena metodou real-time PCR na přístroji ABI PRISM 7500 instrument (Applied Biosystems, USA) se specifickou hydrolyzační sondou TaqMan^® Gene Expression Assays. Data byla normalizována k beta-2-mikroglobulinu. Ke statistické analýze dat byl použit statistický program SigmaStat (Jandel Scientific, USA). Výsledky jsou vyjádřené jako střední hodnota ± SEM (standard error means), pokud není uvedeno jinak. Data žen kontrolní skupiny a obézních pacientek před a po redukci hmotnosti byly srovnávány párovým a nepárovým ttestem, resp. Mann-Whitney Rank Sum Testem.

Výsledky

Charakteristika pacientek

Obézní pacientky měly vstupně vyšší hmotnost a BMI ve srovnání s kontrolní skupinou (p < 0,05). Po třítýdenním podávání nízkokalorické diety došlo k významné redukci hmotnosti a poklesu BMI u obézních pacientek (p < 0,05). Obézní pacientky byly v průměru o 6 let mladší než ženy v kontrolní skupině, tento rozdíl však nebyl statisticky signifikantní. Další viz tabulka 1.

Koncentrace solubilních cytoadhezivních molekul v séru

Koncentrace solubilního E-selektinu byla na začátku sledování významně vyšší u obézních pacientek proti zdravým kontrolám (p < 0,05). Hladiny solubilních ICAM-1 a VCAM-1 v séru se mezi skupinami významně nelišily.

Po třítýdenním podávání nízkokalorické diety obézním pacientkám došlo kromě snížení BMI k signifikantnímu poklesu cirkulujících koncentrací E-selektinu (p < 0,05). Dieta neměla významný vliv na koncentrace sICAM-1 ani sVCAM-1. Cirkulující hladiny cytoadhezivních molekul ve skupině obézních pacientek po redukci váhy nebyly významně odlišné od hodnot u štíhlých kontrolních žen (graf 1).

Exprese mRNA cytoadhezivních molekul v tukové tkáni

Exprese mRNA pro E-selektin v subkutánní tukové tkáni byla vstupně signifikantně nižší u obézních pacientek ve srovnání s kontrolní skupinou (p < 0,05). mRNA exprese E selektinu v subkutánní tukové tkáni byla řádově 10× nižší než exprese ICAM-1 a VCAM-1. Exprese mRNA pro ICAM-1 a VCAM-1 v subkutánním tuku byly u obézních pacientek při vstupním měření významně nižší než u kontrolní skupiny (p < 0,05).

Po třítýdenní nízkokalorické dietě a redukci hmotnosti u obézních žen bylo zaznamenáno významné zvýšení exprese mRNA pro ICAM-1 a VCAM-1 (p < 0,05) v subkutánní tukové tkáni. Nízkokalorická dieta neovlivnila expresi mRNA pro E-selektin v subkutánním tuku (graf 2).

Diskuze

Zvýšená exprese CAM hraje spolu s dalšími ději důležitou úlohu při vzniku endoteliální dysfunkce a později aterosklerózy. Exprese cytoadhezivních molekul na endotelu cévní stěny podporuje adhezi leukocytů a posléze jejich migraci do vnitřních vrstev cévní stěny a progresi dalších změn v rozvoji aterosklerózy. Stanovení CAM by mohlo pomoci identifikovat rizikové osoby v populaci dosud bez klinického onemocnění (19). Kromě endotelu mohou být cytoadhezivní molekuly exprimovány na dalších buňkách, např. cirkulujících leukocytech a buňkách cévní stěny, jako jsou monocyty/makrofágy nebo myoblasty (20). Původ a patofyziologická funkce solubilních forem cytoadhezivních molekul je stále předmětem diskuzí. Dle in vitro studií se předpokládá, že solubilní CAM jsou uvolňovány do cirkulace proteolýzou membránově vázaných forem CAM, a jsou tak obrazem jejich genové exprese v buňkách endotelu (21). Existuje však i předpoklad, že solubilní formy vznikají nezávisle na membránových cytoadhezivních molekulách, jak na myším modelu zjistil Komatsu et al. (22). Opakovaně byla potvrzena jejich souvislost s aterosklerotickými změnami a predikcí kardiovaskulárního rizika (23, 24). Zvýšené hladiny cytoadhezivních molekul byly zjištěny u různých sledovaných skupin se zvýšeným rizikem aterosklerózy, například u osob s arteriální hypertenzí (25), dyslipidémií (26), u diabetiků 2. typu (27).

V posledních letech probíhají intenzivní výzkumy zaměřené na souvislost endoteliální dysfunkce a subklinického zánětu při iniciaci procesu aterosklerózy a rozvoji kardiovaskulárních chorob. Markerem zánětu je například cirkulující C-reaktivní protein (měřený supersenzitivní metodou jako hsCRP – high sensitive CRP), který byl identifikován jako silný nezávislý rizikový faktor kardiovaskulárních onemocnění (28). Asociace mezi abdominální obezitou a hladinami CRP, která byla zjištěna v některých studiích, svědčí pro úzký vztah mezi obezitou a low-grade systémovým zánětem (14). Nebylo jednoznačně prokázáno, jestli podkladem vztahu mezi abdominální obezitou a regulací zánětu je zvýšená produkce prozánětlivých cytokinů tukovou tkání, ale řada studií pro tuto možnost svědčí. Je nicméně nutné brát v úvahu i jiné mechanizmy, např. možný vliv snížené inzulinové senzitivity u obezity vedoucí ke zvýšené produkci reaktantů akutní fáze v játrech (15).

Obézní jedinci mají proti štíhlým jedincům vyšší sérové hladiny E-selektinu, ICAM-1 a VCAM-1 (29). V naší studii jsme u obézních jedinců zaznamenali vyšší hladiny jen pro E selektin. Při srovnání obézních diabetiků 2. typu a obézních osob se stejným BMI a obvodem pasu, ale bez diabetu nebo pouze s poruchou glukózové tolerance byly v jiné studii (30) zjištěny vyšší hladiny sICAM-1 a sE-selektinu u diabetiků. U obézních osob po gastrické bandáži byl po roce sledování zaznamenán významný pokles váhy provázený poklesem cirkulujících hladin sICAM-1 a sE-selektinu, které se již tak nelišily od hodnot u štíhlých osob i přesto, že BMI a obvod pasu byly i po redukci signifikantně vyšší než u kontrolní skupiny (30). Krátkodobé ani dlouhodobé zlepšení kompenzace diabetu u obézních diabetiků 2. typu nevedlo ke změnám hladin CAM. Některé studie naznačují, že obezita má výraznější vliv na cirkulující hladiny CAM než diabetes mellitus, resp. jeho kompenzace (31). Jiné studie přinášejí opačné závěry – při vyšetření skupiny nově diagnostikovaných diabetiků 2. typu s kombinací chronické hyperglykémie a hyperinzulinémie a srovnání se skupinou nediabetiků s inzulínovou rezistencí a hyperinzulinémií byla zjištěna závislost hladin solubilních CAM na parametrech kompenzace diabetu (glykémie nalačno, glykovaný hemoglobin) (27).

Redukce hmotnosti je provázena snížením cirkulujících koncentrací solubilních cytoadhezivních molekul u obézních žen normotoniček bez diabetes mellitus (32) resp. i u obézních mužů s hypertenzí (29). V souladu s tím jsme i v naší studii zaznamenali pokles koncentrací E–selektinu v séru obézních žen. Změny pouze jednoho ze sledovaných parametrů v naší studii mohou souviset s relativně krátkou dobou intervence, 3 týdny vs. 12 týdnů u výše uvedených studií. Do regulace hladin CAM zasahuje řada vlivů a regulačních systémů, např. oxidační stres, dostupnost NO, renin-angiotenzinový systém nebo inzulínová senzitivita. Nelze vyloučit, že změna dietních návyků. resp. změna životosprávy přímo ovlivní některý z těchto faktorů a změna hladin cytoadhezivních molekul je výsledkem kombinace těchto vlivů (32). Dalším z faktorů ovlivňujících hladiny CAM je TNF-α, produkovaný mimo jiné adipocyty, který je schopen přímo stimulovat uvolňování E-selektinu a ICAM-1 z endotelu (33). Vzhledem k tomu, že po významné redukci váhy klesá i hladina TNF-α (34), může se tento mechanizmus také podílet na snížení hladin cytoadhezivních molekul v séru (30).

Ve studii jsme vycházeli z hypotézy, že tuková tkáň může být přímým a významným producentem cytoadhezivních molekul u pacientek s obezitou. Potvrdili jsme, že všechny studované cytoadhezivní molekuly byly v tukové tkáni jak obézních, tak štíhlých žen exprimovány. Zároveň však studie překvapivě prokázala nižší expresi E-selektinu, ICAM-1 a VCAM-1 v podkožní tukové tkáni obézních pacientek ve srovnání se štíhlými ženami a dále vzestup exprese ICAM-1 a VCAM-1 v podkožní tukové tkáni po redukci hmotnosti. Výsledky tedy ukazují, že podkožní tuková tkáň pravděpodobně není zásadním zdrojem cirkulujících CAM u pacientek s obezitou a že lokální regulace genové exprese CAM v této tkáni je rozdílná od jejich systémových koncentrací. Vzhledem k tomu, že v této studii byla studována exprese pouze v podkožní tukové tkáni, je možné, že regulace v metabolicky více škodlivé tukové tkáni viscerální může být rozdílná. Navíc je nutné brát v úvahu možnost, že regulace genové exprese CAM nemusí nutně odrážet expresi proteinovou a vlastní produkci těchto faktorů v tukové tkáni.

Závěr

Tuková tkáň je multifunkční orgán, který kromě dobře známých adipokinů exprimuje také cytoadhezivní molekuly. Hladiny cytoadhezivních molekul v séru jsou ovlivněny nejen poruchou glukózové tolerance, ale i tělesnou hmotností a jejich zvýšená produkce může přímo přispívat k rozvoji endoteliální dysfunkce a aterosklerózy u obézních jedinců. Naše výsledky nasvědčují tomu, že subkutánní tuková tkáň pravděpodobně není u obézních jedinců významným zdrojem cirkulujících koncentrací studovaných cytoadhezivních molekul a že lokální exprese těchto molekul v subkutánní tukové tkáni může být regulována rozdílně od jejich sérových koncentrací. Po významném snížení hmotnosti u žen s obezitou 2. a 3. stupně však dochází k poklesu sérových koncentrací E-selektinu, jedné ze sledovaných cytoadhezivních molekul, což může být obecně známkou snížení kardiovaskulárního rizika. Otevřenou otázkou zůstává úloha viscerální tukové tkáně při produkci cytoadhezivních molekul u pacientů s obezitou.

Zkratky

BMI – index tělesné hmotnosti (body mass index)

CAM – cytoadhezivní molekuly

CRP – C-reaktivní protein

HOMA IR – index inzulinové rezistence (homeostasis model assessment of insulin resistance)

ICAM-1 – intercelulární adhezivní molekula 1 (intercellular adhesion molecule 1)

IL-1, IL-6 – interleukin 1, interleukin 6

M-CSF – faktor stimulující tvorbu kolonií makrofágů (macrophage colony-stimulating factor)

NO – oxid dusnatý

RT-PCR – polymerázová řetězová reakce v reálném čase (real–time polymerase chain reaction)

SEM – střední chyba průměru (standard error of mean)

TNF-α – tumor nekrotizující faktor α

VCAM-1 – vaskulární adhezivní molekula 1 (vascular adhesion molecule 1)

VLCD – dieta s velmi nízkým obsahem kalorií (very low-calorie diet)

Práce byla podporována grantem IGA MZČR 8302–5 a IGA MZČR NR/9438–3.