Cílené tlumení exprese genu PCNA pomocí siRNA v leukemických buněčných liniích
Authors:
M. Merkerová; H. Bruchová; R. Brdička
Authors‘ workplace:
Ústav hematologie a krevní transfuze, Praha
Published in:
Čas. Lék. čes. 2005; 144: 472-475
Category:
Original Article
Overview
Východisko.
U pacientů s chronickou myeloidní leukémií jsme detekovali zvýšenou hladinu exprese genu PCNA, který by se potenciálně mohl podílet na rozvoji onemocnění. Cílem této práce bylo nalézt vhodné podmínky pro transfekci molekul PCNA-siRNA do buněčných linií K562 a MOLM-7 s up-regulovaným PCNA a zvýšenou expresi tlumit.
Metody a výsledky.
Klíčovými parametry úspěšného vnášení siRNA do buněk jsou typ a množství transfekčního činidla, koncentrace buněk a vnášené siRNA nebo doba inkubace transfekovaných buněk před analýzou exprese. Byla testována tato činidla: ExGene 500 (Fermentas), Metafectene (Biontex), Oligofectamine (Qiagen) a siPORT Amine (Ambion). Účinnost transfekce siRNA značených fluoresceinem byla sledována pomocí fluorescenční mikroskopie. Míra potlačení genové exprese na úrovni mRNA byla stanovována pomocí RT-PCR v reálném čase a na proteinové úrovni metodou western blotů. Jako nejvhodnější byl pro další pokusy vybrán Oligofectamine, pomocí kterého bylo dosaženo 70% poklesu hladiny mRNA genu PCNA. Dále byla zvolena 50 nM koncentrace siRNA, 1x10⁶ buněk/ml a množství Oligofectaminu 4 μl/1ml transfekovaných buněk. Nejvhodnější doba kultivace buněk po transfekci byla 48 hodin.
Závěry.
Na základě výsledků této práce byl navržen protokol pro vnášení siRNA do buněčných linií K562 a MOLM-7. Tuto techniku lze přenést i na další geny potenciálně přispívající k CML a sledovat dopad siRNA-inhibice genů na expresní profil takto ovlivněných buněk. siRNA proti některým z over-exprimovaných genů by navíc mohly být v budoucnu využity pro genovou terapii CML.
Klíčová slova:
siRNA, chronická myeloidní leukémie, PCNA, genová exprese.
Labels
Addictology Allergology and clinical immunology Angiology Audiology Clinical biochemistry Dermatology & STDs Paediatric gastroenterology Paediatric surgery Paediatric cardiology Paediatric neurology Paediatric ENT Paediatric psychiatry Paediatric rheumatology Diabetology Pharmacy Vascular surgery Pain management Dental HygienistArticle was published in
Journal of Czech Physicians
Most read in this issue
- Diagnostické aspekty familiární juvenilní hyperurikemické nefropatie
- Náčrt súčasného pohľadu na problematiku ľahkých poranení mozgu so zameraním na dospelú populáciu
- Chirurgická léčba fibrilace síní
- Transplantace tenkého střeva