Úskalia stanovenia vitamínu D

Overview

Cieľ:
Cieľom štúdie bolo porovnať 3 rutinné imunochemické metódy stanovenia celkového 25-hydroxy-vitamínu D [25-(OH) D] s vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou s UV detekciou.

Materiál a metódy:
Sérové hladiny 25-(OH) D boli stanovované u 109 pacientov rôznymi imunochemickými metódami (ABBOTT, ROCHE, SIEMENS) a metódou HPLC, ktorá bola v predkladanej práci považovaná za referenčnú. V prvom kroku boli vybrané imunochemické metódy porovnané s ohľadom na metódu HPLC. V druhom kroku boli tieto metódy porovnané navzájom medzi sebou. Na porovnanie metód bola použitá regresná analýza (Passing-Bablok) a Bland-Altmanova analýza diferencií. Za maximálne akceptovateľné diferencie v jednotlivých výsledkoch boli považované hodnoty v rozmedzí ± 21,5 %. Toto kritérium bolo zvolené na základe CDC Vitamin D Standardization-Certification Program (VDSCP). V poslednom kroku bola vyhodnotená miera zhody v interpretácii nameraných výsledkov 25-(OH) D.

Výsledky:
Žiadna zo skúmaných imunochemických metód stanovenia 25-(OH) D nebola porovnateľná s metódou HPLC a takisto neboli porovnateľné navzájom medzi sebou. Bland-Atlmanova analýza odhalila, v porovnaní s HPLC, že metóda ROCHE vykazuje bias +28,0 %, metóda ABBOTT +0,2 % a metóda Siemens -23,4 %. Priemerný bias u metódy ABBOTT je síce nevýznamný, avšak jednotlivé výsledky vykazovali bias v rozmedzí -89,4 % až 89,0 %. V porovnaní s metódou HPLC bola miera zhody v klinickej interpretácii výsledkov u metódy ABBOTT 65,21 %, ROCHE 59,63 % a SIEMENS 47,79 %.

Záver:
Výsledky predkladanej práce poukazujú na slabú úroveň štandardizácie metód stanovenia 25-(OH) D, ako aj na možnosť zvážiť používanie na metóde závislých rozhodovacích limitov.

Kľúčové slová:
25-hydroxy-vitamín D – interpretácia – porovnanie metód – štandardizácia

Úvod

Celosvetový nárast hypovitaminózy D má za následok prudký vzostup záujmu o jeho laboratórne stanovenie [1,2]. Deficit vitamínu D je spájaný s incidenciou mnohých ochorení. Známy je vzájomný vzťah hypovitaminózy D so vznikom osteoporózy a osteomalácie [3–5]. V súčasnosti sa pozornosť sústreďuje na koincidenciu hypovitaminózy D s ochoreniami ako diabetes mellitus [6], kardiovaskulárne ochorenia [7], imunologické a onkologické ochorenia [8,9]. Receptory pre vitamín D boli zistené na niekoľkých tkanivách vrátane čreva, žalúdka, pečene, tukového tkaniva, srdcového a kostrového svalstva, obličiek, imunitného systému, centrálneho nervového systému, štítnej žľazy, prištítnych teliesok, nadobličiek a B buniek pankreasu. Vitamín D sa stáva potenciálnym kľúčovým hráčom v rozvoji týchto ochorení. Pod označením vitamín D sa skrýva niekoľko v tukoch rozpustných kalciferolov, pričom 2 hlavné formy – cholekalciferol (vitamín D₃) a ergokalciferol (vitamín D₂) sú vlastne prohormóny, z ktorých v pečeni vzniká hydroxyláciou 25-hydroxycholekalciferol (kalcidiol), resp. 25-hydroxyergokalciferol, a následne v obličkách definitívna biologicky aktívna forma 1,25-dihydroxycholekalciferol (kalcitriol), resp. 1,25-dihydroxyergkokalciferol [11].

Ukázalo sa, že meranie 25-hydroxy-vitamínu D [25-(OH) D] je optimálny ukazovateľ stavu saturácie vitamínu D v organizme [12,13]. Na stanovenie 25-(OH) D sa v súčasnosti využívajú najmä 2 typy metód: imunochemické (rádioimunoanalýza, chemiluminiscenčná imunoanalýza, elektro-chemiluminiscenčná imunoanalýza, enzýmová imunoanalýza) a separačné (vysokoúčinná kvapalinová chromatografia, kvapalinová chromatografia – tandemová hmotnostná spektrometria) [14,15]. Široké spektrum dodávateľov ponúka automatizované imunochemické stanovenie, ktoré jednoznačne urýchlilo stanovenie 25-(OH) D [16,17]. Rozdiely medzi imunochemickými stanoveniami môžu byť markantné, čo môže viesť k sťaženej interpretácii výsledkov [18–20]. Naša práca informuje o výsledkoch porovnania troch automatizovaných imunochemických metód stanovenia 25-(OH) D s metódou HPLC.

Súbor pacientov a metodika

Vzorky

Pre účel tejto štúdie bolo vybratých celkovo 109 probandov s vekom 17–86 rokov (priemer 56,89). Z toho bolo 13 mužov s vekom 31–77 rokov (priemer 56,3) a 96 žien s vekom 17–86 rokov (priemer 56,9). Žiadne bližšie kritériá okrem rutinne stanovenej hladiny 25-(OH) D neboli pri výbere aplikované. Na analýzu boli použité pacientske vzorky venóznej krvi, ktoré boli odobraté za štandardných podmienok a u ktorých bolo indikované vyšetrenie 25-(OH) D lekármi Národného endokrinologického a diabetologického ústavu v Ľubochni. Vzorky boli po doručení do laboratória štandardne odstredené a po vykonaní analýz indikovaných lekármi boli zvyšné séra odpipetované do alikvotačných skúmaviek (pre každú metódu osobitne), označené a uskladnené pri -30 °C v laboratóriu klinickej biochémie a hematológie v Ľubochni (Alphamedical, s.r.o.). Po nazbieraní dostatočného počtu vzoriek boli, v zamrazenom stave, transportované do cieľových pracovísk: oddelenie klinickej biochémie firmy Klinická biochémia, s.r.o. v Žiline, laboratórium špeciálnych metód v Bratislave firmy Alphamedical, s.r.o. Každá analýza bola vykonaná z čerstvo rozmrazenej alikvotnej časti.

Metódy stanovenia 25-(OH) D

Na stanovenie celkového 25-(OH) D vo vzorkách boli použité komerčné chemiluminiscenčné imunochemické metódy od firmy Diagnostic/Architect, Siemens/Centaur a Roche Diagnostic/Cobas. Zo separačných metód bola použitá HPLC s UV detekciou od firmy Immundiagnostik AG (Bensheim, Germany) – set na stanovenie 25-(OH) D3/D2 RP – HPLC Kit (Article Nr. KC3000). Metóda HPLC-UV bola považovaná v našej práci za referenčnú. Meranie bolo vykonané na niekoľkých pracoviskách. Pracovisko Alphamedical, s.r.o. v Ľubochni analyzovalo vzorky na analyzátoroch Centaur XP (Siemens) a Cobas e411 (Roche). Na oddelení klinickej biochémie v Žiline firmy Klinická biochémia, s.r.o. boli vzorky vyšetrené na analyzátore Architect i2000 (Abbott) a laboratórium špeciálnych metód v Bratislave firmy Alphamedical, s.r.o. zabezpečilo analýzu separačnou metódou HPLC.

AdviaCentaur celkový vitamín D

Jedná sa o 18-minútovú protilátkovú kompetitívnu imunoanalýzu, ktorá využíva monoklonálnu myšiu protilátku proti fluoresceínu kovalentne spojenú s paramagnetickými časticami, monoklonálnu myšiu protilátku proti 25-(OH) D označenú esterom akridínu a analóg vitamínu D označený fluoresceínom. Existuje recipročný vzťah medzi množstvom vitamínu D prítomným vo vzorke pacienta a množstvom relatívnych svetelných jednotiek (RLU) zistených systémom [21]. Výrobca udáva skríženú reaktivitu s inými metabolitmi (3-epi-25(OH) vitamínu D₃, parikalcitol, vitamín D₂, vitamín D₃, 1,25(OH)2 D₂, 1,25(OH)2 D₃, ktorá však podľa jeho vyhlásenia je minimálna.

Architect 25-OH Vitamín D

Metóda je oneskorená jednokroková chemiluminiscenčná imunoanalýza na mikročasticiach (CMIA – Chemiluminscent Microparticle Immunoassay) k kvantitatívnemu stanoveniu 25-(OH) D v ľudskom sére a plazme. Táto metóda využíva ovčiu polyklonálnu protilátku proti ľudskému vitamínu D triedy IgG v TRIS pufry. Množstvo vitamínu D vo vzorke je nepriamo úmerné signálu v jednotkách RLU detegovaného optikou systému ARCHITECT iSystem [22]. Aj tu výrobca deklaruje krížovú reaktivitu už spomínaných metabolitov, ktorá je podľa jeho vyhlásenia minimálna.

Elecsys Vitamin D total

Jedná sa o kompetitívny elektrochemiluminiscenčný väzobný test. Súprava Elecsys vitamin D total využíva proteín viažuci vitamín D (VDBP) ako vychytávajúci proteín, na ktorý sa viaže 25-(OH) D₃ a 25-(OH) D₂. Stanoveniu predchádza denaturácia a uvoľnenie 25-(OH) D z väzby na VDBP. Metóda je založená na väzbe 25-(OH) D s rutheniom značeným VDBP. Následne je pridaný biotínom značený 25-(OH) D, dôjde ku kompetícii o väzobné miesta na rutheinilovanom VDBP. Po pridaní streptavidínom potiahnutých mikročastíc prebehne interakcia biotín-streptavidín. Nenaviazané zložky sú odstránené. Privedené napätie na elektróde vyvolá chemiluminscenčnú emisiu fotónov. Emitované fotóny sú zmerané fotonásobičom a množstvo 25-(OH) D vo vzorke je nepriamo úmerné s množstvom emitovaných fotónov [23]. Výrobca udáva značnú skríženú reaktivitu s C3-epimérom-25 hydroxivitamínu D₃ a 24,25-dihydroxy vitamínom D₃. Ostatné metabolity vykazujú minimálnu skríženú reaktivitu.

25-OH Vitamin D₃/D₂ RP– HPLC

Separačná metóda HPLC s obrátenou fázou je určená pre kvantitatívne stanovenie 25-(OH) D₃ a 25-(OH) D₂ v sére a plazme. Ide o test, v ktorom vlastnú analýzu vzorky predchádza jednoduchá príprava vzorky pozostávajúca z kombinácie precipitácie a extrakcie. Separácia HPLC prebieha v izokratickom režime pri 30 °C na kolóne s „reverznou fázou“. Rozmer kolóny je 125 × 4 mm, prietoková rýchlosť 1 ml/min. Formy 25-(OH) D sú detegované pomocou UV detektora pri 264 nm. Limit detekcie pre 25-(OH) D₃ je 7 nmol/l a pre 25-(OH) D₂ 9,4 nmol/l. Linearita 25-(OH) D₃/D₂ je do 1 250 nmol/l. Výťažnosť pre 25-(OH) D₃ je 109,8 % a pre 25-(OH) D₂ 102,8 %. Špecificita metódy bola testovaná porovnaním retenčných časov zmesí štandardných roztokov 25-(OH) D₃/D₂ s kalibrátorom. Minimálne rozdiely medzi retenčnými časmi (< 3 %) umožňujú spoľahlivú identifikáciu píkov. Pridaním metabolitov [1,25-(OH)2 D₃/D₂, 24,25-(OH)2 D₃] nebola pozorovaná interferencia. Separácia trvá 15 minút pre každý beh. Výsledky sa kvantifikujú podľa kalibrátora a vypočítavajú sa externým štandardným spôsobom stanovením výšky píku. Systém využíva jednobodovú kalibráciu a má 2 hladiny kontrol [24]. Pri analýze pacientskych vzoriek, pre účely predkladanej práce, boli použité kalibrátory výrobcu s cieľovými koncentráciami pre 25-(OH) D₃ =142 nmol/l a pre 25-(OH) D₂ =185 nmol/l. Pre kontrolu kvality boli použité lyofilizované kontrolné materiály výrobcu s cieľovými hodnotami pre 25-(OH) D₃, L1 = 51,8, resp. L2 = 89,9 nmol/l, a pre 25-(OH) D₂, L1 = 116,7, reps. L2 = 209,1 nmol/l. Celkovo bolo vykonaných 24 kontrolných meraní, 6 kontrolných meraní pre každý analyt a kontrolnú hladinu. Priemerná nameraná koncentrácia pre 25-(OH) D₃ bola L1 = 47,1 nmol/l (bias = -9,14 %) a L2 = 87,5 nmol/l (bias = -2,69 %). Priemerná nameraná koncentrácia pre 25-(OH) D₂ bola: L1 = 119,7 nmol/l (bias = -1,30 %) a L2 = 209,1 nmol/l (bias = -3.83 %). Žiadne z kontrolných meraní neprekročilo definovaný limit ± 21,5 %.

Štatistická analýza

Na porovnanie metód bola použitá regresná analýza podľa Passing-Babloka a Bland-Altmanova analýza diferencií. Za maximálne akceptovateľné diferencie v jednotlivých výsledkoch boli považované hodnoty v rozmedzí ± 21,5 %. Toto kritérium bolo zvolené na základe CDC Vitamin D Standardization-Certification Program (VDSCP). Kritérium tak bolo vypočítané, z podmienok pre bias = 5 % a pre precíznosť = 10 %, podľa vzťahu TE_A = 1,65 * CV + bias. Pre účely korelačnej analýzy boli, vzhľadom na negaussovské rozdelenie dát, použité Spearmanove korelačné koeficienty. Za štatisticky významné boli považované hodnoty P ≤ 0,05. Hodnoty 25-(OH) D₂ a 25-(OH) D₃ namerané pomocou HPLC boli sčítané a uvedené ako 25-(OH) D. Stredné koncentrácie 25-(OH) D, D₂ a D₃ boli vyjadrené formou mediánu spolu s interkvartilovým rozsahom (IQR). Miera zhody v interpretácii nameraných výsledkov celkového vitamínu D bola vyhodnotená jednak na základe odporúčaných kritérií pre centrálnu Európu [26] a následne na základe metódo-špecifických rozhodovacích limitov, ktoré boli získané prepočtom odporúčaných kritérií pomocou regresných rovníc. Na vyhodnotenie dát bol použitý MedCalcStatistical Software version 13.1.2 (MedCalc Software bvba, Ostend, Belgium; http://www.medcalc.org; 2014) a Microsoft Excel (2013).

Výsledky

Najväčšia stredná koncentrácia 25-(OH) D bola zaznamenaná u metódy ROCHE (medián = 91,02 nmol/l, IQR = 42,58–123,1 nmol/l), potom u metódy HPLC (medián = 71,8 nmol/l, IQR = 38,55–100,4 nmol/l), následne u metódy ABBOTT (medián = 67,93 nmol/l, IQR = 32,28–91,35 nmol/l) a nakoniec u metódy SIEMENS (medián = 51,73 nmol/l, IQR = 18,01–70,12 nmol/l). Koncentrácia 25-(OH) D bola determinovaná takmer výlučne 25-(OH) D₃. Metóda HPLC poukázala na strednú koncentráciu 25-(OH) D₃ = 71,9 nmol/l (IQR = 44,08–100,0 nmol/l). Medián 25-(OH) D₂ z celého súboru výsledkov nebol kvantifikovateľný. Merateľná koncentrácia 25-(OH) D₂ bola zaznamenaná iba v 7 prípadoch. Medián 25-(OH) D₂ z tohto súboru výsledkov bol 30,4 nmol/l (IQR = 23,45–115,8 nmol/).

Namerané výsledky 25-(OH) D pomocou 3 imunochemických metód boli porovnané s metódou HPLC ako aj navzájom medzi sebou pomocou regresnej analýzy podľa Passing-Babloka. Výsledky tejto analýzy sú zhrnuté v tab. 1 a graficky je znázorňuje graf 1. Spomedzi porovnávaných metód bola korelácia medzi HPLC a ABBOTT najlepšia (R = 0,873, P < 0,0001), potom medzi HPLC a ROCHE (R = 0,849, P < 0,0001) a nakoniec medzi HPLC a SIEMENS (R = 0,842, P < 0,0001). Pri porovnaní imunochemických metód navzájom bola zistená najlepšia korelácia medzi SIEMENS a ABBOTT (R = 0,972, P < 0,0001), potom medzi ROCHE a ABBOTT (R = 0,923, P < 0,0001) a nakoniec medzi SIEMENS a ROCHE (R = 0,904, P < 0,0001).

Bias medzi imunochemickými metódami a metódou HPLC bol vyhodnotený pomocou Bland-Altmanovej analýzy. Výsledky tejto analýzy graficky znázorňuje graf 2. Spomedzi porovnávaných metód bol zaznamenaný najmenší priemerný bias medzi metódou HPLC a ABBOTT (-0,2 %), potom medzi HPLC a SIEMENS (23,4 %) a nakoniec medzi HPLC a ROCHE (-28,0 %).

Pri vzájomnom porovnaní imunochemických metód bol zaznamenaný najmenší priemerný bias medzi metódou ROCHE a ABBOTT (22,8 %), potom medzi SIEMENS a ABBOTT (-32,1 %) a nakoniec medzi SIEMENS a ROCHE (-53,6 %).

V tab. 2 je znázornená miera zhody v klasifikácii výsledkov 25-(OH) D s ohľadom na odporúčané ako aj metódo-špecifické rozhodovacie limity. Na základe odporúčaných kritérií bola medzi metódou HPLC a ABBOTT zhoda v 65,22 %, medzi metódami HPLC a ROCHE v 59,63 % a medzi metódou HPLC a SIEMENS 46,79 % prípadov. Miera falošnej negativity výsledkov bola najväčšia u metódy SIEMENS (50,46 %), potom u metódy ABBOTT (30,43 %) a nakoniec u metódy ROCHE (11,93 %). Miera falošnej pozitivity bola naopak najvyššia u metódy ROCHE (28,44 %), potom u metódy ABBOTT (4,35 %) a nakoniec u metódy SIEMENS (2,75 %). Pri interpretácii výsledkov na základe metódo-špecifických rozhodovacích limitov bola medzi metódou HPLC a ABBOTT zhoda v 67,39 %, medzi metódami HPLC a ROCHE v 66,06 % a medzi metódou HPLC a SIEMENS v 65,14 % prípadov. Z tohto jednoduchého experimentu je zrejmé, že miera zhody sa vylepšila u všetkých troch imunochemických metód s najvýraznejším zlepšením u metódy SIEMENS (46,79 % vs 65,14 %) a je porovnateľná u všetkých 3 metód. Podobne došlo aj k rovnomernejšiemu rozloženiu falošne negatívnych a pozitívnych výsledkov.

Diskusia

Stanovenie hladiny 25-(OH) D sa stáva predmetom záujmu mnohých medicínskych špecializácií. Klinické laboratóriá sa musia vysporiadať s narastajúcim počtom indikácií stanovenia hladiny 25-(OH) D. I keď sa za referenčnú metódu považuje metóda LC-MS/MS, tá je pre svoju prístrojovú, ekonomickú náročnosť a náročnosť na obsluhu v rutinných podmienkach laboratórií nahradzovaná imunochemickými metódami, ktoré v súčasnosti poskytujú viacerí výrobcovia IVD prostriedkov [26]. Výber metódy je na rozhodnutí laboratórií, pričom neexistuje jednoznačný návod, ktorý by pomohol pri výbere najvhodnejšej metódy. Situáciu výrazne komplikuje nízka úroveň štandardizácie metód, ktorá spolu so všeobecnými cut-off hodnotami pre hodnotenie statusu 25-(OH) D môže v konečnom dôsledku skomplikovať klinické rozhodovanie. Už niekoľko autorov zaoberajúcich sa touto problematikou poukazuje na riešenie situácie, pričom poukazujú na nutnosť štandardizácie metód s vhodným referenčným materiálom [15], prípadne vytvorením metódo-špecifických referenčných intervalov[16,26,27]. V tejto štúdii sme sa zamerali na porovnanie 3 imunochemických metód stanovenia 25-(OH) D s HPLC, ktoré sa podľa nášho názoru a skúseností, využívajú v rutinnej praxi najčastejšie. Počas trvania tejto štúdie mali všetky použité imunochemické metódy vydaný certifikát VDSCP (Vitamin D Standardization-Certification Program). Tento certifikát sa vydáva pre metódy, ktoré splnia certifikačné podmienky, bias ≤ 5 % a precíznosť ≤ 10 %, od CDC a University of Ghent Vitamin D₂ and D₃ referenčných metód v rozsahu 22,5–275 nmol/l. Výsledky regresnej analýzy ako aj analýzy diferencií v tejto práci poukázali na významné rozdiely medzi skúmanými metódami. K podobným záverom sa dopracovali viaceré publikované štúdie [28–34].

Namerané výsledky 25-(OH) D sme podrobili aj interpretácii s ohľadom na všeobecné rozhodovacie limity platné pre centrálnu Európu [26]. Tieto odporúčania rozoznávajú 6 pásiem koncentrácie 25-(OH) D: < 50 nmol/l (deficit), 50–75 nmol/l (suboptimum), 75–125 nmol/l (adekvátny status), 125–250 nmol/l (nadmerná zásoba), 250–500 nmol/l (riziková koncentrácia), > 500 nmol/l (toxicita). Na základe týchto kritérií bola medzi metódami značná diverzita v miere zhody ako aj v miere falošne negatívnych a pozitívnych výsledkov. Po prepočte rozhodovacích limitov pomocou regresných rovníc pre každú metódu sa miera zhody ako aj miera falošne negatívnych a pozitívnych výsledkov ustálila na približne rovnakej úrovni naprieč všetkými metódami, pričom vo všetkých prípadoch došlo k zlepšeniu týchto ukazovateľov.

I keď štandardizácia je najčastejšie skloňovaným problémom, je nutné zmieniť aj iné potencionálne zdroje príčin diskrepancií medzi výsledkami 25-(OH) D. Viacerí autori v literatúre poukazujú na ďalšie príčiny, ktoré môžu spôsobiť značné rozdiely medzi metódami stanovenia 25-(OH) D. Podľa nich sa javia ako problematické metabolity vitamínu D, napr. 3-epi-25 hydroxivitamín D, 24,25-dihydroxyvitamin D, rozdielna imunoreaktivita 25-(OH) D₂ a 25-(OH) D₃, heterofilné protilátky, VDBP (Vitamin D Binding Protein) [35–37].

Záver

Úroveň štandardizácie metód stanovenia 25-(OH) D je i doposiaľ nedostatočná a spolu s ďalšími faktormi môže skresľovať klinické rozhodovanie, čo môže viesť k neadekvátnym terapeutickým postupom. Nedá sa očakávať, že sa situácia v blízkej budúcnosti významne zmení, a preto je vhodné uvažovať aspoň o používaní na metóde závislých rozhodovacích limitov, ktoré môžu pri najmenšom zlepšiť interpretáciu výsledkov 25-(OH) D naprieč rôznymi rutinne používanými metódami.

Mgr. Anton Vaňuga

vvanuga@nedu.sk

Národný endokrinologický a diabetologický ústav, n.o.,

Ľubochňa,

Slovenská republika

www.nedu.sk

Doručeno do redakce 9. 3. 2017

Přijato po recenzi 27. 6. 2017