Vrozené hyperbilirubinemie a molekulární mechanizmy žloutenky

Overview

Úvod shrnuje klasickou dráhu degradace hemu a z ní odvozené rozdělení žloutenek. Následuje popis vrozených žloutenek známých jako Crigler‑ Najjarův, Gilbertův, Dubin‑Johnsonův a Rotorův syndrom s důrazem na vysvětlení molekulární podstaty těchto metabolických poruch. Zvláštní pozornost je věnována nedávno objevenému molekulárnímu mechanizmu Rotorova syndromu spočívajícímu v neschopnosti jater zpětně vychytávat frakci konjugovaného bilirubinu vylučovaného primárně do krve a nikoliv do žluči. Snížená schopnost jater vychytávat konjugovaný bilirubin přispívá i k rozvoji hyperbilirubinemie u běžných onemocnění jater a žlučových cest a k toxicitě xenobio­tik a léků využívajících transportní proteiny pro konjugovaný bilirubin.

Klíčová slova:
hem –  bilirubin –  Gilbertův syndrom –  Dubin‑Johnsonův syndrom –  Rotorův syndrom –  OATP1B1 –  OATP1B3

Úvod

Bilirubin je konečným produktem degradace hemu, jehož hlavními zdroji jsou erytrocyty a buňky erytropoetické řady pohlcované makrofágy ve slezině a v krvetvorné kostní dřeni. Méně významným zdrojem jsou cytochromy v jaterních buňkách. Nekonjugovaný, ve vodě prakticky nerozpustný bilirubin, vázaný na albumin, je krví transportován do jater. Po disociaci vazby na albumin je bilirubin importován do hepatocytů, v jejichž cytosolu se váže na proteiny ze skupiny glutation‑ S‑ transferáz označované dříve názvem ligandin. Následuje konjugace se dvěma molekulami kyseliny glukuronové, která se odehrává v lumen endoplazmatického retikula za katalýzy uridindifosfátglukosiduronát bilirubin glukuronosyltransferázou UGT1A1 (EC 2.4.1.17) (obr. 1).

Gen UGT1A1 lokalizovaný v komplexním genovém lokusu UGT1A [1] kóduje jediný pro bilirubin specifický konjugační enzym UGT1A1. Konjugovaný, ve vodě rozpustný bilirubin je zatím neznámým mechanizmem exportován z endoplazmatického retikula zpět do cytosolu, odkud migruje ke žlučovému pólu hepatocytu. Ze žlučového pólu je konjugovaný bilirubin aktivně secernován do žluči působením kanalikulárního ABC transportéru ABCC2/ MRP2 fungujícího jako exportní pumpa multivalentních organických aniontů. Vedle této pumpy je pravděpodobná účast dalších transportérů s nižší afinitou ke konjugovanému bilirubinu (např. ABCG2), které při vyřazení genu ABCC2 přejímají úlohu bilirubinové pumpy [2]. Ve střevě je konjugovaný bilirubin dekonjugován, zčásti resorbován a zčásti dále degradován působením bakteriální střevní flóry.

Dědičné poruchy metabolizmu jsou klíčem k poznání metabolických drah. Nejinak je tomu i v případě metabolické dráhy degradace hemu. Na základě bio­chemického vyšetření je možno rozlišovat převážně nekonjugované žloutenky, vyvolané buď nadprodukcí bilirubinu při hemolýze, nebo sníženou rychlostí jaterní konjugace, a převážně konjugované žloutenky, jejichž vyvolávající příčinou je onemocnění jaterního parenchymu, intrahepatální cholestáza nebo obstrukce žlučových cest (obr. 1).

Dědičné převážně nekonjugované hyperbilirubinemie jsou vyvolány mutacemi v genu pro UGT1A1 a zahrnují Crigler‑ Najjarův syndrom I. a II. typu a benigní hyperbilirubinemii Gilbertova typu. Dědičné převážně konjugované hyperbilirubinemie zahrnují Dubin‑Johnsonův a Rotorův syndrom.

Crigler‑ Najjarův syndrom (CNS)

Crigler‑ Najjarův syndrom (CNS) [3] je raritní autozomálně recesivní porucha konjugace bilirubinu vyvolaná mutacemi ve strukturálních oblastech genu UGT1A1. Podle koncentrace sérového bilirubinu se rozlišuje CNS I. typu (OMIM #218800) a CNS II. typu (OMIM #606785) [4].

Pro CNS I. typu jsou charakteristické hodnoty bilirubinu nad 350 µmol/ l. Ostatní laboratorní nálezy, chromoexkreční testy, jakož i jaterní histologie jsou v mezích normy. Konjugační aktivita bilirubinu je prakticky nulová a bilirubinemie neklesá po podání fenobarbitalu. Příčinou jsou nonsense a ně­kte­ré missense mutace v exonech či jejich intronickém okolí, jejichž důsledkem je ztráta funkce či prakticky nulová exprese proteinu UGT1A1 [5]. Neléčená choroba je letální, postižení umírají zpravidla v dětském věku na jádrový ikterus. Terapie spočívá v celoživotní intermitentní fototerapii (někdy až po dobu 12 hod denně) nebo v transplantaci jater. Při fototerapii dochází k intenzivnímu vylučování ve vodě rozpustných fotoizomerů nekonjugovaného bilirubinu do žluči. Ve střevě probíhá částečná zpětná izomerace na nekonjugovaný bilirubin IXa,který vstupuje do enterohepatálního cyklu. Zvýšení účinnosti fototerapie je možno dosáhnout adjuvantní terapií, která spočívá v sekvestraci bilirubinu ve střevě (např. vazbou na neresorbovatelný fosforečnan vápenatý) nebo v urychlení střevní degradace bilirubinu. K transplantaci jater se přistupuje kolem 5. roku věku, neboť účinnost fototerapie s věkem postupně klesá a tím roste riziko náhlého poškození mozku [6].

CNS II. typu je benigní formou CNS. Bilirubinemie dosahuje hodnot 100– 350 µmol/ l. Stejně jako u CNS I. typu jsou ostatní laboratorní nálezy a jaterní morfologie normální. Aktivita UGT1A1 v játrech je snížena na 10– 25 % normální hodnoty a hlavním produktem bilirubinu je bilirubin monoglukosiduronát. Na rozdíl od většiny případů CNS I. typu dochází u CNS II. typu po podání fenobarbitalu k výrazné indukci transkripce genu UGT1A1, která se projeví poklesem bilirubinemie. CNS II. typu je podmíněn takovými mutacemi v genu UGT1A1, z nichž alespoň jedna nemá za následek kompletní inaktivaci či nulovou expresi kódovaného enzymu [5]. Průběh CNS II. typu je benigní a s výjimkou novorozeneckého období zpravidla nevyžaduje žádnou terapii.

Gilberův syndrom (GS)

Familiární nehemolytická žloutenka, popsaná jako benigní hyperbilirubinemie již v roce 1901 [7], je autozomálně recesivně dědičná metabolická odchylka podmíněná konstitutivním snížením rychlosti konjugace bilirubinu v játrech na hodnoty kolem 30 % [8,9]. Prevalence GS v kavkazské populaci je 5– 10 % [10,11]. V evropské populaci je GS v převážné většině případů podmíněn homozygotním stavem pro variantu A(TA₇)TAA TATA‑ boxu v promotoru genu UGT1A1 [12]. Normální sekvence TATA‑ boxu je A(TA₆)TAA. Inzerce TA má za následek snížení exprese strukturálně normálního enzymu UGT1A1 [12]. U většiny nositelů GS je exprese UGT1A1 dále snížena přítomností druhé mutace T>G v pozici – 3 279 od začátku translace genu UGT1A1 v tzv. gtPBREM (glucuronosyltransferase phenobarbital response enhancing motif) [13,14]. Tato mutace je příčinou zpomaleného poklesu bilirubinemie po podání fenobarbitalu, čehož bylo v minulosti využíváno dia­gnosticky v tzv. fenobarbitalovém testu. Vedle uvedených mutací v promotoru genu UGT1A1 mohou GS vyvolat i mutace ve strukturálních oblastech genu. Nejčastější je heterozygotní mutace c.211G>A vyskytující se především v asijských populacích [15]. V homozygotním stavu vyvolává tato mutace CNS II. typu [16]. Fenotyp heterozygotů pro ně­kte­ré mutace vyvolávající CNS odpovídá fenotypu GS [17].

Klinicky se familiární nehemolytická žloutenka Gilbertova typu projevuje jako intermitentní ikterus sklér, popř. mírná žloutenka kůže a sliznic. K tomu se mohou přidružit neurotické symptomy, zvýšená únava, nechutenství bez poklesu tělesné hmotnosti a abdominální dyskomfort. Fyzikální vyšetření je zcela v normě stejně jako laboratorní nález s výjimkou hyperbilirubinemie nekonjugovaného typu zřídka přesahující 100 µmol/ l. Bilirubinemie se zvyšuje při fyzické zátěži, stresu a hladovění, čehož bylo v minulosti využíváno k dia­gnostickému testu (tzv. test hladověním). U části nositelů GS byla pozorována snížená clearance bromsulfoftaleinu, indocyaninové zeleně a dalších aniontových barviv [4]. V bio­ptických vzorcích jater bylo pozorováno hromadění lipofuscinu v hepatocytech, a to především v centrilobulární zóně [4]. Ani testy jaterní chromoexkrece, ani výsledky jaterní bio­psie nemají žádnu dia­gnostickou hodnotu, a proto tato vyšetření nejsou indikována. GS dnes není považován za chorobu, nýbrž za metabolickou odchylku, která nevyžaduje žádnou terapii ani dietní či režimová opatření. U nositelů GS byl naopak prokázán nižší výskyt kardiovaskulárních chorob a nádorových onemocnění, což je přičítáno antioxidačním vlastnostem bilirubinu [18].

Dubin‑Johnsonův syndrom (DJS)

Dubin‑Johnsonův syndrom (DJS, OMIM #237500) je vzácná benigní autozomálně recesivní konjugovaná hyperbilirubinemie. Genetickou příčinou DJS jsou mutace v genu ABCC2/ MRP2 [19]. Gen ABCC2 je lokalizován na dlouhém raménku 10. chromozomu (10q24), zaujímá 45 kb a sestává z 32 protein kódujících exonů.

Pro klinický obraz je charakteristický kolísavý ikterus sklér a někdy i kůže bez dalších příznaků. Hladina celkového bilirubinu se pohybuje kolem 100 µmol/ l, přičemž více než 50 % připadá na přímý bilirubin [20,21]. Ostatní laboratorní nálezy včetně odpadu celkových porfyrinů jsou normální, avšak izomer I koproporfyrinu představuje více než 50 % vylučovaného koproporfyrinu [22]. Vylučování bromsulfoftaleinu do žluči po i.v. podání je zpomaleno a v 90. min po podání dochází k opětovnému vzestupu jeho koncentrace [23]. Obdobnou kinetiku jako bromsulfoftalein mají indocyaninová zeleň a další organické anionty včetně radiofarmak používaných k cholescintigrafii, takže vizualizace jater i plnění žlučníku jsou opožděny [24– 26]. Jaterní histologie je normální s výjimkou akumulace tmavého melanin‑like pigmentu s výraznou autofluorescencí v hepatocytech. Pigment, jehož chemické složení dosud není známo, dává pozitivní PAS reakci a redukuje amoniakální roztok stříbra (Masson‑ Fontanova reakce), avšak na rozdíl od melaninu neredukuje neutrální roztok stříbra. Byly dokumentovány i případy DJS bez pigmentace jater [27,28]. Imunohistologicky lze ve většině případů prokázat absenci proteinu ABCC2 v kanalikulární membráně hepatocytů [29]. Výjimečně může být mutovaný nefunkční protein ABCC2 normálně exprimován [30].

Na našem pracovišti byly zachyceny nové mutace v genu ABCC2 u jedinců s DJS [31,32] a zdokumentován první případ dosud nepopsané převážně nekonjugované dědičné žloutenky vyvolané přítomností mutací typických pro DJS a GS [31]. Podíl konjugovaného bilirubinu u této tzv. duální hereditární žloutenky činí pouze 20– 50 % sérové koncen­trace celkového bilirubinu.

Rotorův syndrom (RS)

Rotorův syndrom (RS, OMIM #237540) je velmi vzácná autozomálně recesivně dědičná forma převážně konjugované žloutenky, která je klinickým a základním laboratorním vyšetřením neodlišitelná od DJS. Stejně jako u DJS je u RS převažujícím vylučovaným koproporfyrinem izomer I. Na rozdíl od DJS je odpad celkových porfyrinů v moči zvýšen a poměr izomeru I koproporfyrinu k izomeru III bývá nižší než u DJS [33]. Vylučování aniontových barviv játry je pomalejší než u DJS a nedochází k opětovnému vzestupu jejich koncentrace [34]. Při cholescintigrafii se nezobrazí ani játra ani žlučník a zobrazení žlučníku bylo pozorováno teprve po řadě hodin [24,35,36]. Jaterní histologie je zcela normální. Příčina Rotorova syndromu nebyla donedávna známa.

Na našem pracovišti se během 10 let jeho existence podařilo shromáždit klinické a laboratorní nálezy 11 nositelů Rotorova syndromu pocházejících ze 4 středoevropských, 3 arabských a 1 filipínské rodiny. Ve spolupráci se skupinou Ing. S. Kmocha z Ústavu dědičných metabolických poruch 1. lékařské fakulty UK a VFN v Praze se nám kombinací homozygotního mapování a mapování unikátních delecí podařilo identifikovat kandidátní lokus na chromozomu 12p12 obsahující dvojici genů SLCO1B1 a SLCO1B3, jejichž všechny alely byly mutovány u všech 11 jedinců s RS [37]. Naopak všichni rodiče a sourozenci postižených nesli alespoň 1 normální alelu genu SLCO1B1 nebo SLCO1B3.

Geny SLCO1B1 a SLCO1B3 kódují proteiny OATP1B1 a OATP1B3 exprimované v sinusoidální membráně jaterních buněk, které jsou odpovědné za jaterní vychytávání nekonjugovaného i konjugovaného bilirubinu, jakož i řady dalších endogenních látek, xenobio­tik a léků. Odpověď na otázku, jak se konjugovaný bilirubin dostane do sinusoidální krve, poskytly experimenty s geneticky modifikovanými myšími liniemi provedené skupinou A. Schinkela v The Netherlands Cancer Institute v Amsterdamu [37]. Výsledky ukázaly, že významná frakce konjugovaného bilirubinu je za fyziologických podmínek secernována do krve prostřednictvím sinusoidální bilirubinové pumpy MRP3 homologní s MRP2. Zvýšená exprese proteinu MRP3 byla již dříve popsána jako hlavní kompenzační mechanizmus vylučování konjugovaného bilirubinu z cytosolu hepatocytů do krve u DJS [38] a při ně­kte­rých formách získané cholestázy, u nichž je blokována sekrece konjugovaného bilirubinu do žluči (sepse, toxiny, obstrukce žlučových cest) [39]. V centrální zóně jaterního lalůčku, kde je exprese rotorovských proteinů OATP1B1 a OATP1B3 nejvyšší, dochází ke zpětnému a téměř kompletnímu vychytávání konjugovaného bilirubinu z krve a jeho následnému vyloučení do žluče (obr. 2).

Rotorovské proteiny se podílejí i na vychytávání bilirubinu konjugovaného mimo játra, zejména ve střevě. Pravděpodobně největší význam transportní smyčky tvořené pumpou MRP3 a rotorovskými proteiny (obr. 2) spočívá v ochraně portálních hepatocytů před toxickým působením zvýšených koncentrací látek přicházejících do jater z portálního oběhu a ve zvýšení sekreční kapacity jater na podkladě přesunu části nálože organických aniontů a aniontových konjugátů z přetížených periportálních hepatocytů do méně zatěžovaných hepatocytů v centrální zóně [40].

Molekulární mechanizmy žloutenky a jejich farmakologický význam

Poznání molekulárního mechanizmu žloutenky u RS má význam pro vysvětlení patofyziologie žloutenky u běžných chorob jater a žlučových cest. Při parenchymové žloutence dochází vedle poruchy konjugace a sekrece bilirubinu i k poruše jaterního vychytávání nekonjugovaného a patrně i konjugovaného bilirubinu ze sinusoidální krve. Na snížení vychytávání obou forem bilirubinu se může podílet snížená aktivita či exprese proteinů OATP1B1 a OATP1B3. U cholestázy či obstrukce žlučových cest může být konjugovaná hyperbilirubinemie potencována snížením exprese rotorovských proteinů. Tuto hypotézu podporují imunohistologické nálezy snížené exprese proteinů OATP1B1 a OATP1B3 u ně­kte­rých cho­-lestatických jaterních chorob [41].

Jako zásadní se jeví význam jaterního cyklu bilirubinu a dalších organických aniontů pro vychytávání a metabolizmus xenobio­tik a léků v jaterních buňkách. Rotorovské proteiny např. zprostředkovávají vychytávání nekonjugovaných žlučových kyselin, konjugovaných steroidů, hormonů štítné žlázy, bromsulfoftaleinu, indocyaninové zeleně, radiofarmak pro cholescintigrafii, benzylpenicilinu, rifampicinu, atorvastatinu, pravastatinu, rosuvastatinu, ně­kte­rých sartanů či metotrexátu [42]. Rovněž bylo prokázáno, že variace v rotorovských genech jsou asociovány se závažnými nežádoucími účinky léků, např. statinů [43].

Závěr

Dráha degradace hemu je považována za jednu z nejjednodušších a nejlépe prostudovaných metabolických drah u člověka. Cesta k poznání molekulární podstaty RS však ukázala, že i v takto detailně prostudované metabolické dráze existuje řada dosud nezodpovězených otázek, mezi něž patří např. dosud neznámý mechanizmus třídění molekul konjugovaných v endoplazmatickém retikulu na sloučeniny vylučované do žluči a do krve či úloha nosičství patogenních mutací v ně­kte­ré z alel genů SLCO1B1 či SLCO1B3 v rozvoji nežádoucích účinků ně­kte­rých běžně používaných léků.

doc. MU Dr. Mgr. Milan Jirsa, CSc.

www.ikem.cz

e‑mail: milan.jirsa@ikem.cz

Doručeno do redakce: 20. 3. 2013