Prenatální diagnostika nejčastějších chromozomálních aberací

Prenatální diagnostika má v současné medicíně a lékařské praxi stále větší význam. Řada závažných onemocnění nebo vrozených vývojových vad je spojena s tzv. chromozomálními aberacemi. Prenatální diagnostika je zaměřena z velké části právě na detekci těchto chromozomálních změn. Porozumění možnostem a principům prenatální diagnostiky je tak důležité pro lékaře všech oborů, protože napomáhá nejen rozvoji znalostí metod moderní medicíny, ale i pochopení etiologie těchto onemocnění.

Klíčová slova:
prenatální diagnostika, chromozomální aberace, vrozené vývojové vady, QF-PCR (kvantitativní fluorescenční polymerázová řetězová reakce).

Úvod

V současné medicíně se rychlým tempem rozvíjí řada metod, která napomáhá objektivním způsobem odhalovat kauzální příčiny řady poruch a onemocnění (25, 26). To má velký význam jak nyní v oblasti samotného porozumění etiopatogeneze daných onemocnění, tak v budoucnu pro možné efektivní preventivní nebo terapeutické intervence (1).

Mezi nejrychleji se rozvíjející metody se značným diagnostickým potenciálem patří tzv. prenatální diagnostika. Ta představuje soubor metod a postupů využívaných k diagnostice u ještě nenarozeného jedince a jejím cílem je včasné odhalení závažných vrozených vývojových vad (VVV) (5). Většinu z nich způsobují chromozomální změny, a prenatální diagnostika je zaměřena z velké části právě na jejich detekci.

Na zvýšené riziko výskytu chromozomálních aberací mohou poukázat screeningová vyšetření (biochemický screening) v I./ II. trimestru těhotenství. S platnou legislativou je v ČR možné uměle ukončit těhotenství, pokud je u plodu prokázána závažná vrozená vada nebo chromozomální aberace, a to až do dokončeného 24. týdne těhotenství. Ve většině případů pro prenatální vyšetření chromozomálních aberací, kde je nutno řešit urgentní diagnostické problémy, jsou důvody indikace:

• u žen s výsledky patologického ultrazvukového vyšetření nebo těžkých komplikací gravidity a vývoje plodu,
• věk matky nad 35 let (věková indikace),
• psychický stres matky (12, 20, 23) v období gravidity s nutností co nejrychlejší diagnózy rizik nejdůležitějších aneuploidií,
• identifikace pohlaví plodu u gonozomálně recesivních chorob ke snížení psychického stresu matky,
• záchyt gravidity s rizikem aneuploidie až po 20. týdnu gravidity,
• ověření výsledku cytogenetického vyšetření z důvodu neúspěšné kultivace fetálních buněk,
• vyšetření produktů koncepce (9, 13).

Pro účely vyšetření jsou odebrány buňky plodu metodami:

• amniocentéza (odběr vzorku plodové vody),
• odběr choriových klků,
• kordocentéza (odběr fetální krve),
• fetoskopie (odběr tkáně plodu).

Nejčastěji užívanou metodou je amniocentéza.

Nejčastější aneuploidie

Normální lidský počet chromozomů v buňce, karyotyp, se skládá ze 46 (23 párů) chromozomů. Z toho 22 párů tvoří nepohlavní chromozomy – autozomy (označené číslem od 1 do 22) a poslední pár tvoří pohlavní chromozomy – gonozomy (ženské pohlaví je označené XX, mužské XY).

Chromozomální aberace

jsou vrozené nebo získané odchylky karyotypu, týkají se struktury chromozomu (strukturní chromozomální aberace) nebo počtu chromozomů v buňce (numerické chromozomální aberace, aneuploidie). Některé chromozomální změny významně postihují svého nositele, nebo jsou dokonce neslučitelné s životem.

Trizomie chromozomů 21, 18, 13 a aneuploidie chromozomů X a Y jsou zodpovědné za 95 % chromozomálně podmíněných vrozených vývojových vad, přičemž nejvyšší podíl aberací (75 %) nesou pohlavní chromozomy.

Autozomální trizomie chromozomů 21, 18 a 13 mají velmi rozmanité genotypické příznaky. Většinou jsou spojovány s vrozenými vadami: zpomalením duševního vývoje a očekáváním zkráceného života – jsou to jediné trizomie postnatálně slučitelné se životem.

Trizomie chromozomu 21 (Downův syndrom) je nejznámější chromozomální aberací, uváděná incidence je přibližně 1 : 700 živě narozených dětí. Více než 95 % případů Downova syndromu je způsobeno volnou trizomií chromozomu 21 vzniklou nondisjunkcí během meiotického dělení. Jen asi 5 % případů je způsobeno translokacemi či nondisjunkcí během mitotického dělení v somatických buňkách, která vede k mozaikovým formám Downova syndromu.

Mezi nejdůležitější fenotypové znaky patří:

• psychomotorické retardace,
• mongoloidní vzhled,
• velký jazyk,
• krátké a široké ruce,
• zvýšené riziko vzniku leukémie,
• častý výskyt vrozených vad srdce, či
• atrézie střeva.

Jedinci postiženi Downovým syndromem se dožívají maximálně pátého decenia života.

U trizomie chromozomu 18 (Edwardsův syndrom) je uváděna incidence 1 : 3 000 živě narozených dětí (15). Až 95 % plodů s Edwardsovým syndromem, zejména plody mužského pohlaví, je během těhotenství spontánně potraceno. Většina těchto dětí umírá před dokončením šestého měsíce života. Charakteristická je těžká psychomotorická retardace a mnohočetné vrozené vývojové vady.

Incidence Patauova syndromu, trizomie chromozomu 13, se udává v rozmezí 1 : 10 000 – 1 : 20.000. Volná trizomie chromozomu 13 je způsobena v 75 % případech, zbylých 25 % zapříčiňují translokace či nondisjukce mitotického dělení (17).

Fenotyp se vyznačuje:

• mikrocefalií,
• holoprozencefalií,
• mikroftalmií,
• kyklopií nebo hypotelorismem,
• rozštěpem rtu a patra,
• srdečními vadami.

Zhruba 50 % pacientů umírá během prvního měsíce života.

Chromozomální aberace gonozomů patří mezi relativně časté geneticky podmíněné abnormality u člověka. Míra fenotypických projevů je značně variabilní. K nejčastějším klinickým příznakům patří různé anomálie pohlavních orgánů a poruchy reprodukce u obou pohlaví. Stupeň mentální retardace je mírný až středně těžký, záleží na množství nadpočetných X chromozomů (11). Pokud chybí lidskému zárodku v genotypové sadě chromozom X, plod se nemůže dále vyvíjet a dojde k předčasnému potratu.

Klinefelterův syndrom je poměrně běžná anomálie pohlavních chromozomů u mužů, incidence 1 : 1 000 živě narozených chlapců, kde místo jednoho X a jednoho Y chromozomu se nacházejí dva X a jeden Y chromozom (47, XXY).

Jedná se o polyzomii chromozomu X s chromozomem Y a různé druhy mozaik, ze kterých je nejčastější typ 47,XXY/46,XY.

Mozaikové formy tvoří přibližně 20 % všech případů.

Tento syndrom je charakterizován:

• malými varlaty s tubulární hyalinizací (vazivovou přeměnou semenotvorných kanálků),
• azoospermií (netvoří se spermie) s neplodností,
• nevelkým zvětšením prsou, může být přítomna porucha intelektu.

Mohou být připojeny anomálie jako

• kryptorchismus (nesestouplá varlata),
• hypospádie (rozštěp penisu),
• neurologické poruchy,
• skolióza,
• v dospělosti cukrovka.

Postižení se rozvíjí až v pubertě.

Na rozdíl od předchozích trizomií, u Turnerova syndromu místo nadbytečného chromozomu jeden chromozom chybí, jedná se tedy o monozomii. Pacienti mají 44 autozomů a jeden chromozom X – karyotyp 45, X0. Syndrom se vyskytuje u 1 : 2 500 ženských porodů a asi 99 % 45, X0 plodů se potrácí. Nejběžnější konstitucí chromozomů je u Turnerova syndromu 45, X (7), ale přibližně u poloviny pacientek se vyskytuje jiný karyotyp. Jde především o mozaiky typu 45,X/46, XX nebo 45,X/47, XXX. Zdá se, že ženy s mozaikou mají lépe zachovány funkce gonád, ale nelze jednoznačně konstatovat, že jsou vždy klinicky méně postiženy (10).

Ženy s Turnerovým syndromem jsou malé postavy a mají gonadální agenezi (nevyvinuté vaječníky). Spojené anomálie mohou zahrnovat

• krk s řasami,
• štítovitý hrudník,
• ledvinové, kožní, nádorové a autoimunitní problémy.

Fenotyp je velmi variabilní.

Moderní metody prenatální diagnostiky

Prenatální diagnostika fetálních aneuploidií je rutinně prováděna klasickými cytogenetickými technikami, což vyžaduje vyšetření fetálních buněk a jejich kultivaci dva až tři týdny. V případě vyšetření při podezření na výskyt chromozomální aberace a vzniku vrozené vývojové vady z důvodu genetické zátěže nebo na základě negativního screeningu mohou být dva týdny nejistoty pro matku velmi zátěžovým obdobím a znamenat velký stres, který může negativně ovlivňovat její psychický i celkový zdravotní stav (2, 21). Z důvodu zkrácení doby vyšetření se v současné době kromě stanovení celého karyotypu již rutinně provádí molekulárně-genetická metoda zaměřená na stanovení nejčastějších aneuploidií tzv. kvantitativní fluorescenční polymerázová řetězová reakce – QF-PCR (quantitative fluorescent polymerase chain reaction).

QF-PCR a princip metody

Kvantitativní fluorescenční polymerázová řetězová reakce – QF-PCR je metoda známá také jako amnioPCR (ze slova amniocentéza – metoda použita k získání vzorku). Je založena na amplifikaci (namnožení) specifických polymorfních krátkých tandemových repetic (small tandem repeats – STR). Jedná se úseky v nekódující oblasti DNA, které obsahují vysoce polymorfní sekvence mikrosatelitní DNA a jejichž délka s počtem opakování motivu je vysoce variabilní mezi jedinci. Pro diagnostiku je tedy použití těchto tandemových repetic velmi výhodné.

Metoda využívá fluorescenčně značených markerů pro vysoce polymorfní úseky chromozomů 13, 18, 21 a pohlavních chromozomů X a Y (15). Naamplifikované úseky DNA jsou kapilární elektroforézou rozděleny podle velikosti a detekovány. V průběhu jediného běhu se pak může současně analyzovat několik různých STR markerů za předpokladu, že se navzájem liší svou délkou, nebo jsou jejich primery označeny různými fluorescenčními barvami – jde o tzv. multiplexní PCR. Multiplexní QF-PCR je robustní s velmi nízkou pravděpodobností falešně pozitivního nálezu (4).

Elektroforetogram (výstupní protokol STR analýzy) je tvořen tzv. peaky u každého STR markeru. Peaky zobrazují alely jedince. Normální heterozygotní nález je zobrazen dvěma peaky, které jsou v poměru 1 : 1 (viz. obr. 1), homozygotní stav pouze jedním peakem. Stav trizomie je reprezentován třemi peaky (tzv. trialelický stav) nebo dvěma peaky v poměru 2 : 1 (tzv. dialelický stav) (viz. obr. 2).

Pro laboratoře využívající QF-PCR k diagnostice Mann et al. (14) vydali praktické pokyny nejen k metodice, ale součástí studie je i doporučení, jak uzavřít výsledek vyšetření nejčastějších aneuploidií – nejméně dva STR markery ležící na jednom chromozomu musí být informativní, jsou-li ostatní neinformativní.

Shrnutí

Indikace

Výhody metody QF-PCR

Omezení metody QF-PCR

Závěr

Řada vrozených vývojových vad je způsobena chromozomálními aberacemi. Ty je možné prenatálně detekovat. V současné době se již kromě klasických cytogenetických vyšetření, které stanovují odchylky v celém karyotypu, využívá rychlých metod molekulární diagnostiky ke stanovení nejčastějších chromozomálních aneuploidií – trizomií 13, 18, 21 a aneuploidí pohlavních chromozomů. Tato vyšetření se provádějí v případech nutnosti stanovení rychlého výsledku – tedy v současné době již ve většině případů, a to z důvodu snížení psychického stresu matky.

Metoda QF-PCR nabízí rychlou prenatální detekci chromozomálních aberací bez kultivace fetálních buněk a umožňuje tak odhalit aberace počtu chromozomů do 24 hodin po odběru plodové vody z mikromnožství fetálních buněk.

Jako každá metoda, má i QF-PCR svá omezení, oproti klasické karyotypizaci se nedokáže vyjádřit k numerickým abnormalitám jiných chromozomů. Dalším nedostatkem je nemožnost identifikovat strukturní chromozomální aberace (např. inverze nebo translokace). Přesto zůstává velmi přínosnou metodou rychlé diagnostiky, neboť dokáže podat informace o nejčastějších chromozomálních aneuploidiích ve velmi krátkém čase.

Rychlý rozvoj vědeckých poznatků a technologií se přibližuje stavu, kdy bude možné prostřednictvím prenatální diagnostiky hodnotit nejen výskyt závažných vývojových vad, ale též například pravděpodobný výskyt některých závažných neuropsychiatrických poruch a onemocnění jako například schizofrenie (8), mentálních retardací, autismu, ale i například hyperkinetického syndromu (16).

Diagnostika v této oblasti je ovšem ještě otázkou rozsáhlého výzkumu (19) a bezpochyby ještě dlouho bude poskytovat především orientační informaci než konkrétní diagnostický indikátor.

V souvislosti s užíváním tak pokročilých metod jako jsou metody prenatální diagnostiky je zapotřebí uvědomit si ale i etické aspekty, které přinášejí. Jedná se nejen o etické otázky přímo související s ukončováním těhotenství v indikovaných případech, ale také otázky způsobu komunikace výsledků, které mohou i zásadním způsobem ovlivnit život nejen matky, ale celé rodiny (18).

Společně s rovinou etického rozměru problematiky je též zapotřebí zvažovat klinickou a praktickou využitelnost stále zpřesňujících se údajů. Stále podrobnější a přesnější informace o výskytu možných poruch, onemocnění, anebo pouze o predispozicích k nim nemusejí ve skutečnosti mít žádný vliv na zlepšení kvality života nenarozeného jedince, a proto je zásadní otázka nejen samotné indikace, ale též rozsahu realizované prenatální diagnostiky. Tyto otázky musí být zodpovězeny ještě před samotným zpřesněním a rozvojem těchto metod.

Užívané pojmy

• chromozomální aberace – chromozomální odchylka
• aneuploidie – chybění nebo nadbytek chromozomů v buňkách organismu
• trizomie – tři kopie určitého chromozomu v buňkách organismu
• monozomie – chybění jednoho z páru chromozomu
• QF-PCR – kvantitativní fluorescenční polymerázová řetězová reakce
• PCR – polymerázová řetězová reakce
• amnioPCR – polymerázová řetězová reakce z DNA získané amniocentézou

RNDr. Hana Kuželová
Ústav biologie a lékařské genetiky 2. LF UK a FN Motol
V Úvalu 84
150 06 Praha
E-mail: hana.kuzelova@email.cz