Regulační T lymfocyty a jejich význam pro zhoubné novotvary hlavy a krku

Overview

V posledních dvaceti letech bylo získáno mnoho zásadních poznatků týkajících se regulace imunitního systému. Ovlivnění intenzity imunitní odpovědi, zahrnující i protinádorovou imunitu, patří k základním mechanismům zachování homeostázy. Jedním ze základních periferních regulačních mechanismů je působení regulačních T lymfocytů (Treg), zatím nejlépe definovaných jako podskupina CD4⁺ T lymfocytů (CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺). Jejich zvýšené zastoupení v periferní krvi u pacientů s různými typy malignit bylo prokázáno jako negativní prognostický parametr. Tento vztah byl prokázán i u dlaždicobuněčných karcinomů v oblasti hlavy a krku (HNSCC).

Klíčová slova:
regulační T lymfocyty, dlaždicobuněcný karcinom hlavy a krku, lymfocytární subpopulace, prognostický význam, časná recidiva.

Regulace imunitního systému, zahrnující i protinádorovou imunitní odpověď, patří k základním mechanismům zachování homeostázy. Imunitní systém je regulován na několika úrovních s cílem udržet v rovnováze odpověď proti antigenům cizím i vlastním. Definování základních principů imunitní odpovědi a její regulace je nezbytné pro správné nastavení léčebné strategie u celé řady různých chorob. Mnoho zásadních poznatků o funkcích a regulacích imunitního systému bylo získáno až v průběhu posledních dvaceti let.

Koncept tzv. „periferní tolerance“ byl ustanoven na podkladě transplantačních a autoimunitních zvířecích modelů, kdy bylo možné přenosem T lymfocytů z „tolerantní” myši zajistit „neodpovídavost“ u „naivního“ příjemce. Subpopulace T lymfocytů, která potlačuje aktivaci a proliferaci efektorových T buněk, je známa jako regulační T lymfocyty (Treg). Nejlépe definovaná je podskupina CD4⁺ T lymfocytů – CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺, ale jsou popsány i CD8⁺ buňky s regulační funkcí (1, 2, 3).

V minulosti bylo na existenci Treg nahlíženo se střídavým skepticismem, zejména díky nepřítomnosti antigenů, které by je jasně definovaly. Tento fakt změnily až práce Sakaguchiho v polovině 90. let, kdy se regulace imunitní odpovědi a regulační T buňky jako takové dostaly na výsluní zájmu imunologů (4, 5, 6).

Současný pohled

Dnes víme, že Treg jsou součástí normálně fungujícího imunitního systému a hrají kritickou roli při navození tolerance vůči antigenům exprimovaným na buňkách organismu, a to i buňkách nádorových. Absence dostatečného počtu Treg vede na straně jedné k těžkým autoimunitním onemocněním, na straně druhé neadekvátní množství či působení Treg negativně ovlivňuje imunitní odpověď vůči nádorovým buňkám a přispívá tak k rozvoji nádorového onemocnění.

Jako negativní prognostický parametr u některých typů malignit bylo popsáno jak zvýšené zastoupení Treg v periferní cirkulaci pacientů, tak i jejich akumulace v nádorovém mikroprostředí (7, 8, 9). Tento vztah byl prokázán i u dlaždicobuněčných karcinomů v oblasti hlavy a krku (HNSCC) (10, 11,12).

Doposud byly popsány minimálně tři základní typy lidských regulačních CD4⁺ T buněk.

První skupinaje definována jako CD4⁺CD25⁺IL-10⁺Foxp3^low buňky a označuje se jako regulační buňky 1. typu. Jejich aktivace probíhá při setkání s antigenem a je závislá na IL-10 (13).

Druhou skupinutvoří přirozeně vznikající regulační T lymfocyty (CD4⁺CD25^highFoxp3⁺ T cells (Treg), které vyzrávají ve specializovaném mikroprostředí thymu a mají schopnost inhibovat jak CD4⁺CD25^- tak i CD8⁺CD25^- T buňky. Zda je pro jejich působení nezbytný přímý kontakt buňky regulační a buňky cílové, či je působení zprostředkováno prostřednictvím solubilních cytokinů (IL-10, TGF-β, IL-35), nebo jiným mechanismem, není v současnosti jednoznačně uzavřeno (viz dále).

Třetí skupinutvoří Th3 lymfocyty, které jsou antigen-specifické a také produkují ve vysokých koncentracích cytokiny s imunosupresivním efektem (TGF-β a IL-4) (14).

Znaky definující Treg

Vyzrávání regulačních T lymfocytů v thymu i jejich setrvávání v periferní cirkulaci je závislé na IL-2, samy o sobě však nejsou schopné IL-2 produkovat. Receptor pro IL-2 se skládá z tří částí:

• alfa podjednotky (IL-2Rα, neboli CD25) která podmiňuje vysokou afinitu vazby cytokinu na receptor,
• beta podjednotky (IL-2Rβ, neboli CD122), a 
• společné jednotky gama (γc neboli, CD132).

Vazbou IL-2 na alfa podjednotku receptoru dojde k aktivaci signalizačních kaskád STAT5, MAPK a PI3K (1).

CD25 není receptorem unikátním pouze pro regulační T lymfocyty, ale je ve zvýšené míře exprimován na efektorových T lymfocytech po aktivaci jejich TCR (receptor T buněk rozpoznávající antigen). Nicméně populace CD4⁺CD25⁺ T lymfocytů se skládají zejména z buněk s inhibiční aktivitou.

Klíčovou úlohu pro Treg během vývoje v thymu a pro regulaci jejich funkce hraje transkripční faktor „forkhead box P3“ (Foxp3). Bývá také označován jako „master regulator“.

Foxp3 moduluje rozdílnou odpověď na stimulaci TCR u regulačních a u efektorových T lymfocytů. Gen pro Foxp3 je lokalizován na X chromozómu. Samotný transkripční faktor Foxp3 má tři základní funkční domény, které ovlivňují celou řadu biologických procesů. Foxp3 pozitivita je vysoce specifická pro CD4⁺25⁺ thymocyty a pro myší periferní T regulační buňky. U lidí je exprimován Foxp3 i na jiných než periferních regulačních T lymfocytech, což zároveň s intracelulární lokalizací tohoto znaku limituje jeho použitelnost pro izolaci a studium této subpopulace u pacientů (5, 6, 15, 16).

Na Treg dále nacházíme celou řadu dalších znaků zodpovědných za inhibiční a modulační signály. Nejvíce prostudované jsou molekuly CD28, CTLA-4 a GITR.

CD28 (všeobecně známý kostimulační receptor na konvenčních T lymfocytech) je zároveň nezbytný pro vývoj Treg, CD28 vazba na dvojitě pozitivní thymocyty indukuje expresi Foxp3 nezávisle na produkci IL-2 (15).

CTLA-4 (Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4) je tzv. Counter-receptor pro skupinu B7 kostimulačních molekul (CD80, CD86). Při kontaktu Treg prostřednictví CTLA-4 s antigen prezentující buňkou (APCs) se spustí aktivace B7 molekul a je indukována produkce indolamin-2,3-dioxygenázy. Výsledkem je lokální deplece tryptofanu, která negativně reguluje imunitní odpověď (17).

GITR (Glucocorticoid-induced tumour-necrosis factor receptor related protein) je exprimován na povrchu Treg, ale je také v různé míře přítomen na efektorových T buňkách a APCs. Zatím není znám přesný mechanismus jeho inhibičního působení, ale může negativně ovlivnit aktivaci buněk (4).

Dalším povrchovým znakem, využitelným pro detekci Treg je molekula CD127, αα-řetězec receptoru pro IL-7, kdy Treg jsou CD127^low populace a konvenční T buňky jsou CD127^high. Povrchová exprese CD127 zároveň negativně koreluje s Foxp3. CD127 se zdá být využitelná pro průkaz lidských Treg pro funkční studie a potenciální terapeutické využití (18).

Mechanismus působení

Přesný a univerzální mechanismus působení Treg je klíčovou otázkou, na kterou ale prozatím neznáme jednoznačnou odpověď. Existují čtyři hlavní možné varianty:

1. působení prostřednictvím sekrece inhibičních cytokinů,
2. cytolytické působení přímým kontaktem mezi efektorovou a supresorovou buňkou,
3. ovlivnění metabolismu cílové buňky, a 
4. ovlivnění prostřednictvím dendritických buněk (6).

Do první skupiny se řadí hlavní inhibiční cytokiny – interleukin 10 (IL-10), transformující růstový faktor beta (TGF-β). Jejich imunosupresní efekt byl mnohokrát prokázán v in vitro experimentech a i v mnoha in vivo modelech je nezpochybnitelný (19, 20), ale v případě Treg a ovlivnění efektivní protinádorové odpovědi je možné nalézt velké množství prací, které význam IL-10 a TGF-β zpochybňují a zdůrazňují význam těsného kontaktu mezi buňkami (21, 22, 23). V poslední době je zdůrazňován význam dalšího cytokinu s inhibiční aktivitou – interleukinu 35 (IL-35) (6).

Cytolytický mechanismus při přímém kontaktu buněk je zprostředkován zejména interakcí granzymu A, B a perforinu s molekulou CD18 (24). Tento mechanismus byl prokázán při ovlivnění funkce jak B lymfocytů, tak i NK buněk a cytotoxických T lymfocytů (25, 26).

Asi největší pozornost je v poslední době věnována mechanismu takzvané metabolické disrupce. Tento pojem zahrnuje konzumpci IL-2 (díky expresi CD25 a mnohonásobně vyšší afinitě IL-2 k tomuto receptoru), a tím snížení jeho lokální dostupnosti pro dělící se efektorové buňky. Dvě práce publikované v loňském roce se zaměřují na význam adenosinu pro funkci T regulačních lymfocytů. Bopp a spol. dokládá, že pro supresní funkci Treg je nutný mezibuněčný kontakt prostřednictvím „gap junction“ a transmembránového přenosu cAMP (cyklický adenosin monofosfát) do cílové T buňky (27). Deaglio a spol. naopak předpokládají význam dvou povrchově vázaných enzymů – CD73 – ecto-5-nukleotidázy, která je exprimovaná zároveň s CD39 – exonukleosid trifosfát difosfohydrolázou-1, které z extracelulárních nukleotidů produkují v bezprostředním okolí buňky vysokou koncentraci adenosinu. Adenosin se naváže na inhibiční A2A receptor aktivovaných efektorových T buněk (28).

Posledním možným mechanismem ovlivnění průběhu imunitní reakce je působení prostřednictvím dendritických buněk (DCs) a dalších antigen prezentujících buněk, které jsou nezbytné pro aktivaci efektivní T lymfocytární odpovědi. V tomto případě působí Treg inhibičně prostřednictvím vazby CTLA-4 na ko-stimulační molekuly CD80 nebo CD86 a produkcí indolamin-2,3-dioxygenázy (IDO). Tento enzym zvyšuje množství katabolitů tryptofanu, které opět inhibičně ovlivňují efektorové T buňky prostřednictvím pro-apoptotických signálů (29, 30).

Význam Treg

V minulosti probíhající studie byly limitovány nedostatkem znalostí o specifických povrchových znacích a nemožností definovat přesný mechanismus působení Treg. V současné době je známo množství povrchových i intracelulárních markerů, jejichž kombinace vede k velmi přesné selekci populace T lymfocytů s inhibičními účinky. To umožnilo odhalení významu Treg v patofyziologii mnohých onemocnění.

Bylo prokázáno, že pro vývoj Treg v thymu a pro expresi Foxp3 je klíčová signalizace zprostředkovaná transformačním růstovým faktorem beta (TGF-β) (31) a zároveň, že TGF-β ovlivňuje Treg v probhu kojení, a tím hraje zásadní roli při navození tolerance proti antigenům obsaženým v mateřském mléce. Tento fakt potvrzuje zásadní význam kojení pro prevenci vzniku budoucího alergického onemocnění (32).

V oblasti protinádorové imunologie bylo prokázáno, že vzestup hladiny Treg negativně ovlivňuje efektivní imunitní reakci proti nádorovým buňkám a koreluje s prognózou onkologicky nemocného pacienta. Zároveň bylo prokázáno, že Treg jsou hlavní překážkou pro imunoterapii a aktivní vakcinaci (33). Pokud porozumíme skutečnému mechanismu inhibičního působení regulačních T buněk, pak můžeme uvažovat o zlepšení dosavadních terapeutických výsledků. Velmi slibně vypadají studie, prokazující efekt adjuvantní vakcinace pacientů s pokročilými dlaždicobuněčnými karcinomy v oblasti hlavy a krku (HNSCC) (34).

Díky kombinaci chirurgie a radioterapie, zlepšení chirurgických technik, novým chemoterapeutickým režimům a zavedení „orgán zachovávajících terapeutických režimů”  se významně zlepšila kvalita života pacientů s HNSCC. Bohužel celkové přežití se za posledních 25 let příliš nezlepšilo (35). Změny tohoto trendu by mohlo být dosaženo odhalením nových molekulárních markerů, které by umožnily přesnější a zejména včasné odhalení onemocnění a odkrytí jeho biologického chování (36, 37, 38). Rozhodující pro budoucí průběh onemocnění se ukazuje být vztah mezi samotnými nádorovými buňkami, nádorovým mikroprostředím a buňkami imunitního systému (39–43).

U pacientů s HNSCC byly prokázány odchylky v mnoha parametrech imunitního systému. Změny rovnováhy, absolutního počtu i procentuálního zastoupení CD8⁺ i CD4⁺ lymfocytů jsou dokumentovány měsíce až roky po úspěšném ukončení onkologické terapie (44, 45). Počty NK buněk, jednoho z nejdůležitějších hráčů na poli přirozené protinádorové odpovědi, jsou snížené v periferní krvi, zároveň jejich funkční testy vykazují značné odchylky. Tento fakt koreluje s horší prognózou pacientů s HNSCC (12, 46).

Zvýšené hladiny B lymfocytů (CD19⁺) byly popsány v mikroprostředí epiteliálních karcinomů (47), ve studii probíhající na Klinice ORL a chirurgie hlavy a krku 1. LF UK bylo prokázáno statisticky významné snížení B lymfocytů v periferní krvi pacientů s metastázemi do krčních lymfatických uzlin (12).

Regulační T lymfocyty jsou v periferní krvi pacientů s HNSCC signifikantně zvýšené oproti zdravým kontrolám. To je v souladu s pracemi popisujícími situaci u jiných typů malignit (7, 10, 48–50).Ve výše zmíněné studii probíhající na pracovišti autora byla prokázána korelace zvýšeného počtu Treg v periferní krvi pacientů v době stanovení diagnózy a časnou recidivou onemocnění (v průběhu 1. roku od ukončení léčby), ne však s recidivou pozdější (12). Vysvětlením může být tlumení buněčné protinádorové imunity, která sice recidivu není schopna vždy zcela zlikvidovat, ale alespoň jí zbrzdí. Zároveň bylo prokázáno zvýšení procentuálního zastoupení Treg v lymfocytární populaci infiltrující samotný tumor (doposud nepublikováno).

Z dostupných dat je zřejmé, že vznik a progrese nádorového onemocnění ve vztahu k ovlivnění tohoto procesu imunitním systémem jsou klíčové otázky, jejichž zodpovězení nám umožní časnější diagnostiku a následný účinněji terapeutický zásah. Regulační T lymfocyty jsou klíčovou podskupinou hrající významnou roli v regulaci/ovlivnění nádorového procesu, a součástí rutinního onkologického terapeutického schématu možná jednou bude i léčba namířená proti těmto buňkám.

Jejich význam dokumentují i experimentální práce dokazující, že deplece Treg protilátkou zpomaluje růst nádoru a zvyšuje efekt protinádorové imunoterapie (51, 52). Jiná studie prokázala, že lymfocyty získané ze sleziny po depleci CD4⁺CD25⁺ indukovaly regresi experimentálních nádorů (53). Předpokládá se, že rezistence vůči IL-2 je vyvolána indukcí Treg a je předpoklad, že jejich deplece může efekt IL-2 potencovat (54). Tyto poznatky poskytují naději na získání dalšího prediktivního faktoru a rozšíření možností protinádorové imunoterapie.

Poděkování:

Práce byla podpořena IGA NR 8883–3, MSM 0021620813 a 1M0505, AV0Z50200510, GAUK č. 203435 36/06 a NPV 2B06106.

MUDr. Jan Bouček

Klinika otorhinolaryngologie a chirurgie hlavy a krku 1. LF UK

FN Motol

V Úvalu 84

150 06 Praha 5 – Motol

E-mail: Jan.Boucek@lf1.cuni.cz