Aktivace mikroglie a GFAP imunopozitivita astroglie u toxikomanů

Úvod:
Neurotoxicita vyvolaná aplikací omamných a psychotropních látek je provázena aktivací astroglie a mikroglie v mozku.

Skupina pacientů a metoda:
Klinicky bylo vyšetřeno 42 pacientů závislých na psychotropních a omamných látkách (hospitalizovaní ve FN Motol). U pacientů byly vyšetřeny koncentrace neuron specifické enolázy (NSE), S-100B proteinu a manganu v séru. U 14 zemřelých s průkazem drog ve vlasech svědčících pro chronický abusus návykových látek byla imunohistochemicky značena glie v mozkové tkáni protilátkami proti CD68 a kyselému proteinu astroglie (GFAP).

Výsledky:
U 8 hospitalizovaných pacientů byly vyšší hodnoty NSE a S-100B v séru (p < 0,05). Mangan v krvi byl vyšší (3,03±1,9 μg/l, p < 0,05) u všech pacientů (100 %). U zemřelých osob byla imunohistochemicky prokázána CD68 pozitivita mikroglie a neuronofagie. GFAP pozitivní astroglie byla prokázaná v šedé i bílé hmotě.

Závěr:
Patomorfologickým korelátem neurotoxicity u chronických uživatelů návykových látek může být CD68 a GFAP pozitivní glie v mozkové tkáni. U hospitalizovaných pacientů může být neurotoxicita monitorovaná markery poškození nervových buněk NSE a S-100B.

Klíčová slova:
neurotoxicita – mikroglie – astroglie – neuron specifická enoláza – S-100B protein

---

Neurotoxicita vyvolaná aplikací omamných a psychotropních látek (OPL) je v příčinné souvislosti s poškozením hematoencefalické bariéry BBB, provázené aktivací astroglie a aktivací mikroglie ve specifických oblastech mozku. Změny BBB byly popsány (1) v experimentu, kdy podání budivých aminů (methamphetaminu, MAP) vyvolalo patomorfologické změny neuronů, glie a endotelových buněk. Tyto změny byly spojené se zvýšenou propustností hemato-encefalické bariéry a s otokem mozku (2). Po aplikaci metamphetaminu byly pozorovány reaktivní astrocyty (imunohistochemicky pozitivní při značení s protilátkou proti kyselému proteinu astroglie, GFAP) v okolí nervových buněk a kapilár ve srovnání s několika GFAP pozitivními astrocyty u kontrolních zvířat. V experimentu se dále prokázalo, že v astroglii se zvyšuje syntéza mangan dependentní superoxid dismutasy (SOD-2), která se podílí na potlačení oxidačního stresu (3). Mangan je nezbytný pro funkci mitochondrialní Mn-superoxid dismutasy (SOD-2). U experimentální aplikace morfinu byla prokázána aktivace astroglie v mozku u myší. Potvrdilo se, že morfin aktivuje astroglii (4) a signifikantně zvyšuje počet mikroglií ve striatu. Na rozdíl od experimentu je u osob užívajících dlouhodobě OPL situace komplikovaná koincidencí zneužívání OPL a závažnými infekcemi, nejčastěji infekční hepatitidou či endokarditidou. Mezi základní patomorfologické změny u infekční hepatitidy je jaterní encefalopatie spojená se změnami astrocytů Alzheimerova typu II (5), kde astrocyty ztrácejí imunoreaktivitu pro GFAP ve srovnání s kontrolami (6).

CÍLE PRÁCE

Neurotoxicita může být klinicky monitorovaná koncentracemi NSE a S-100B proteinu v séru pacientů. Laboratorní výsledky mohou přispět k posouzení vážné poruchy zdraví jako celku v soudně-lékařské posudkové činnosti. U zemřelých osob umožňuje imunohistochemické vyšetření posoudit vliv chronického užívání drogy na nervový systém. Vyšetření OPL ve vlasech se využívá při průkazu dlouhodobého užívání návykových látek.

METODA

Skupina pacientů: Skupina 42 pacientů závislých na psychotropních a omamných látkách (hospitalizovaní ve FN Motol s potvrzeným zánětem jater). Skupina 14 zemřelých pacientů mimo zdravotnické zařízení s průkazem drog ve vlasech svědčících pro chronický abusus návykových látek. Průměrná doba zneužívání OPL (opiátů a budivých aminů), uváděná pacienty v dokumentaci, byla 8,8 roků, přičemž rozmezí bylo od 6 měsíců až do 21 let celkové doby užívání návykových látek. Údaj o četnosti aplikace OPL nebyl v dokumentaci uveden.

Laboratorní metody: Koncentrace NSE a S-100B v séru 42 hospitalizovaných pacientů byly změřeny na přístroji Roche Cobas e411, hladiny manganu byly měřeny spektrometricky (AAS). Mozková tkáň odebraná při pitvě 14 zemřelých osob byla vyšetřena imunohistochemicky s protilátkami proti CD68 a GFAP (Chemicon) technikou streptavidin-HRP-biotin s dobarvením di-amino-benzidinem. Přítomnost drogy v orgánech zemřelých osob byla potvrzena toxikologickým vyšetřením. Amfetaminy a opiáty byly extrahovány na pevné fázi (SPE kolonky). K derivatizaci opiátů bylo použito derivatizační činidlo N-methyl-N-trimethysilyltrifluoroacetamid a k derivatizaci amfetaminů použito derivatizační činidlo trifluoroacet-anhydrid. Pro posouzení dlouhodobého užívání návykových látek v delší době před smrtí byly u zemřelých odebrány vlasy v různé vzdálenosti od vlasového kořene a analyzovány na přítomnost drog v jednotlivých segmentech (7,8,9,10).

Statistické zpracování dat: Výsledné hodnoty byly statisticky zpracovány programem StatView, t-testem. Hodnoty koeficientu p<0,05 byly povážovány za statisticky významné.

Informovaný souhlas: U pacientů byl získán písemný souhlas s odběrem vzorků krve. U osob pitvaných na Ústavu soudního lékařství a toxikologie 1.LF UK a VFN byly vzorky tkání vyšetřeny pro diagnostické účely.

VÝSLEDKY

Zdravotní dokumentace osob zneužívajících omamné a psychotropní látky:

V souboru 42 pacientů bylo hospitalizováno 25 pacientů (59 %) se základní diagnozou akutní virové hepatitidy, s abscesem či flegmonou 6 pacientů (14 %), s infekční endokarditidou 3 pacienti (7 %), s diagnozou cirrhozy jater 2 pacienti (4 %) a 6 pacientů (16 %) s jinou dignozou (kupř. renální selhání při rhabdomyolýze, impetigo, pneumonie). V anamnéze byla uvedena další přidružená onemocnění (u 4 pacientů astma bronchiale, u jednoho pacienta hypertense a u jiného pseudomalatické cysty mozku). U 2 pacientů byla diagnostikovaná poúrazová epilepsie. U 9 pacientů byly prokázány vyšší hodnoty CRP v séru (v rozmezí 19,7 mg/l-273 mg/l) a hodnoty jaterních enzymů byly v referenčním rozmezí. U 12 pacientů byly naopak hodnoty CRP nízké a jaterní enzymy vyšší než horní referenční mez.

Biochemické hodnoty NSE, S-100B a manganu v krvi toxikomanů:

V souboru hospitalizovaných toxikomanů (n=42) jsme u 8 pacientů (19 %) prokázali vyšší hodnoty neurobiochemických markerů NSE a S-100B v séru (p< 0.05) v rozmezí od 15,88 do 35,38 μg/l u NSE a od 0,143 do 5,37 μg/l u S-100B proteinu. V celém souboru hospitalizovaných toxikomanů byly hodnoty manganu v krvi (3,03±1,9 μg/l, p< 0,05) u všech pacientů (100 %) vyšší než referenční rozmezí.

Imunohistochemický průkaz CD68 a GFAP pozitivních nervových buněk:

U zemřelých osob (bez exacerbace infekční hepatitidy) byla v kůře, podkorové bílé hmotě, bazálních gangliích a v mozkovém kmeni prokázána CD68 imunopozitivita mikroglie (obr.1) perivaskulárně i v okolí neuronů (obr.2). V některých zorných polích byla pozorovaná neuronofagie gangliových buněk, které byly obklopeny buňkami mikroglie barvených protilátkou proti-CD68. GFAP imunopozitivní astroglie byla prokazovaná v šedé i bílé hmotě; s dobře značenými výběžky i pozitivními astrogliálními perivaskulárními pochvami (obr.3). Výrazná GFAP imunopozitivita fibrilární astroglie byla pozorovaná v podkorové bílé hmotě. Imunohistochemické vyšetření prokázalo nakupení astroglie (obr.4). Výběžky astroglie byly v kontaktu s kapilárním řečištěm (astrogliální pochvy) i gliovými buňkami připomínající oligodendroglii. Ve světelné mikroskopii byly ve stejných vzorcích barvených hematoxilin-eosinem pozorovány extravazáty erytrocytů v okolí cév, satelitoza nebo bylo lékařem popsáno zmnožení glie.

DISKUZE

Hodnocení poruchy zdraví jako celku u osob zneužívajících OPL je ve forensní praxi zaměřeno na poškození orgánová (zejména srdce, plic, jater) a v posudkové činnosti i na změny funkční (změny krevního tlaku, příznaky psychiatrického onemocnění, deprese, halucinace apod.). Měření některých neurobiochemických markerů (NSE, S-100B) u pacientů s anamnezou zneužívání OPL by mohlo přispět nejen pro potřeby vypracování znaleckého posudku, ale i pro klinické hodnocení příznaků neurotoxicity při hodnocení poruchy zdraví postihující centrální nervový systém. Neurotoxicita u osob závislých na OPL byla mnohými autory vysvětlována poškozením hematoencefalické bariéry a aktivací astroglie a mikroglie ve specifických oblastech mozku (1,2) po aplikaci MAP ale i heroinu (4).

U zemřelých osob s anamnezou závislosti na OPL můžeme poškození jednotlivých oblastí nervového systému prokázat morfologickou analýzou procesu hojení v mozku a změnami ukazující na chronicitu toxického působení OPL na nervový systém. Za příznak dlouhodobého toxického působení OPL můžeme považovat známky aktivace astroglie a mikroglie, které probíhá s určitou latencí a vyžaduje podnět o určité intenzitě. V našem souboru zemřelých toxikomanů jsme pozorovali CD68 imunoreaktivitu mikroglie v okolí nervových buněk i perivaskulárně. Byla pozorována i neuronofagie gangliových buněk obklopených aktivovanou CD68 pozitivní mikroglií. V experimentu na krysách byly po aplikaci metamphetaminu popsány reaktivní astrocyty v okolí nervových buněk a kapilár ve srovnání s několika GFAP pozitivními astrocyty u kontrolních zvířat. V naší sestavě byly GFAP reaktivní astrocyty pozorované v basálních gangliích, v kůře i podkorové bílé hmotě. Subependymálně jsme nepozorovali výpadky astroglie, které by mohly být korelátem poškození liquorové bariéry (2). Astrogliální perivaskulární výběžky se dobře značily protilátkou proti-GFAP.

V klinické praxi je u toxikomanů situace komplikovaná koincidencí užívání OPL a závažnými infekcemi, nejčastěji infekční hepatitidou či endokarditidou. Neurotoxicita u toxikomanů s infekční hepatitidou se také vysvětluje změnami hematoencefalické bariéry mozku (2), avšak v našem souboru nebyla signifikantní korelace mezi hodnotami neurobiochemických markerů (NSE a S-100B) a elevací jaterních enzymů.

ZÁVĚR

CD68 a GFAP imunohistochemickou pozitivitu glie v mozkové tkáni můžeme považovat za patomorfologický korelát neurotoxicity u chronických uživatelů návykových látek. U hospitalizovaných pacientů může být k monitorování neurotoxicity využíváno biochemické stanovení markerů poškození neuronů a astroglie (NSE a S-100B).