Vlastnosti kmenů Staphylococcus aureus u pracovníků potravinářských podniků

Cíl práce:

Pracovníci potravinářských podniků mohou představovat rezervoár virulentních kmenů Staphylococcus aureus a podílet se na jejich šíření do potravin. Cílem této studie bylo posoudit výskyt a vlastnosti S. aureus u pracovníků sýráren.

Materiál a metody:

Byly testovány stěry rukou a výtěry z krku pracovníků tří různých sýráren. Získané izoláty byly charakterizovány na základě faktorů virulence, rezistence k antimikrobikům, spa typizace a makrorestrikční analýzy.

Výsledky:

S. aureus byl prokázán u 58 % stěrů (7/12) rukou pracovníků a u 47 % vzorků (17/36) výtěrů krku. V krku ani na rukou potravinářů nebyl prokázán výskyt meticilin-rezistentních S. aureus. U pracovníků všech tří provozoven byl prokázán výskyt kmenů s geny zodpovědnými za produkci enterotoxinů (58 %) a toxinu syndromu toxického šoku (25 %). U jednoho kmene izolovaného z výtěru z krku byl detekován gen zodpovědný za produkci exfoliatinu A. Klonální shoda mezi kmeny S. aureus izolovanými současně z krku a rukou pracovníků nebyla prokázána, což ukazuje na možnou kontaminaci rukou pracovníků z výrobního prostředí.

Závěr:

Dodržování hygienických pravidel (pravidelné mytí a dezinfekce rukou, prostředí, používání rukavic, roušek) je nezbytným nástrojem umožňujícím snižování nebezpečí šíření S. aureus prostřednictvím pracovníků potravinářských podniků.

Klíčová slova:

stafylokokové enterotoxiny – spa typizace – makrorestrikční analýza – faktory virulence

ÚVOD

Staphylococcus aureus je častou příčinou komunitních i nemocničních infekcí a je také významným bakteriálním druhem v oblasti potravinářské mikrobiologie. S. aureus nejčastěji osidluje dutinu nosní (přibližně u 27 % populace). V krku se uvádí výskyt u 10 % a na rukou u 27 % lidí. Přibližně 20 % osob představuje perzistentní nosiče S. aureus v dutině nosní, což zvyšuje riziko infekce tímto patogenem [1]. S. aureus se může podílet na vzniku různých onemocnění (např. stafylokokové enterotoxikózy, pneumonie, infekce kůže) v důsledku produkce stafylokokových enterotoxinů, toxinu syndromu toxického šoku (TSST-1), Pantonova-Valentinova leukocidnu (PVL) či exfoliativních toxinů [2].

Z doposud popsaných 23 stafylokokových enterotoxinů, se na vzniku enterotoxikózy podílejí zejména takzvané klasické enterotoxiny A, B, C, D a E [3] a ojediněle i enterotoxin H, G nebo I [4]. Pracovníci potravinářských podniků jsou významným rizikovým faktorem přispívajícím k rozvoji stafylokokových enterotoxikóz. Mohou se podílet na kontaminaci potravin prostřednitcvím rukou nebo respirační sekrecí [5, 6, 7].

S ohledem na rostoucí antimikrobiální rezistenci je důležité rovněž sledování výskytu MRSA nejen u potravinových izolátů, ale také u potravinářů, kteří přispívají ke křížové kontaminaci potravin. U zdravých osob z devíti evropských zemí (Rakouska, Belgie, Řecka, Francie, Maďarska, Španělska, Švédska, Nizozemí a Spojeného království) se v provedené studii prevalence MRSA pohybovala od nuly ve Švédsku po 2,1 % v Belgii [8]. Výskyt MRSA u pracovníků potravinářských podniků je obvykle nízký [6, 9, 10].

Typizace S. aureus může pomoci v prevenci a kontrole infekcí vyvolaných S. aureus, stejně jako při vyšetřování možných zdrojů enterotoxikóz. Spa typizace je efektivní a rychlá metoda k rozlišení izolátů S. aureus. Přestože výsledky spa typizace a PFGE obvykle vykazují shodu, PFGE se vyznačuje vyšší rozlišovací schopností [11]. Kombinace detekce stafylokových enterotoxinů a PFGE je vhodným nástrojem pro potvrzení či vyloučení potravinářů na vzniku epidemií enterotoxikóz [12].

Cílem této práce bylo posoudit výskyt virulentních kmenů S. aureus u pracovníků sýráren s ohledem na bezpečnost finálních výrobků.

MATERIÁL A METODIKA

Testované vzorky

Celkem bylo vyšetřeno 48 vzorků odebraných u tří různých provozovatelů potravinářských podniků vyrábějících sýry, lokalizovaných ve třech okresech České republiky. V sýrárně označené A bylo odebráno a vyšetřeno 18 vzorků výtěrů z krku, v sýrárně B bylo vyšetřeno 16 vzorků (7 výtěrů z krku, 9 stěrů z rukou), v sýrárně C bylo vyšetřeno 14 vzorků (11 výtěrů z krku, 3 stěry z rukou).

Průkaz Staphylococcus aureus

Průkaz S. aureus byl proveden pomnožením vzorku v pufrované peptonové vodě po dobu 18–24 hodin při 37 °C s následným vyočkováním na medium Baird Parker (Oxoid, UK). Suspektní kolonie na Baird-Parker agaru byly identifikovány metodou hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF MS (matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry, Bruker Daltonik GmbH, Německo).

Charakterizace izolátů S. aureus

Všechny izoláty určené jako S. aureus byly metodou PCR testovány na přítomnost genu mecA zodpovědného za rezistenci k meticilinu [13]. Rezistence S. aureus k antimikrobikům byla testována za použití diskové difuzní metody k následujícím látkám: oxacilin (1 µg), klindamycin (2 µg), erytromycin (15 µg), sulfometoxazol s trimetoprimem (25 µg), amoxycilin s kyselinou klavulanovou (20/10 µg), gentamicin (10 µg), tetracyklin (30 µg), chloramfenikol (30 µg), cefotaxim (30 µg), ciprofloxacin (5 µg), cefoxitin (30 µg), rifampicin (5 µg), teikoplanin (30 µg). Výsledky byly interpretovány podle kritérií CLSI [14].

Charakteristika získaných izolátů S. aureus byla provedena na základě polymerázové řetězové reakce (PCR) detekcí genů sea až sej kódujících příslušné enterotoxiny [15, 16], genu tst kódujícího toxin syndromu toxického šoku [17], genu pvl kódujícího Pantonův-Valentinův leukocidin

[18] a dále genů eta a etb kódujících exfoliatiny typu ETA a ETB [19]. Klonální shoda mezi kmeny byla testována metodou makrorestrikční analýzy s využitím endonukleázy SmaI s následnou pulzní gelovou elektroforézou [20]. U všech kmenů byla provedena také spa typizace [21]. Kmeny (5) u kterých byl prokázán nový spa typ byly typizovány rovněž na základě MLST (multilocus sequence typing) [22].

VÝSLEDKY A DISKUSE

S. aureus byl prokázán u 50 % (24/48) testovaných vzorků odebraných u pracovníků tří různých sýráren. Ze stěru rukou pracovníků byl S. aureus prokázán u 58 % vzorků (7/12) a z výtěrů krku u 47 % vzorků (17/36). Výskyt S. aureus byl u pracovníků sýrárny A (61 %, 11/18) a sýrárny B 
(56 %, 9/16) srovnatelný. U pracovníků sýrárny C byl S. aureus detekován v menší míře, u 29 % testovaných vzorků (4/14). Meticilin rezistentní S. aureus (MRSA) nebyl zjištěn u žádného z testovaných vzorků. S výjimkou jednoho kmene rezistentního k erytromycinu byly ostatní kmeny S. aureus citlivé k celému spektru testovaných antimikrobiálních látek. V portugalské studii, byla naopak prokázána rezistence nejméně k jednomu z testovaných antibiotik u 82 % S. aureus izolovaných u potravinářů, ale u žádného kmene nebyla prokázána rezistence k meticilinu a přítomnost mecA genu. Kromě vysoké míry rezistence k penicilinu (48 %), byla v uvedené studii na rozdíl od naší práce zjištěna častá rezistence k erytromycinu (32 %) a ciprofloxacinu (20%) [6].

Výskyt S. aureus u pracovníků potravinářských podniků, včetně kmenů s potenciálem vyvolat stafylokokovou enterotoxikózu není neobvyklý, jak dokazují výsledky řady zahraničních studií. V argentinské studii byl S. aureus prokázán u 37,5 % potravinářů, 14,7 % z nich neslo enterotoxigenní kmeny, u čtyř kmenů byla prokázána rezistence k meticilinu [23]. V Egyptě byl S. aureus detekován u 17 % vzorků stěrů z rukou pracovníků ve studii zaměřené na sledování toxigenních kmenů S. aureus v mléce, sýrech a u pracovníků, kteří s nimi manipulují. Gen seb neslo 31 % získaných izolátů S. aureus [24]. Aung et al. [10] prokázali S. aureus u 19,5 % potravinářů v Myanmaru (Barma). Kromě genů pro enterotoxiny byla v uvedené studii prokázána i relativně vysoká míra výskytu kmenů nesoucích gen pvl (12,5 %). Stejně tak v Evropě je popisován výskyt toxigenních kmenů S. aureus u pracovníků potravinářských podniků, včetně jejich podílu na vzniku epidemických případů stafylokových enterotoxikóz [5, 12].

V této studii více jak polovina získaných kmenů S. aureus (14/24) nesla geny kódující produkci enterotoxinů. Nejčastěji byly zjištěny kmeny nesoucí gen seg (37,5 %; 9/24) a sei (20,8 %; 5/24). V sýrárně B byl u tří kmenů izolovaných ze stěrů rukou prokázán gen sec a u dvou kmenů z výtěrů krku pracovníků gen sed. V sýrárně A byly u kmenů z výtěrů krku zjištěny kmeny s geny sea (2) a seb (1). U pracovníků sýrárny C nebyly prokázány kmeny S. aureus nesoucí geny spojované se vznikem enterotoxikóz. U jednoho kmene z výtěru z krku však byl detekován gen kódující produkci exfoliatinu A. Kromě genů kódujících enterotoxiny byly u pracovníků všech sledovaných sýráren prokázány kmeny (5) s genem tst zodpovědným za produkci TSST-1 (tab. 1). Gen pvl kódující Pantonův--Valentinův leukocidin a gen etb související s produkcí exfoliatinu B nebyly zjištěny u žádného z testovaných kmenů S. aureus. Rovněž v portugalské studii byly u potravinářů zjištěny zejména kmeny S. aureus s geny seg (82,6 %) a sei (70%) a vysoký podíl kmenů nesoucích gen spojovaný s produkcí TSST-1. Gen tst neslo 39,1 % kmenů z nosu a 40 % z rukou [6]. Výskyt genu tst u pracovníků potravinářských podniků byl prokázán i v  dalších studiích [5, 10].

Na základě typizace byla mezi kmeny S. aureus zjištěna vysoká heterogenita, jak u pracovníků z různých sýráren, tak v rámci stejného výrobního provozu. Testované kmeny byly zařazeny k 20 různým spa typům a 23 pulzotypům (viz tab. 1). Nejčastějším spa typem byl t056, který byl zjištěn u kmenů (4) izolovaných od pracovníků všech tří sýráren. Metodou makrorestrikční analýzy byly testované kmeny spa typu t056 zařazeny ke třem různým pulzotypům označeným Sa-Sma-57, Sa-Sma-58 a Sa-Sma-64a. V jednom případě byly prokázány dva kmeny S. aureus spa typu t056 s identickým pulzotypem (Sa-Sma-57) izolované z výtěru krku pracovníka sýrárny A (SAV311) a současně stěru ruky pracovníka sýrárny C (SAV1264) – obrázek 1. Dva kmeny S. aureus izolované z výtěru krku dvou různých pracovníků sýrárny A byly zařazeny ke spa typu t122. Oba kmeny nesly geny kódující produkci enterotoxinu A a G, a dále gen pro produkci TSST-1. Výsledky makrorestrikční analýzy však ukázaly, že tyto kmeny patřily ke dvěma různým pulzotypům (viz tab. 1 a obr. 1). Na základě porovnání s doposud popsanými spa typy byly u pěti kmenů detekovány nové typy repetic v oblasti genu pro protein A. Nově detekované spa typy (5) byly na základě MLST zařazeny k sekvenačnímu typu ST5, ST12, ST34, ST45, ale také ke zcela novému MLST typu, kterému bylo přiděleno označení ST4700.

Výsledky studie nepotvrdily klonální shodu mezi kmeny S. aureus izolovanými současně z krku a rukou pracovníků, což poukazuje na možnou kontaminaci rukou pracovníků z výrobního prostředí. Tento fakt potvrzuje nález kmene pulzotypu Sa-Sma-58 nesoucího geny sec a tst ve zpracovávaných surovinách a na plochách výrobního zařízení v sýrárně B v roce 2017 [25]. Přítomnost toxigenních kmenů S. aureus ve stěrech krku potravinářů by naopak mohla vést ke kontaminaci výrobního prostředí a potravin. Ho et al. [7] ve své studii prokázal, že ke kontaminaci rukou zpracovatelů potravin přispívaly nazální izoláty perzistentně kolonizovaných spolupracovníků. U perzistentních nosičů, kteří pravděpodobně kontaminovali prostředí, byly zjištěny identické kmeny v jejich nose i na rukou. Podobně Castro et al. [6] prokázali u 6,2 % testovaných osob kmeny S. aureus v nose i na rukou pracovníku a u tří z nich byla prokázána klonální shoda.

ZÁVĚR

Výsledky potvrdily význam potravinářů jako potenciálního zdroje toxigenních kmenů S. aureus v potravinářských podnicích. U pracovníků všech tří sledovaných sýráren byly prokázány nejen kmeny nesoucí geny podílející na vzniku stafylokokových enterotoxikóz, ale také gen kódující toxin syndromu toxického šoku, a to jak na rukou, tak ve výtěrech z krku. Na základě sekvenačních metod a makrorestrikční analýzy byla mezi testovanými kmeny S. aureus prokázána vysoká diverzita. Pro potvrzení pracovníků potravinářských provozů jako možného zdroje kontaminace potravin by měla být detekce genů kódujících enterotoxiny doplněna také o výsledky makrorestrikční analýzy.

Poděkování

Práce vznikla za finanční podpory projektu NAZV MZe QK1710156 a projektu CZ.1.05./2.1.00/19.0385.

Do redakce došlo dne 4. 7. 2018.

Adresa pro korespondenci:

doc. MVDr. Renáta Karpíšková, Ph.D.

Výzkumný ústav veterinárního lékařství

Hudcova 70

621 00 Brno

e-mail: karpiskova@vri.cz