Diverzita humánních izolátů salmonel v Jihomoravském kraji v letech 2009–2012
Authors:
P. Myšková; R. Karpíšková
Authors‘ workplace:
Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v. v. i., Brno
Published in:
Epidemiol. Mikrobiol. Imunol. 63, 2014, č. 2, s. 116-120
Category:
Review articles, original papers, case report
Overview
Cíl práce:
Cílem této studie bylo určit diverzitu humánních izolátů salmonel v jednom z krajů České republiky v časovém horizontu čtyř let pomocí různých typizačních metod.
Materiál a metody:
Z fenotypových metod byla použita sérotypizace, fágová typizace a disková difuzní metoda ke stanovení rezistence k antimikrobiálním látkám. Z genotypových metod pak makrorestrikční analýza a pulzní gelová elektroforéza (PFGE).
Výsledky:
Jako nejčastější sérotyp humánních případů salmonelóz v Jihomoravském kraji byly detekovány Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimuriuma monofazická Salmonella 4,[5],12:i:-. Fágová typizace odhalila dominanci fágového typu 8 u S. Enteritidis a změny ve výskytu fágových typů u S. Typhimurium v průběhu let. Míra rezistence u S. Typhimurium, monofazické salmonely a některých ostatních sérotypů naznačuje vzrůstající problém multirezistentních kmenů jako patogenů člověka. V průběhu studie byly odhaleny izoláty patřící do lokálních i nadnárodních epidemií. Taktéž byly detekovány izoláty sérotypu 9,12:l,v:-, který byl na území České republiky detekován vůbec poprvé.
Závěry:
Variabilita izolátů získaných ve studii provedené v letech 2009–2012 v Jihomoravském kraji naznačuje, že heterogenita zdrojů humánních salmonelóz je poměrně velká. Nicméně odhalení několika případů s možnou epidemickou souvislostí ukazuje na důležitost provádění pečlivé typizace humánních izolátů a jejich porovnání s kmeny non-humánního původu. Zvýšená míra rezistence u některých sérotypů dokazuje nezbytnost monitorování situace v oblasti výskytu multirezistentních kmenů.
Klíčová slova:
Salmonella – antimikrobiální rezistence – typizace
ÚVOD
Salmonelózy (non-tyfoidní) jsou v České republice druhým nejčastějším bakteriálním onemocněním s alimentární cestou přenosu [1]. I přes výrazný pokles v počtech hlášených onemocnění patří Česká republika k zemím s nejvyšší incidencí salmonelóz v celé Evropské unii [2]. Vznik onemocnění je spojován s konzumací nedostatečně tepelně upravených potravin živočišného původu, především pak drůbežího masa, vajec a výrobků z nich a vepřového masa. V posledních letech se také diskutuje o přenosu potravinami rostlinného původu, které mohou být sekundárně kontaminovány na různých stupních pěstitelského a zpracovatelského procesu [2].
V České republice je dlouhodobě nejhojněji hlášeným sérotypem Salmonella enterica subsp. enterica sérotyp Enteritidis. Následují sérotypy Typhimurium a monofazický sérotyp Salmonella 4,[5],12:i:-, který byl popsán v 90. letech minulého století a nyní je pandemicky rozšířen [3]. Při typizaci epidemických kmenů zmíněných tří nejčetnějších sérotypů se v České republice využívá fágová typizace, metody na principu PCR a makrorestrikční analýza. A právě ta, jež je považována za zlatý standard v typizaci salmonel, má někdy nižší diskriminační schopnost než rychlá a levná metoda fágové typizace [4].
Závažným problémem baktérií čeledi Enterobacteriaceae, kam patří také zástupci rodu Salmonella, je zvyšující se výskyt kmenů rezistentních k více než třem skupinám antimikrobiálních látek. V nedávné době prováděné studie ukazují zvyšující se rezistenci u izolátů rodu Salmonella [5, 6]. Problémem je především výskyt kmenů produkujících širokospektré beta-laktamázy typu ESBL a kmenů rezistentních k fluorochinolonům, protože právě ty jsou často používány k léčbě komplikovaných salmonelových infekcí [7].
V letech 2009–2012 probíhal v naší laboratoři sběr humánních izolátů rodu Salmonella a jejich následná typizace. Cílem studie bylo sledování četnosti výskytu sérotypů salmonel, fágových typů u sérotypů Enteritidis a Typhimurium včetně monofazické varianty a rezistence salmonel k antimikrobiálním látkám.
MATERIÁL A METODY
Celkem bylo během daného období do naší laboratoře doručeno 688 suspektních kmenů salmonel. Kmeny pocházely ze tří klinických laboratoří na území Jihomoravského kraje.
Přijaté kmeny byly z transportních médií vyočkovány na půdy BGA (Oxoid, UK) a v případě potřeby na Rambach agar (Merck, Německo). U několika izolátů, které nerostly na chromogenním médiu v koloniích typické morfologie, byla prokazována náležitost k rodu Salmonella rodově specifickou metodou PCR [8]. Sérotyp byl ověřován metodu sklíčkové aglutinace se somatickými a bičíkovými antiséry (Denka Seiken, Japonsko a BioRad, Francie). U kmenů s určenými sérotypy Enteritidis, Typhimurium a 4,[5],12:i:- byla provedena fágová typizace podle protokolu HPA Colindale Londýn [9, 10]. U suspektních kmenů sérotypu Typhimurium, které nevykazovaly reakce se základní sadou fágů, byla použita i přídatná sada fágů a prověřena přítomnost genu druhé bičíkové fáze fljB [10, 11]. U kmenů sérotypů Typhimurium, 4,[5],12:i:-, vybraných izolátů Enteritidis a ostatních sérotypů, bylo provedeno stanovení rezistence k antimikrobiálním látkám diskovou difuzní metodou s vyhodnocením rezistence podle standardů CLSI a použitím antibiotických disků Oxoid (počet analyzovaných kmenů n = 1 75) [12]. Spektrum testovaných látek bylo následující: A – ampicilin (10 µg), AMC – ampicilin/kyselina klavulanová (30 µg), CTX – cefotaxim (30 µg), C – chloramfenikol (30 µg), S – streptomycin (10 µg), K – kanamycin (30 µg), CN – gentamicin (10 µg), N – neomycin (30 µg), APR – apramycin (15 µg), SU – složené sulfonamidy (300 µg), SXT – sulfamethoxazol/trimethoprim (25 µg), W – trimethoprim (5 µg), TE – tetracyklin (30 µg), NA – nalidixová kyselina (30 µg), CIP – ciprofloxacin (5 µg), ENR – enrofloxacin (5 µg), CT – kolistin (10 µg).
Makrorestrikční analýza byla provedena u kmenů méně častých sérotypů s možnou epidemickou souvislostí. Analýza byla provedena pomocí pulsní gelové elektroforézy (PFGE) podle protokolu PulseNet a vyhodnocena pomocí softwaru BioNumerics verze 5.1. [13]
VÝSLEDKY
Celkem bylo během daného období do naší laboratoře doručeno 688 kmenů suspektních salmonel, u 5 kmenů byla prokázána příslušnost k jinému rodu. Získaný soubor izolátů salmonel tvořil každý rok od 12 do 16 % všech humánních izolátů hlášených z Jihomoravského kraje. Počty izolátů salmonel přijatých k typizaci v jednotlivých letech jsou zobrazeny v grafu 1.
Sérotypizace
Celkem jsme ve sledovaném souboru detekovali 28 různých sérotypů salmonel. Četnost sérotypů v procentech je uvedena v tabulce 1 a počty sérotypů jiných než Enteritidis, Typhimurium a monofazické 4,[5],12:i:- jsou sumarizovány v tabulce 2.
Fágová typizace
U 493 kmenů sérotypu Enteritidis, 97 kmenů sérotypu Typhimurium a 22 kmenů sérotypu 4,[5],12:i:- byla provedena fágová typizace. Nejčetnějšími fágovými typy u S. Enteritidis byly PT8, PT21c, PT4b, PT13a, PT6c (graf 2). Také byl evidován výskyt pro Českou republiku vzácnějšího fágového typu PT3. Celkem bylo během sledované doby detekováno 25 různých fágových typů. U S. Typhimurium pak mezi nejčetnější patřily fágové typy DT104, DT141, DT120, DT193 (graf 3). Celkem bylo detekováno 13 různých fágových typů. U monofazické varianty dominoval fágový typ DT193, byl potvrzen u více než 90 % všech kmenů tohoto sérotypu.
Rezistence k antimikrobiálním látkám
U 175 kmenů byl proveden test rezistence k antimikrobiálním látkám. V grafu 4 je znázorněna míra rezistence u vybraných izolátů podle sérotypů, graf 5 zobrazuje rezistenci kmenů salmonel podle jednotlivých antimikrobiálních látek.
Makrorestrikční analýza a PFGE
Vybrané salmonely vzácně se vyskytujících sérotypů byly analyzovány metodou makrorestrikční analýzy. Detekované pulsní profily byly porovnány programem BioNumerics a jsou uvedeny v tabulce 3.
DISKUSE
V letech 2009–2012 jsme v naší laboratoři typizovali 683 humánních kmenů salmonel z Jihomoravského kraje. V souladu s celorepublikovými daty byla zjištěna stálá dominance sérotypu Enteritidis [1], v průběhu sledovaného období však byl zaznamenán postupný pokles výskytu tohoto sérotypu z původních 73 % na 56,6 %. Tento pokles může být způsoben pozitivními změnami v chovech nosnic, souvisejícími s národním ozdravným programem probíhajícím od roku 2009 [14]. Zaznamenaný vzestupný trend v četnosti výskytu ostatních sérotypů může být způsoben tím, že se v šíření salmonel stále více uplatňuje jako vehikulum salmonelových infekcí vedle vajec i drůbeží maso. A právě v chovech brojlerů je popisováno širší spektrum sérotypů salmonel než u nosnic [2].
Sérotyp Typhimurium si v průběhu sledovaných let udržel zhruba stejnou četnost, u jeho monofazické varianty 4,[5],12:i:- došlo podle očekávání, zřejmě zejména díky zlepšení diagnostiky, k postupnému nárůstu v četnosti.
Mezi 28 detekovanými sérotypy, byly i takové, jenž byly spojené s lokálními (9,12:l,v:-, Mikawasima) i nadnárodními epidemiemi (Urbana, Stanley) [15, 16]. Sérotyp 9,12:l,v:- byl v na území České republiky detekován vůbec poprvé, a to v roce 2011 [17].
Zajímavý je také výskyt sérotypu defektního v první bičíkové fázi S. 6,7:-:1,5. Ve stejných letech byl tento sérotyp několikrát detekován u prasat (laboratorní data). Otázkou je, zda bude časem stejně úspěšný jako monofazická S. 4,[5],12:i:-, která je taktéž spojována s chovy prasat [18]. Fágová typizace u sérotypu Enteritidis potvrdila i po letech výsledky studie z roku 2008, a to, že PT8 je stále nejhojněji se vyskytujícím fágovým typem na našem území [19]. Ovšem v roce 2012 došlo i u něj ke snížení četnosti a naopak zvýšení četnosti fágových typů PT21c, PT14b a PT6c.
Naproti tomu u sérotypu Typhimurium došlo k poměrně dramatické proměně výskytu jednotlivých fágových typů v průběhu let. V letech 2009 a 2010 dominoval k antimikrobiálním látkám citlivý fágový typ DT141, který se v 90. letech minulého století podílel na jedné z největších salmonelových epidemií v České republice a který byl potvrzen také v uzených makrelách zpracovaných v potravinářském podniku v Jihomoravském kraji, jenž byly vehikulem této nákazy. Posléze tento fágový typ zcela vymizel a byl nahrazen většinou multirezistentním fágovým typem DT104. Tento typ se na našem území i v zahraničí vyskytoval v 90. letech 20. století, nicméně v poslední době je také na ústupu [20].
U monofazické salmonely 4,[5],12:i:- se výrazná dominance fágového typu DT193 v průběhu let neměnila.
Jak vyplývá z testování rezistence k antimikrobiálním látkám, tak i u rodu Salmonella dochází ke zvyšování míry rezistence, což potvrzuje i nedávná studie autorů Žemličková et al. [21]. Nicméně je potřeba rezistence k antimikrobiálním látkám posuzovat u jednotlivých sérotypů odděleně, protože u sérotypu Enteritidis jsou rezistence k antimikrobiálním látkám vzácné, kdežto u sérotypů Typhimurium a monofazické 4,[5],12:i:- je multirezistence běžným jevem. Z grafu 3 je znatelné, že typickou kombinací rezistencí je tetrarezistence ASSuTe (monofazické kmeny) a pentarezistence ACSSuTe (Typhimurium DT104). Nicméně jsme mohli pozorovat i zvýšení počtu kmenů rezistentních ke kyselině nalidixové, a to především u sérotypu Infantis, jehož výskyt je opět spojen s chovy drůbeže. Gen rezistence k chinolonům může být nesen na plasmidu, tudíž může snadno docházet k jeho horizontálnímu šíření mezi dalšími střevními bakteriemi, zejména z čeledi Enterobacteriaceae [22, 23].
Pulsní gelová elektroforéza byla použita u kmenů, které vykazovaly pravděpodobnou epidemickou souvislost. Pomocí této metody byly v roce 2012 odhaleny v Jihomoravském kraji tři lokální epidemie způsobené vzácnými sérotypy Mikawasima, Indiana a monofazickou variantou S. 9,12:l,v:-. Izoláty těchto sérotypů byly v roce 2012 získány také z non-humánních zdrojů (laboratorní data). U sérotypu Mikawasima byly ovšem u humánních izolátů odhaleny dva různé pulsní profily, což naznačuje, že se na našem území vyskytly minimálně dvě klonální linie. Celoevropská epidemie způsobená sérotypem Stanley se taktéž dotkla České republiky. V rámci této studie bylo typizováno 5 izolátů S. Stanley humánního původu. Jejich antibiotický i pulsní profil tyto izoláty taktéž přiřadil k probíhající epidemii. Vzhledem k tomu, že ve stejném roce jsme v naší laboratoři také typizovali izoláty sérotypu Stanley non-humánního původu se stejným pulsním profilem, je jasné, že tento sérotyp pronikl do potravního řetězce v České republice a je otázkou, zda dojde k jeho vymizení nebo se stane běžně detekovaným sérotypem. Pulsní profil S. Urbana byl také zkoumán na základě možné souvislosti s nadnárodní epidemií, která se nakonec ukázala jako skutečná [15].
ZÁVĚR
V této studii bylo v průběhu let 2009–2012 typizováno 683 humánních kmenů salmonel pocházejících z Jihomoravského kraje. Dvacet osm detekovaných sérotypů ukazuje na poměrně velkou heterogenitu v rámci rodu Salmonella a také na různé cesty přenosu. Salmonella Enteritidis je stále dominujícím sérotypem, přestože jeho podíl v posledních letech klesá. Následuje sérotyp Typhimurium a jeho monofazická varianta. Fágová typizace ukázala některé změny v trendech ve zkoumaném časovém období, především u sérotypu Typhimurium, u kterého došlo k úspěšnému rozšíření multirezistentního fágového typu DT104 a v poslední době opět k poklesu jeho výskytu. Vysoké procento multirezistentních kmenů u sérotypů Typhimurium a 4,[5],12:i:- poukazuje na nutnost obezřetného přístupu při používání antimikrobiálních látek. Odhalení tří lokálních epidemií zdůrazňuje užitečnost pečlivé typizace kmenů a nutnost spolupráce rutinních mikrobiologických laboratoří s epidemiology.
Poděkování: Studie byla finančně podpořena projektem AdmireVet CZ.1.05/2.1.00/01.0006 a MZE0002716202.
Na tomto místě bychom rádi poděkovali RNDr. Evě Pakrové Plíškové a Mgr. Kateřině Manové z firmy IFCOR-99 a Mgr. Martinu Vrbovi z FN Bohunice za poskytování kmenů. Bez jejich spolupráce by tuto studii nebylo možné uskutečnit.
Do redakce došlo dne 20. 12. 2013.
Adresa pro korespondenci:
Mgr. Petra Myšková
Výzkumný ústav veterinárního lékařství
Hudcova 70
6210 00 Brno
e-mail: myskova@vri.cz
Sources
1. Infekce v ČR – EPIDAT [online]. [cit. 2013-10-12]. Dostupný na www: http://www.szu.cz/publikace/data/infekce-v-cr.
2. The European Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2010[online]. 2012-03-08[cit. 2013-10-12]. Dostupné na www: <http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/doc/2597.pdf>.
3. Hopkins KL, Kirchner M, Guerra B, Granier SA, Lucarelli C et al. Multiresistant Salmonella enterica serovar 4,[5], 12:i:- in Europe: a new pandemic strain? Eurosurveill, 2010, 22, 15, pii=19580. Dostupné na: http://www.eurosurveillance.org/ViewArticle.aspx?ArticleId=19580.
4. Myšková P, Karpíšková R, Dědičová D. Epidemické případy salmonelóz v České republice v roce 2012. Epidemiol Mikrobiol Imunol, 2013;62(2):59–63.
5. Soufi L, Saenz Y, de Toro M, Abbassi MS, Rojo-Bezares B et al. Phenotypic and genotypic characterization of Salmonella enterica recovered from poultry meat in Tunisia and identification of new genetic traits. Vector Borne Zoonotic Dis, 2012;12(1):10–16.
6. Yan H, Li L, Alam MJ, Shinoda S, Miyoshi S et al. Prevalence and antimicrobial resistance of Salmonella in retail foods in northern China. Int J Food Microbiol, 2010;143(3):230–234.
7. Chiu CH, Su LH, Chu C. Salmonella enterica serotype Choleraesuis: Epidemiology, pathogenesis clinical disease and treatment. Clin Microbiol Rev, 2004;17:311–322.
8. Olsen JE, Aabo S, Hill W, Notermans S, Wernars K et al. Probes and polymerase chain reaction for detection of food-borne bacterial pathogens. Int J Food Microbiol, 1995;28(1):1–78.
9. Ward LR, de Sa JDH, Rowe B. A phage-typing scheme for Salmonella enteritidis. Epidemiol Infect, 1987;291–294.
10. Anderson ES, Ward LR, de Saxe MJ, de Sa JD. Bacteriophage typing designations of Salmonella typhimurium. J Hyg, 1977;78(2):297–300.
11. McQuiston JR, Parrenas R, Ortiz-Rivera M, Gheesling H, Brenner F et al. Sequencing and comparative analysis of flagellin genes fliC, fljB, and flpA from Salmonella. J Clin Microbiol, 2004;42: 1923–1932.
12. Clinical and Laboratory Standard Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty two informational supplement. CLSI Document M100-S22, Clinical and Laboratory Standards Institute, USA, Pennsylvania, 2012.
13 Ribot EM, Fair MA, Gautom R, Cameron DN, Hunter SB et al. Standardization of pulsed-field gel electrophoresis protocols for the subtyping of Escherichia coli O157:H7, Salmonella and Shigella for PulseNet. Foodborne Pathog Dis, 2006;3:59–67.
14. Program tlumení výskytu salmonel. [online]. [cit. 2013-10-12]. Dostupné na www: http://eagri.cz/public/web/svs/portal/zdravi-zvirat/programy-tlumeni-vysktytu-salmonel/.
15. Rimhanne-Finne R, Lukinmaa S, Martelius T, Rossow H, Karpiskova R et al. Cases of Salmonella Urbana in Finland, the Czech Republic and Latvia, January-February 2010. Eurosurveill, 2010;15(11):12-14. Dostupné na www: http://www.eurosurveillance.org/ViewArticle.aspx?ArticleId=19511.
16. ECDC. Multi-country outbreak of Salmonella Stanely infections[online]. [cit. 2013-10-13]. Dostupné na www: http://www.ecdc.europa.eu/en/publications/Publications/20120921_RRA_Stanley_Salmonella.pdf
17. Myšková P, Karpíšková R, Dědičová D. Výskyt monofazické varianty Salmonella 9,12:l,v:- v České republice. Veterinářství, 2012;62:632 – 634.
18. de la Torre E, Zapata D, Tello M, Mejía W, Frías N et al. Several Salmonella enterica subsp. enterica serotype 4,5,12:i:− phage types isolated from swine samples originate from serotype Typhimurium DT U302. J Clin Microbiol, 2003;41:2395–2400.
19. Karpíšková R, Dědičová D. Výskyt a charakteristika salmonel ve vybraných lokalitách České republiky – porovnání epidemiologických a laboratorních dat. Epidemiol Mikrobiol Imunol, 2009;58(1):31–35.
20. Mueller-Doblies D, Speed K, Davies RH. A retrospective analysis of Salmonella serovars isolated from pigs in Great Britain between 1994 and 2010. Prev Vet Med, 2013;110(3-4):447–445.
21. Žemličková H, Dědičová D, Jakubů V, Mach J, Kolínská R et al. Antibiotická rezistence u netyfových sérovarů Salmonella spp. V České republice. Epidemiol Mikrobiol Imunol, 2013;62(2):43–49.
22. Strahilevitz J, Jacoby GA, Hooper DC, Robicsek A. Plasmid-mediated quinolone resistance: a multifaceted threat. Clin Microbiol Rev, 2009;22(4):664–689.
23. Gay K, Robicsek A, Strahilevitz J, Park CH, Jacoby G. Plasmid-mediated quinolone resistance in non-typhi serotypes of Salmonella enterica. Clin Infect Dis, 2006;43:297–304.
Labels
Hygiene and epidemiology Medical virology Clinical microbiologyArticle was published in
Epidemiology, Microbiology, Immunology
![Issue 2](https://www.prolekare.cz/media/cache/resolve/journal_issue/media/image_pdf/35e25141e60ea9975253d2242a08e4f4.jpeg)
2014 Issue 2
Most read in this issue
- Bodové prevalenčné sledovanie nozokomiálnych nákaz na Slovensku – súčasť projektu Európskej únie
- Výskyt Candida dubliniensis v klinickém materiálu a možnosti její identifikace
- Q-horečka jako profesionální onemocnění vedoucí k invaliditě – kazuistika
- Diagnostika Clostridium difficile infekcí – porovnávací studie dvou imunoenzymatických metod s konfirmací pomocí PCR a kultivace s následnou ribotypizací kmene*