Sporicidní činidla schopná s vysokou účinností inaktivovat spóry Bacillus anthracis

Experimentálně ředicí neutralizační metodou – kvantitativním suspenzním testem bez přítomnosti zátěže – byla ověřena vysoká schopnost biocidních činidel Hvězda a PTSPCH-J inaktivovat spóry Bacillus anthracis.

Klíčová slova:
antrax – spory – Bacillus anthracis – inaktivace.

Úvod

Bacillus anthracis(B. anthracis) je řazen mezi vysoce riziková biologická agens [7, 11] využitelná zejména k teroristickým útokům. Zvláštní pozornost tomuto agens začala být věnována po sérii tzv. antraxových dopisů po 11. září 2001 v USA, které mj. vedly u 11 kontaminovaných osob po vdechnutí spor k inhalačnímu antraxu, z nichž pět jich zemřelo [11].

B. anthracis je nepohyblivá grampozitivní sporulující tyčinka délky mezi 4–8 μm, průměru 1–1,5 μm. Spóry B. anthracis jsou vysoce odolné nejen vůči vlivům zevního prostředí, ale také různým fyzikálním faktorům a biocidním činidlům. Právě tyto vlastnosti spór zvýrazňují nebezpečnost a riziko onemocnění antraxem a představují infekční formu mikroorganismu B. anthracis.

Příčinou onemocnění je kompletní antraxový toxin tvořený trojicí proteinů: protektivní antigen, edematózní faktor a letální faktor, přičemž jednotlivé faktory samy o sobě nejsou toxické. Spóry antraxu jsou nejprve fagocytovány mikrofágy, ve kterých pak dochází k jejich germinaci a množení. Poté jsou syntetizovány jednotlivé složky antraxového toxinu. Spóry jsou oválného tvaru velikosti přibližně 1–3 μm.

Jsou známy tři formy onemocnění:

• a) plicní – jejím prvotním projevem jsou zvýšená teplota, slabost, bolest v oblasti hrudníku, dušnost;
• b) kožní – začíná svěděním, poté se vytvoří nebolestivý pupínek, který se následně mění v malý puchýř naplněný mikroorganismy a leukocyty, a po prasknutí puchýře se v místě infekce vytvoří nejprve hnisavý, později nekrotický zčernalý vřed;
• c) střevní – projevuje se vysokou horečkou a krvavými průjmy.

Existuje dostatek literárních pramenů popisujících snahu vědeckých pracovníků nalézt způsob, jak rychle a účinně inaktivovat spóry B. anthracis, avšak ne všechny způsoby jsou v praxi využitelné, často vyžadují speciální technické vybavení, ověřované nutné doby expozice jsou dlouhé, stupeň inaktivace spor je nízký apod.

Rogers, J. V. et al. ověřovali využití plynného formaldehydu o koncentraci 1000 ppm při době působení 10 hodin k inaktivaci spór B. anthracis, jimiž bylo kontaminováno sedm druhů vnitřních povrchů [8]. Za popsaných podmínek experimentu bylo zjištěno výrazné snížení schopnosti růstu B. anthracis na všech kontaminovaných povrchách.

Byl také ověřován účinek vysokého tlaku vzduchu a vyšších teplot na inaktivaci spór B. anthracis [2] se závěrem, že k inaktivaci spór nedochází za atmosférického tlaku při teplotách 20, respektive 45 °C při době expozice 360 min. Jsou popsány rozdílné průběhy závislosti stupně inaktivace spór pro teploty 45 či 75 °C a tlaky 280, 400 a 500 MPa.

V jiné práci [3] je popsáno využití UV záření vlnové délky 254 nm a dále záření gama k inaktivaci spór B. anthracis. Pro srovnání účinků byly použity spóry Bacillus cereus (B.cereus) pro jejich podobnost se spórami B. anthracis. Ověřili, že spóry B. anthracis kmen Sterne jsou více rezistentní vůči UV₂₅₄ záření než spóry B. cereus a dále, že suché spóry na tuhém povrchu jsou rezistentnější, než jsou-li ve formě vodné suspenze. K podobným závěrům dospěli i při sledování účinků záření gama.

 Armon R. et al. se zabývali využitelností fotokatalýzy za přítomnosti nanočástic TiO₂ k dezinfekci vody kontaminované spórami B. anthracis [1]. Princip účinků objasňují zvýšenou tvorbou hydroxylových radikálů (HO^.) aktivních při oxidačním procesu, zejména ve vodném prostředí. Radikály působí jako silný biocid.

Za zajímavou lze považovat studii kinetiky inaktivace avirulentních spór B. anthracis v mléce působením tepla a peroxidu vodíku [12]. Výsledky studie vedou k závěru, že kombinace teplot 90–95 °C a peroxidu vodíku o koncentraci 0,05–0,5 % mohou být případně využity k odstranění této kontaminanty z mléka do té míry, že mléko bude bezpečně použitelné.

Rose L. J. et al. ověřovali účinek volného (aktivního) chlóru na inaktivaci spór sedmi bakteriálních agens využitelných k teroristickým útokům vedoucím ke kontaminaci zdrojů pitné vody [9]. Dospěli k závěru, že existují rozdíly nejen v nutných minimálních koncentracích volného chlóru a předem ověřených dobách expozice pro různá agens, ale také i pro různé kmeny téže kontaminanty, jak to bylo zjištěno pro spóry B. anthracis kmene Amiens, či kmene 34F2. Přitom musí být brán zřetel i na podmínky, za nichž je ověřování uskutečněno, tj. zejména na pH a na teplotu prostředí.

V jiné studii jsou popsány spóricidní účinky biocidů bez přítomnosti reziduí a za přítomnosti reziduí (plnotučného mléka, vaječného žloutku a moučné pasty) na inaktivaci avirulentních spór B. anthracis kmenů 7702, ANR-1 a 9139 [5]. Byly použity: peroxooctová kyselina, chlornan sodný a peroxid vodíku různých koncentrací při teplotách 10, 20 nebo 30 °C a době působení 10 minut. Největší inhibiční vliv zátěže se projevil u chlornanu sodného. Jestliže chlornan sodný (5 % aktivního chlóru) redukuje počet spór schopných germinace při teplotě 10 °C o 4 log řády, pak za přítomnosti zátěže je dosažený redukční faktor poloviční. Přítomnost reziduí nemá vliv na spóricidní účinnost kyseliny peroxooctové, ani peroxidu vodíku. 

Materiál a metody 

Byla ověřována sporicidní účinnost dvou kapalných dvousložkových pěnotvorných činidel zásaditého charakteru (pH cca 12) se širokospektrými dezinfekčními a významnými detoxikačními účinky: HVĚZDA a PTSPCH-J. HVĚZDA byla vyvinuta ve spolupráci s UO FVZ Hradec Králové, činidlo PTSPCH-J v Decomkov Praha, s. r. o., Laboratoře Hradec Králové. HVĚZDA je již vyráběna, zařazena mezi dezinfekční činidla používaná v AČR a náleží k přípravkům schválených MZd k používání. Pro druhé činidlo, PTSPCH-J, je v současné době řešen vhodný technický prostředek pro jeho použití, zejména jako prostředku pro prvotní odmoření jednotlivce, a to jak pro AČR, tak pro IZS.

Činidlo HVĚZDA sestává ze 4 objemových dílů složky AB, což je alkalizovaná směs tenzidů a z 1 objemového dílu složky CC (15% roztok peroxidu vodíku).

Složka a činidla PTSPCH-J obsahuje N-metyl-2-pyrrolidon, tri-n-butylfosfát a tenzid., složku b tvoří 0,64 mol . dm^-3 chlornan sodný.

Sporicidní účinnost na spóry B. anthracis byla ověřována ve Státním veterinárním ústavu Praha-Lysolaje kvantitativním suspenzním testem, diluční neutralizační metodou podle ČSN-EN 13 704 [4], bez zátěže. Neutralizační činidlo: Dey‑Engley Neutralizing Broth (Hi Media M 1062-500G)_. Testovací teplota: 21 °C. Použité mikroorganismy: Bacillus anthracis Sterne (A 15, CN England 1937). Sporulace kmene: 96 %.

K ověření, že i nově vyvíjený biocidní přípravek PTSPCH-J má vysokou sporicidní účinnost i za přítomnosti bílkovinné zátěže, byl proveden experiment s použitím spór Bacillus subtilis CCM 1999 (sporulace kmene 99,2 %)., za jinak shodných podmínek uvedených v předchozím odstavci. Testovací teplota: 21 °C. Zátěž nízká: hovězí albumin 3 g . dm^-3, zátěž vysoká: hovězí  albumin 10 g . dm^-3 + kvasniční extrakt 10 g . dm^-3.

Uvedená činidla nelze testovat  koncentrovaná (100%), protože při použití dané metody dochází ke zředění přidáním suspenze spór a činidla lze testovat pouze při koncentraci 80% a menší. 

Výsledky 

V tabulce 1 jsou prezentovány výsledky experimentálního ověření sporicidní účinnosti činidel HVĚZDA a PTSPCH-J na spóry B. anthracis. V podstatě platí, že obě činidla mají přibližně stejnou účinnost, i když lze předpokládat, že mechanismus inaktivace spór jednotlivých činidel se pravděpodobně liší.

Výsledky testu souvisejícího s ověřením vlivu reziduí různých koncentrací na účinnost neředěného i zředěného činidla PTSPCH-J na inaktivaci spor B. subtilis jsou uvedeny v tabulce 2.

Diskuse

U obou činidel byl dosažen redukční faktor počtu spór schopných germinace větší než 8 log řádů, což svědčí o mimořádně vysoké inaktivační účinnosti obou biocidních přípravků, a to bez ohledu na typ biocidu obsaženého v dezinfekčním přípravku. Činidlo PTSPCH-J s chlornanem sodným (3,9 % aktivního chlóru) obsahuje také dvě organické látky, které významně narušují bariéry tvořící obal spóry a tím usnadňují průnik biocidu do centrální části spóry, a umožňují tak biocidu inaktivat spóru.

Ani přítomnost reziduí, a to i ve vysoké koncentraci, nesnižuje sporicidní účinnost činidla PTSPCH-J. Je to dáno především dostatečně vysokou koncentrací biocidu, pH prostředí a přítomností tří organických sloučenin způsobujících dispergaci, následné rozpuštění v zátěži přítomných bílkovin a tuků a jejich degradaci biocidem.

Jestliže by byla testovaná činidla použita ve formě pěny generované z koncentrovaných (100%) činidel, lze oprávněně předpokládat jejich výrazně vyšší sporicidní účinek [10]. 

Závěr 

Byla vyvinuta dvě biocidní činidla s vysokým inaktivačním účinkem na spóry B. anthracis, která by mohla být prakticky využita k likvidaci následků po teroristickém útoku spojeném s použitím spór B. anthracis k dezinfekci tuhých povrchů včetně kůže, a to jak ve formě nástřiku činidel, tak ve formě pěn. 

Použité zkratky

AČR                   – Armáda české republiky

B. anthracis     – Bacillus anthracis

B. cereus          – Bacillus cereus

IZS                     – Integrovaný záchranný systém

MZd                   – Ministerstvo zdravotnictví   

UO FVZ             – Univerzita obrany Fakulta vojenského zdravotnictví

Tato práce vznikla za finanční podpory Ministerstva průmyslu a obchodu ČR v rámci projektu FF-P2/115, FI-IM3/199.

Do redakce došlo 22. 3. 2010.

Doc. Ing. Jan Severa, CSc.

Všehrdova 1701

500 00 Hradec Králové

e-mail: severah@seznam.cz