Aplikace metod molekulární genetiky v klinické mikrobiologii: zpráva z jednání Pracovní skupiny molekulární mikrobiologie – TIDE

Overview

V poslední dekádě došlo k velkému rozmachu využití molekulárně-genetických metod v klinické mikrobiologii. Tyto metody přinášejí nové poznatky a přístupy v celé oblasti mikrobiologie – v taxonomii a identifikaci mikrobů, diagnostice infekčních agens, epidemiologii infekčních onemocnění a antibiotické rezistence. Předkládaný text nabízí závěry z jednání Pracovní skupiny molekulární mikrobiologie (PSMM-TIDE) v rámci 2. výročního zasedání Společnosti pro lékařskou mikrobiologii ČLS JEP.

Klíčová slova:
molekulární mikrobiologie – typizace – identifikace – taxonomie – PCR – klinická mikrobiologie.

Úvod

V poslední dekádě došlo k velkému rozmachu využití molekulárně-genetických metod v klinické mikrobiologii. Nejčastěji využívanou metodou je pravděpodobně polymerázová řetězová reakce (PCR) v různých uspořádáních – ať již v reálném čase, s analýzou velikosti produktu na agarózovém gelu, s vyhodnocením hybridizací výsledného produktu atp. Následně se do rutinní diagnostické praxe dostávají i „složitější“ metody, jakými jsou např. sekvenace DNA nebo in situ hybridizace.

Využití těchto metod pokrývá celé spektrum mikrobiologie – virologii, bakteriologii, mykologii a parazitologii. Přesto však nelze tento metodický přístup z mikrobiologické diagnostiky vytěsňovat a získané výsledky interpretovat bez obecné znalosti oboru klinické mikrobiologie jako celku. Lze zaznamenat, že je molekulárně-genetickým metodám přisuzována větší role, než je z obecně platných zákonitostí oboru možné. Jsou-li těmito metodami prokazovány obligátní patogeny, bývá interpretace výsledků snazší. Pokud však prokazujeme patogeny fakultativní, což reprezentuje převážnou část bakteriologické a mykologické diagnostiky, nemusí být interpretace výsledků snadná. Vždy je nutné vzít v úvahu, že se jedná o vzájemnou interakci dvou (případně více) živých organismů – mikrobiálního agens a hostitele.

Na 1. výročním zasedání Společnosti pro lékařskou mikrobiologii ČLS JEP, konaném ve dnech 19. a 20. června 2009, byl iniciován vznik pracovní skupiny, která se bude zabývat aplikací molekulárně-genetických metod v klinické mikrobiologii. Pracovní skupina molekulární mikrobiologie – TIDE (PSMM, Taxonomie, Identifikace, Diagnostika, Epidemiologie) byla ustavena na svém prvním zasedání dne 16. 9. 2009.

Tento dokument vznikl jako konsenzus z jednání PSMM-TIDE na 2. výročním zasedání Společnosti pro lékařskou mikrobiologii ČLS JEP ve dnech 19. a 20. února 2010 v Nemocnici Na Homolce.

Definice

Molekulární mikrobiologie je metodickým a nevyčlenitelným přístupem v rámci oboru klinické mikrobiologie a vychází ze základního dokumentu – Koncepce oboru (http://www.splm. cz/dokumenty/koncepce_oboru.pdf). Molekulárně-genetický přístup musí být řešen v rámci komplexního procesu diagnostiky etiologického agens infekčního onemocnění, zahrnující v sobě preanalytickou fázi, správné metodické provedení v analytické fázi a dále v postanalytické fázi interpretaci výsledku a návrh terapie v kontextu příslušného klinického případu jako celku. Dalším specifickým využitím molekulárně-genetických metod je typizace mikrobů pro epidemiologické účely.

Aplikace metod molekulární biologie v klinicko-mikrobiologické diagnostice

Metody detekce a analýzy nukleových kyselin (NK) se postupně zařazují mezi standardní mikrobiologické vyšetřovací metody. V diagnostice celé řady patogenních mikroorganismů jsou dokonce přínosnější než metody „tradiční“, popř. jsou i jediné v praxi reálně použitelné (např. v diagnostice chlamydií, mnohých virových agens). Zdravotnická veřejnost by tedy k těmto metodám měla přistupovat jako ke standardním a měla by být co nejobjektivněji informována o jejich optimálním využívání.

Pracovní skupina molekulární mikrobiologické diagnostiky (PSMM-TIDE) si dává za cíl přispět k technologické i interpretační standardizaci těchto diagnostických postupů v regionu. Jednotlivými cíly budou:

a) Problematika kontroly kvality a standardizace práce laboratoří: Zajištění srovnatelných kvalitních materiálních a personálních vstupů, mj. laboratorního materiálu, diagnostických kitů apod., a dále otázka kvalifikace pracovníků molekulárních diagnostických laboratoří v mikrobiologii. Vypracování konsenzuálních doporučení v podobě manuálů či standardních operačních postupů pro klinické laboratoře. Manuály se obecně a pro jednotlivá agens zaměří na potřeby laboratoří (Jak uchovávat vzorky před zpracováním a jak je archivovat; Jak zpracovávat vzorky před izolací NK; Jak izolovat NK a standardizovat výtěžek; Doporučení k „ekvivalentu vyšetřeného klinického materiálu“; Jaké metody analýzy NK použít?; Jaké jsou vhodné a nevhodné cílové sekvence s popisem konkrétních rizik nebo zvláštností, variability apod.; Specifická doporučení pro jednotlivá agens; Přehled možností externího hodnocení kvality a kvalitních referenčních laboratoří; Způsob přípravy naměřených dat pro prezentaci klinikům (uživatelům); Způsob interakce a spolupráce na interpretaci mezi mikrobiologem a uživatelem, apod.).

b) Problematika aplikační a interpretační: Vypracování konsenzuálních doporučení v podobě manuálů pro pracovníky laboratoří a pro klinické uživatele. Manuály se obecně, ale především konkrétně pro jednotlivé agens zaměří na potřeby a otázky klinických uživatelů (Co lze od těchto metod reálně očekávat?; Jak a kdy odebírat vzorky a jak zasílat do laboratoří?; S jakými jinými diagnostickými metodami je vhodné molekulárně- -biologickou diagnostiku kombinovat?; Jak rozumět laboratorním výsledkům, tj. co je „normální hodnota“ a co je klinicky významné?; Jak interpretovat kvantitativní výsledky?; Jak hodnotit kinetiku infekce měřenou metodami molekulárně- -mikrobiologické diagnostiky?; Jaký je stávající stav poznání o asociaci laboratorních výsledků s klinickým stavem pacienta?).

Pracovní skupina sdružuje odborníky v oboru molekulární diagnostiky a zaměří se primárně na rutinní klinické aplikace. Pokusí se především v regionu ČR vytvořit co nejširší tým specialistů na jednotlivá agens a působit jako garant pro rutinní klinické užívání molekulárních biologických metod v klinické diagnostice.

Taxonomie a identifikace v bakteriologii pomocí analýzy DNA

Taxonomie si klade za cíl charakterizovat mikroorganismy a zařadit je určitým způsobem do taxonomických jednotek, tzv. taxonů, a to na základě průkazu jejich vlastností a vzájemného příbuzenského vztahu. Mikrobiologická taxonomie v sobě zahrnuje klasifikaci, nomenklaturu a identifikaci bakterií. Fenotypové vlastnosti doplněné o výsledky metod molekulární biologie studující genetickou příbuznost (DNA/DNA hybridizace, DNA/rRNA hybridizace, sekvenování genů pro rRNA a některé proteiny, PCR typizace) a také o chemotaxonomické údaje jsou nazývány jako fylogenetická klasifikace. Studium nukleových kyselin bylo poprvé aplikováno do problematiky (tehdy pouze bakteriální klasifikace) před více než 40 lety a stále zůstává jednou z hlavních technik u průkazu klinicky významných mikroorganismů. Tyto metody jsou zaměřeny buď na celkovou DNA (Mol %G + C, RFLP analýza, PFGE, velikost genomu, DNA-DNA hybridizace), nebo jen na určitý úsek DNA (ribotypizace, AFLP, PCR metody – ERIC-PCR, rep-PCR, tRNA-PCR, DNA sondy, DNA sekvenování, plazmidová DNA), a mohou umožnit rozdělení druhů do množství odlišných typů [8].

Nozologické jednotky již od dob Pasteura a Kocha jsou svázány se zařazením a pojmenováním mikroorganismu a s jeho průkazem (identifikací) v klinickém materiálu. Ke stanovení etiologie infekčního procesu byla vyvinuta zvláštní pravidla (Kochovy postuláty). I když tato pravidla byla v historii modifikována (virologie, priony), neustále je třeba tato pravidla dodržovat a kultivovat. Se samotnou identifikací a zejména s interpretací výsledku identifikace je třeba zacházet v širším kontextu znalosti primárních a potenciálních (oportunních) patogenů, znalosti rezidentní flóry člověka, znalosti patogenity a faktorů virulence organismů a dnes stále více znalosti stavu imunity pacienta. Zejména u imunodeficientních pacientů mohou vyvolávat onemocnění bakterie z prostředí, které běžným způsobem nelze identifikovat a příčinné souvislosti lze interpretovat s obtížemi (kontaminace).

Zdokonalení molekulárně-mikrobiologických metod, např. sekvenování, přineslo zpřesnění klasifikace a následně i identifikace z fylogenetického hlediska. Zároveň se však vynořily některé problémy pro obor lékařské mikrobiologie:

• a) změny v nomenklatuře komplikují standardizované postupy v klinických laboratořích;
• b) nemožnost identifikovat některá agens pomocí rutinních fenotypových metod;
• c) nejasný vztah k etiologii onemocnění v případě molekulárně-genetického průkazu mikroorganismů v klinickém materiálu.

Uplatnění metodik molekulární typizace mikroorganismů vyžaduje neustále rozvíjet poznání v oblasti taxonomie a zároveň je nutné aplikaci těchto poznatků v oboru podrobit jasně definovaným pravidlům tam, kde tyto poznatky mají přímý dopad na zdraví a nemoc pacienta. Tomuto předpokladu odpovídá polyfázová taxonomie, což je taxonomie založená na kombinaci údajů získaných rozmanitými laboratorními technikami a obsahuje všechny dostupné genotypové, fenotypové a fylogenetické informace [1]. Pro plné pochopení příbuznosti mezi jednotlivými zástupci mikroorganismů je použití jen jedné metody nedostatečné a je vyžadován mnohostranný přístup – tzv. polyphasic approach. Tento přístup je nyní plně aplikován v bakteriologii při popisu nových druhů bakterií a archaeí; kompletní přehled všech validně publikovaných jmen je dostupný na adrese http://www.bacterio.cict.fr, přičemž tato databáze je měsíčně aktualizována.

Sekvenování DNA se v poslední době stává běžně dostupným na mnoha pracovištích molekulární mikrobiologie. Úkolem PSMM-TIDE v oblasti taxonomie a identifikace mikrobů bude podpora multioborového přístupu k této problematice a aplikace do rutinních mikrobiologických technik formou metodických doporučení.

Molekulární epidemiologie infekčních nemocí

Nástroje molekulárně-genetické analýzy přinesly přesnější pohled na typizaci bakterií, ať se již jedná o vyšetřování outbreaků, šíření antibiotické rezistence, popř. hledání zákonitostí v epidemicitě a patogenitě infekčních agens. Tyto metody v některých případech zcela nahradily starší fenotypizační přístupy, jako např. fagotypizace, biotypizace atp. To je způsobeno jejich vyšší diskriminační schopností. Přesto se však vždy jedná o pouhou aproximaci skutečného stavu – popis omezeného počtu markerů, protože úplné výsledky pro srovnávání dvou mikrobů může přinést pouze stanovení kompletní sekvence genomů, které je např. u bakterií v rutinní praxi zatím neproveditelné. V roce 2007 bylo publikováno doporučení pro typizaci bakterií, které vypracovala Pracovní skupina epidemiologických markerů Evropské společnosti klinické mikrobiologie a infekčního lékařství (ESGEM-ESCMID) [2]. Toto doporučení považujeme za základní metodologii typizace bakterií, která může být aplikována v rutinní praxi.

Pracovní skupina molekulární mikrobiologie (PSMM-TIDE) sdružuje odborníky, kteří se zabývají praktickou aplikací různých molekulárně-typizačních metod, ať již na lokální úrovni epidemiologie nozokomiálních infekcí (nemocniční zařízení), tak i na úrovni výzkumné, v oblasti referenční činnosti, pokrývající spektrum grampozitivních i gramnegativních bakterií [3–6, 9]. Vzhledem k velké šíři používaných molekulárně-typizačních metod je vytvoření odborné skupiny, která bude garantovat praktické aplikace těchto metod, optimálním řešením pro oblast České republiky.

Nedílnou součástí molekulárně-epidemiologického vyšetření je interpretace výsledku. Ta musí být podpořena dokonalou znalostí principu používané metody. Vzhledem k tomu, že se v případě různých mikrobů používají různé typizační přístupy, existuje konsenzus PSMM-TIDE o využití stávajících center pro typizaci bakterií (např. NRL pro antibiotika, Poradenské centrum pro identifikaci a epidemiologii beta-laktamáz – projekt LF UK v Plzni, SZÚ a Nemocnice Na Homolce, Česká sbírka mikroorganismů atp.). Problematiku typizace nelze zaštítit jedním centrálním typizačním centrem.

Problémem využití molekulárně-epidemiologických metod na území ČR není technické zabezpečení laboratoří a praktické zvládnutí těchto metod, ale spíše interpretace a aplikace výsledků v prevenci nozokomiálních infekcí. Na tuto problematiku je nutné se v další činnosti PSMM-TIDE cíleně zaměřit.

Závěr

Molekulárně-genetické metody našly nezastupitelné místo v diagnostické praxi klinické mikrobiologie. Přesto je nutné jejich indikace a následné interpretace výsledků hodnotit se znalostí veškerých limitů těchto metod tak, jako je tomu v případě ostatních mikrobiologických technik. PSMM-TIDE si vytyčila za základní cíl být odborným garantem v aplikaci těchto metod v mikrobiologii – molekulární mikrobiologii. PSMM-TIDE vítá zapojení dalších odborníků z oblasti molekulární mikrobiologie do práce skupiny. Výsledkem by měla být metodická doporučení v oblasti molekulárně-mikrobiologické diagnostiky, taxonomie a identifikace za použití zmíněných metod a v problematice molekulární epidemiologie.

Ing. Jaroslav Hrabák, Ph.D.
Ústav mikrobiologie
LF UK Praha a Fakultní nemocnice v Plzni
Dr. E. Beneše 13
305 99 Plzeň
e-mail: Jaroslav.Hrabak@lfp.cuni.cz