Genotypizace virového glykoproteinu B (gB) u příjemců transplantátu kmenových buněk krvetvorby s aktivní infekcí cytomegalovirem – sledování vlivu genotypů na průběh infekce

Overview

Cíle práce:
Genetická variabilita cytomegaloviru (CMV) může ovlivňovat jeho patogenní projevy u imunodeficientních pacientů. Na základě genetické variability v genu UL55, kódujícím dominantní virový obalový glykoprotein gB, lze CMV rozdělit do čtyř hlavních genotypů. Cílem práce byla analýza zastoupení genotypů gB u dospělých příjemců allogenního transplantátu kmenových buněk krvetvorby (HSCT) a jejich vztahu k průběhu transplantace a infekce CMV.

Materiál a metody:
gB byl typizován v archivovaných vzorcích, získaných z periferní krve 53 příjemců HSCT, transplantovaných v letech 2004–2005. Pro genotypizaci byla použita metoda analýzy polymorfismu produktů štěpení restrikčními endonukleázami (RFLP) a sekvenace centrální variabilní části genu. Vztah genotypů ke sledovaným klinickým parametrům byl hodnocen multivariantní analýzou s vyloučením vlivu příbuznosti donora, shody HLA a léčby antithymocytárním imunoglobulinem (ATG).

Výsledky:
Genotyp gB1 byl prokázán u 30 %, gB2 u 17 %, gB3 u 26 %, a gB4 u 4 % pacientů. U jednoho pacienta byl nalezen atypický genotyp. 17 % pacientů mělo smíšenou infekci více genotypy. Zastoupení jednotlivých genotypů se neměnilo v čase, přestože pacienti, transplantovaní v roce 2005, měli v průměru masivnější infekci s vyššími hladinami viru v krvi. gB1 byl provázen nižší virovou náloží (p=0,046) a mírnějším průběhem symptomatické infekce, ale vyšším výskytem akutní reakce štěpu proti hostiteli (OR 3,4; p = 0,067). Myelosupresivní projevy infekce byly méně časté u pacientů s gB3 (OR 0,09; p = 0,075). Naproti tomu pacienti s gB2 měli horší průběh symptomatické infekce s častějšími projevy orgánového postižení (OR 6,65; p = 0,15) a horší reakcí na antivirovou terapii (OR 0,18; p = 0,12). Vliv smíšené infekce na prognózu onemocnění nebyl prokázán.

Závěry:
Výsledky této studie naznačují, že jednotlivé genotypy gB mají vliv na průběh infekce i na případné komplikace u příjemců HSCT. Tato pozorování je však nutno ověřit na větším souboru pacientů v kontextu se sledováním variability dalších důležitých virových genů. Charakterizace virových genetických faktorů, ovlivňujících patogenní projevy CMV, významně ovlivní péči o pacienty s vysokým rizikem cytomegalovirové infekce.

Klíčová slova:
lidský cytomegalovirus, patogeneze, transplantace kmenových buněk krvetvorby, genotypizace, gB.

Úvod

Přes veškeré úspěchy, které byly v posledních letech učiněny v oblasti terapie i prevence, patří cytomegalovirus (CMV) u příjemců transplantátu allogenních hematopoetických krvetvorných buněk (HSCT) k nejzávažnějším život ohrožujícím patogenům. Aktivní infekci prodělá až 80 % transplantovaných pacientů a u 20–30 % je provázena klinickými příznaky, k nimž patří horečka, pancytopenie a známky orgánového postižení – intersticiální pneumonie, gastroenteritis či hepatitis [1]. Sekundárně se zvyšuje riziko mykotických infekcí a akutní nebo chronické reakce štěpu proti hostiteli (AGVHD,CGVHD) [2]. Nejvýznamnějšími rizikovými faktory pro cytomegalovirovou nemoc u příjemců HSCT jsou transplantace štěpu od nepříbuzných, HLA- neshodných dárců, séropozitivita příjemce, deplece T-lymfocytů a agresivní imunosupresivní terapie [2]. Jednou z možných příčin variability klinických projevů cytomegalovirové infekce mohou být i genetické rozdíly mezi jednotlivými kmeny. Přestože je, v porovnání s jinými viry, CMV geneticky velmi stabilní, jednotlivé kmeny nejsou zcela identické, ale vytváří větší, či menší množství genetických variant (genotypů), které mohou souběžně nebo následně infikovat stejného hostitele [3, 4]. Geneticky variabilní úseky se nacházejí v různých částech virového genomu a zasahují i do funkčně významných genů, jako je např. gen pro hlavní regulátor transkripce (IE1), geny kódující imunomodulační proteiny nebo povrchové glykoproteiny na virovém obalu [5]. Poslední z nich jsou předmětem intenzivního studia, neboť zprostředkují vazbu virionů na buněčné receptory a průnik virů do hostitelských buněk. Jejich variabilita může ovlivnit infekčnost viru, buněčný tropismus i interakci s imunitním systémem hostitelského organismu. Lze tedy předpokládat, že polymorfismus těchto proteinů může ovlivnit patogenní vlastnosti příslušných kmenů CMV. Glykoprotein B (gB), kódovaný genem UL55, je součástí obalového glykoproteinového komplexu gCI, který je hlavní komponentou virového obalu, odpovídá za vazbu virionů na jeden z buněčných receptorů (heparan sulfát) a zahajuje fuzi virového obalu s buněčnou membránou [6]. Jeho součástí je imunodominantní antigen, který vyvolává jak buněčnou imunitní odpověď, tak tvorbu neutralizačních protilátek [7,8]. Genetická variabilita gB je soustředěna v centrální oblasti proteinu, v místě, kde dochází ke štěpení prekurzorového polypeptidu na dvě funkční subjednotky, a umožňuje rozlišení čtyř základních genotypů CMV (gB1,gB2, gB3,gB4) a tří vzácných neprototypových variant [9]. Hlavní antigenní determinanta i doména, která se účastní vazby na receptor, jsou součástí variabilní oblasti [9]. Jednotlivé genotypy se tedy mohou lišit svými imunogenními vlastnostmi i schopnostmi infikovat různé typy buněk. Nejrozšířenějším způsobem prevence cytomegalovirové nemoci u příjemců HSCT je preemptivní terapie antivirotiky. Tento postup zahrnuje pravidelné laboratorní monitorování aktivity cytomegaloviru pomocí pp65-antigenémie nebo kvantifikace virové nálože v krvi pacienta a nasazení léčby při prvních známkách rozvíjející se aktivní infekce [10].

Cílem této studie byla genetická analýza kmenů CMV, identifikovaných u allogenních příjemců HSCT, a sledování vlivu genotypů gB na průběh infekce a její dopad na zdraví pacienta.

Materiál a metody

Pacienti:

Do studie bylo zahrnuto 53 dospělých příjemců allogenního transplantátu HSC, léčených v letech 2004–2005 v Ústavu hematologie a krevní transfuze v Praze. Klinické charakteristiky pacientů jsou znázorněny v tabulce 1a. Cytomegalovirová infekce byla u pacientů monitorována pomocí vyšetření pp65-antigenémie a kvantitativní PCR (viz dále). Do 100. dne po transplantaci či u pacientů, léčených imunosupresivy pro reakci štěpu proti hostiteli (GVHD), bylo vyšetření prováděno jednou týdně, později byli pacienti vyšetřováni v intervalech 14 dnů až 1 měsíc.

Vyšetření pp65-antigenémie

Bylo prováděno metodou nepřímé imunofluorescence pomocí monoklonální protilátky proti virovému tegumentovému antigenu pp65 ( pp65 CINA Pool, Argene). Jako sekundární protilátka byl použit prasečí anti-myší imunoglobulin, značený fluorescein-isothiokyanátem (SwAM-FITC, Sevapharma, Praha). Z leukocytů pacienta, získaných z buffy coatu po sedimentaci nesrážlivé krve 1 hod při 37°C, byly připraveny cytospinové nátěry, obsahující 2x10⁵ leukocytů / preparát. Po obarvení výše zmíněnými protilátkami byly na preparátu počítány buňky s jasně zelenou jadernou imunofluorescencí.

Za hranici pozitivity testu bylo považováno 5 specificky svítících buněk / 2x10⁵ leukocytů.

Kvantitativní PCR

Pro kvantifikaci virové DNA v periferní krvi byla použita amplifikace úseku genu UL83 metodou kvantitativní real--time PCR podle Pumannové et al. [11]. Celková DNA byla izolována z 200 μL buffy coatu (viz výše) pomocí kolonek Qiagen (QiaAmp Blood Mini Kit, Qiagen) nebo pomocí automatického extraktoru MagnaPure (LC DNA Isolation Kit, Roche). Výsledek vyšetření byl udáván v počtu genom-ekvivalentů CMV na 1 ml krve.

Genotypizace gB metodou polymorfismu produktů restrikčního štěpení (RFLP)

Pro toto vyšetření byly použity izoláty DNA nebo vzorky buffy coatů, archivované při -20°C . Před použitím byly zahřáty 3 min. na 95°C, promíchány a krátce centrifugovány (8000ot/min. 1 min.). Variabilní úsek gB, zahrnující centrální variabilní oblast genu pro glykoprotein B (UL55, kodon 439 535, 293-6 párů bází) byl amplifikován pomocí nested PCR [12]. Reakce byla prováděna v 50 μl reakční směsi, obsahující 0,25 U Fast-Start Taq DNA polymerázy (Roche), reakční pufr pro amplifikaci DNA fragmentů bohatých na GC (Roche) a 25 pmol primerů. (Primery a amplifikační podmínky – viz Roubalová a spol. [40]. Produkt reakce byl následně štěpen restrikčními endonukleázami Hinf I a Rsa I (Promega). Reakční směs obsahovala 15 μl produktu PCR, 2 μl pufru (Promega), 2 μl Acyl- BSA (1 μg/ml, Promega) a 10U enzymu. Produkty štěpení byly analyzovány pomocí elektroforézy v 12 % akrylamidovém gelu po obarvení ethidium bromidem [9]. Od každého pacienta byly analyzovány minimálně dva nezávisle odebrané vzorky.

Sekvenace

Výsledky RFLP byly ověřeny pomocí sekvenace výše zmíněného úseku virové DNA. Sekvenační reakce, obsahující 10 pmol každého primeru a 0,1–1 μg templátu v 16 μL reakční směsi (Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit BD 3.1), byla provedena v automatickém sekvenátoru (Applied Biosystems 3100). Sekvence byly analyzovány pomocí software SeqScape 2.0 and Mega 4.

Statistické vyhodnocení

Statistické vyhodnocení rozdílů mezi pacienty transplantovanými v letech 2004 a 2005 bylo provedeno pomocí univariantní analýzy s využitím Fischerova χ² a Man-Whitney-Wilcoxonova testu (EpiInfo 6.04). Vliv genotypu na klinické ukazatele a kvantitativní znaky CMV infekce byl hodnocen pomocí multivariantní analýzy metodou logistické regrese s vyloučením vlivu příbuznosti donora graftu, shody HLA a léčby ATG. Vzájemná interakce zohledněných proměnných nebyla hodnocena. Střední doba přežití byla hodnocena pomocí Kaplan-Meyerovy analýzy a Log rank testu s využitím software SPSS v. 17.

Výsledky

Pacienti, transplantovaní v letech 2004 a 2005, byli srovnatelní co do zastoupení různých typů základního onemocnění, typu transplantátu, podílu nepříbuzenských i HLA-neshodných transplantací a lišili se pouze v četnosti aplikace ATG v průběhu přípravného režimu.

Přestože celková četnost cytomegalovirové infekce i výskyt cytomegalovirové nemoci byly u obou skupin pacientů podobné, laboratorní parametry CMV (hladina virové DNA v periferní krvi na počátku infekce nebo pp65-antigenémie, tj. počet leukocytů, pozitivních na virový antigen pp65), byly u pacientů transplantovaných v roce 2005 podstatně zvýšeny (tabulka 1b). V zastoupení jednotlivých genotypů gB v obou skupinách pacientů nebyly pozorovány významné rozdíly (tabulka 2).

Při první epizodě aktivní infekce CMV byl nejčastěji nalezen gB1 a gB3. Smíšená infekce více genotypy gB byla prokázána u 17 % pacientů a v roce 2004 byla vyšší než v roce 2005; rozdíl však nebyl statisticky významný. Atypický genotyp byl opakovaně zachycen u jednoho pacienta.

Tabulka 3 dokumentuje vliv jednotlivých genotypů gB na klinický průběh transplantace. Protože výskyt gB4 byl vzácný, hodnotili jsme pouze přítomnost gB1, 2 a 3, pokud byl daný genotyp zachycen aspoň v jednom z vyšetřených vzorků pacienta. (V této tabulce jsou tedy, narozdíl od tabulky 2, hodnoceny i nálezy z dalších rekurentních epizod infekce. Rekurence byla dokumentována u 49 % pacientů a přesmyk z jednoho genotypu na jiný byl zaznamenán u 9 %.) Pacienti s gB1 měli zvýšený výskyt AGVHD (OR 3,4; p = 0,07) a naopak nižší výskyt chronické GVHD (OR 0,37; p = 0,16). Výskyt symptomatické infekce byl relativně snížen u gB2 (OR 0,32; p = 0,15), u gB3 bylo zvýšeno riziko rekurencí (OR 2,8; p = 0,18). Střední doba přežívání byla nejvyšší u pacientů s gB3 a nejnižší u pacientů s gB2, rozdíl však nebyl statistický signifikantní. Porovnání charakteristik infekce CMV u jednotlivých genotypů gB ukazuje tabulka 4.

Pacienti, infikovaní gB1, měli signifikantně nižší virovou nálož na počátku infekce (p = 0,046). Pacienti s gB3 měli virovou nálož naopak mírně zvýšenou, rozdíl však nebyl statisticky významný. Vliv sledovaných genotypů na četnost a hladiny pp65-antigenemie nebyl prokázán. Průběh symptomatické cytomegalovirové infekce (tabulka 5) byl horší u pacientů s gB2, u nichž častěji docházelo k orgánovému postižení (OR6,7; p = 0,15) a hůře reagovali na antivirovou terapii (OR 0,18; p = 0,12). Pacienti s gB3 měli naopak mírnější průběh s menšími projevy myelosuprese (OR 0,09; p = 0,075). Vliv souběžné infekce více genotypy na průběh cytomegalovirové infekce nebyl prokázán (tabulka 4, 5).

Diskuse

Vliv genotypu gB na patogenní vlastnosti CMV byl v minulosti sledován u různých skupin rizikových pacientů. U kongenitálně či perinatálně infikovaných dětí byla opakovaně nalézána souvislost gB1 s postižením jater [13,14,15]. Yan et. al. [16] nalezli souvislost mezi gB3 a vrozenou hluchotou u kongenitálně infikovaných dětí, kdežto Bale et. al. [17] naopak nacházeli tento genotyp častěji u asymptomaticky infikovaných novorozenců. U HIV-pozitivních pacientů byly nalézány rozdíly v tkáňové distribuci a způsobu přenosu jednotlivých genotypů [18, 19]. Některé studie popisují souvislost gB2 s postižením CNS [20, 21, 22], jiné ji však nepotvrdily [23, 24, 25]. U příjemců transplantátů solidních orgánů většina studií neprokázala jednoznačný vliv genotypu gB na klinický průběh transplantace či infekce CMV [12, 26, 27, 28]. Některé práce však dokumentovaly zhoršenou prognózu u pacientů, současně infikovaných více kmeny CMV [29, 30, 31]. V naší studii byl u pacientů s gB1 pozorován mírnější průběh infekce, spojený s nižší virovou náloží a menším rizikem generalizace a orgánového postižení. Zároveň však tito pacienti měli vyšší výskyt AGVHD. Pacienti s gB2 měli naopak horší průběh infekce s vyšším rizikem orgánového postižení a horší odpovědí na antivirovou terapii. Spojitost gB1 s lepší prognózou infekce u příjemců HSCT potvrzují i jiné studie [33, 34]. Meyer--Königová et. al. [35] zjistili, že gB1 není schopen infikovat lymfocyty. Snížená patogenita tohoto genotypu u příjemců HSCT by tedy mohla souviset s jeho zhoršenou schopností šířit se krví. S rozdílným buněčným tropismem gB1 může souviset i jeho vztah k AGVHD [34] nebo k akutní rejekci štěpu u pacientů s transplantací solidních orgánů [36]. Horší prognóza infekce u pacientů s gB2 byla popsána i ve studiích Hebarta et. al. [37] nebo Woo et. al. [38]. Na rozdíl od těchto autorů jsme však nenalezli u gB2-infikovaných pacientů vyšší riziko symptomatické infekce, ale pouze její horší průběh. Retiére et. al. [39] prokázal asociaci gB2 s genotypy HLA A11,A32 a DR11, které jsou u příjemců transplantátu ledviny spojeny s vysokým rizikem symptomatické infekce CMV. Důsledkem této kombinace může být nedokonalá prezentace antigenních peptidů, odvozených z gB, imunitnímu systému hostitele a oslabená imunitní odpověď na virovou infekci. U genotypu gB3 byly naše výsledky v porovnání se studií Torok-Storba et. al. [33] protichůdné: zatímco v uvedené práci autoři prokázali u pacientů s gB3 zvýšené riziko úmrtí v důsledku myelosuprese, v našem souboru byl tento genotyp asociován s nižším rizikem pancytopenie u pacientů se symptomatickou infekcí a s lepší střední dobou přežívání. Výsledky, které jsme získali, mohou být ovlivněny menší velikostí našeho souboru pacientů: většina rozdílů, které jsme pozorovali, nedosáhla 95% hranice statistické významnosti, a bude je tedy nutno potvrdit studiem většího souboru pacientů. Příčinou rozdílných výsledků u jednotlivých studií mohou být i rozdíly v metodice: různé výchozí soubory pacientů, různé typy vzorků (klinické vzorky vs virové izoláty, získané na tkáňových kulturách), odlišnosti ve sledovaných parametrech i ve způsobu statistického zpracování dat. Nepochybně zde hraje svoji roli i celková variabilita CMV, která postihuje nejen gB, ale i řadu dalších funkčně významných genů. Na základě současných vědomostí nedokážeme předpovědět, který z nich bude mít za daných podmínek infekce dominantní roli. Toto hledisko je nutno mít na zřeteli při interpretaci výsledků, získaných sledováním variability pouze jednoho z mnoha zúčastněných genů.

Závěry

Patogenita CMV je komplexním jevem, na kterém se podílí řada faktorů jak virového, tak hostitelského původu. Výsledky této studie naznačují, že jednotlivé genotypy gB mají vliv na průběh infekce i na případné komplikace u příjemců HSCT. Tato pozorování je však nutno ověřit na větším souboru pacientů v kontextu se sledováním variability dalších důležitých virových genů. Charakterizace virových genetických faktorů, ovlivňujících patogenní projevy CMV, významně ovlivní péči o pacienty s vysokým rizikem cytomegalovirové infekce.

Seznam zkratek:

• AGVHD – akutní reakce štěpu proti hostiteli
• ATG – anti-thymocytární imunoglobulin
• CGVHD – chronická reakce štěpu proti hostiteli
• CMV – lidský cytomegalovirus
• CNS – centrální nervový systém
• gB – cytomegalovirový glykoprotein gB
• GE – genom-ekvivalent
• HLA – hlavní histokompatibilitní komplex
• HSCT – transplantace kmenových buněk krvetvorby
• OR – odds ratio
• PCR – polymerázová řetězová reakce
• Pp65 – virový fosfoprotein o mol. váze 65 KDal
• RFLP – analýza polymorfismu produktů štěpení restrikčními endonukleázami

Poděkování: Tento projekt byl sponzorován grantem IGA MZ ČR NR9418-3/07 a VZ MZ ČR 23736.

Dr. K. Roubalová
Vidia s.r.o.
Nad Safinou II/365
251 42 Jesenice u Prahy
e-mail: kroubalova@vidia.cz.