Prediktivní diagnostika u karcinomu prsu – co je nového pro rok 2018?

Prediktivní diagnostika karcinomu prsu přináší řadu novinek, největší změny se - přinejmenším v podmínkách České republiky - týkají detekce HER2 - tedy diagnostiky overexprese onkoproteinu HER-2/neu, resp. amplifikace genu c-erbB-2. V ČR je rutinně prováděno primární testování pomocí imunohistochemie, která je doplněna v indikovaných případech in situ hybridizací. V roce 2013 došlo k aktualizaci pravidel - snížení relativního podílu nádorových buněk pro stanovení imunohistochemické HER2 pozitivity z původních 30 % na 10 %, hranice pro stanovení amplifikace genu se posunula z HER2/CEP17 hodnoty 2,2 na 2,0. Došlo také ke změně kritérií pro vyhodnocení exprese jako 2+. Tyto změny vedly k poměrně významnému nárůstu počtu případů hodnocených jako „hraniční“ či „neurčité“, a tím k navýšení případů vyžadujících doplnění in situ hybridizace. Aby bylo sníženo riziko falešně negativních i falešně pozitivních výsledků, je pro finální potvrzení HER2 pozitivity před zahájením cílené terapie prováděno v ČR ověření v síti tzv. referenčních laboratoří.

U core-cut biopsie je vyšetření HER2 vhodné provádět prakticky vždy, zcela nezbytné je u nemocných podstupujících neoadjuvantní systémovou léčbu. U nemocných primárně léčených chirurgicky lze vyšetření molekulárních prediktivních markerů provést až z definitivního resekátu. Je však třeba vzít v úvahu, že přesnost stanovení některých parametrů v core-cut biopsii může být limitovaná, i bez ovlivnění neoadjuvantní chemoterapií (NACHT) dosahuje shoda grade v core-cut vzorku a v definitivním resekátu jen 67 %, shoda v přesné histologické typizaci pak 84 %; shoda v hodnocení exprese HER2 dosahuje mezi punkčními vzorky a resekáty nad 90%. Při pozitivním výsledku HER2 v core-cut biopsii již není nezbytné opakování vyšetření z resekátu, naproti tomu při negativním výsledku HER2 v core-cut biopsii je doporučeno opakování vyšetření z resekátu, aby bylo eliminováno, resp. minimalizováno riziko falešně negativního výsledku.

Pravděpodobnost patologické kompletní odpovědi (pCR) je různá u jednotlivých molekulárních subtypů karcinomu prsu - u triple-negativních a HER2+ karcinomů prsu dosahuje 27-51 %, u hormonálně dependentních nádorů, zejména těch s nízkou proliferační aktivitou, je významně nižší. I v rámci skupiny HER2+ karcinomu se pravděpodobnost pCR liší. HER2+ karcinomy se současnou expresí ER a PR mají procento pCR nižší než nádory HER2+ bez koexprese hormonálních receptorů. Karcinomy s expresí vysokomolekulárních keratinů (CK14, CK 5/6) s bazálním fenotypem nebo nádory s mutací genů HER2/AKT signální dráhy (PI3K, PTEN) mají rovněž nižší odpověď na léčbu a horší prognózu.

Klíčová slova:
karcinom prsu – HER2 – prediktivní diagnostika – molekulární patologie – neoadjuvantní terapie – patologická odpověď

Na příkladu karcinomu prsu lze dobře ilustrovat pokroky v diagnostice i léčbě solidních nádorů. Díky časné diagnostice (plošný screening karcinomu prsu), pokroku v chirurgii (standardní využití prs šetřících výkonů, využití konceptu biopsie sentinelové uzliny), zavedení imunohistochemie a in situ hybridizace v histopatologických vyšetřeních do rutinní praxe (detekce hormonálních receptorů, proliferační aktivity, exprese a amplifikace HER2), lepšímu porozumění molekulární patogenezi nádorů a v neposlední řadě také díky uplatnění přístupu personalizované léčby se u řady nemocných podařilo transformovat karcinom prsu do polohy zcela vyléčitelného nebo alespoň chronického a dlouhou dobu kontrolovatelného onemocnění.

Právě oblast prediktivní diagnostiky přinesla v posledních letech do rutinního vyšetření karcinomu prsu nejvíce novinek, v posledním roce či dvou však ani zde nelze hovořit o revoluci, spíše snad o evoluci a trendu směřování ke zvýšení spolehlivosti a přesnosti těchto vyšetření. Zatímco v oblasti standardní morfologické diagnostiky jsou změny, které přinesla nová WHO klasifikace, vesměs kosmetického rázu (formální změna terminologie u duktálního invazivního karcinomu na karcinom NST, upřesnění pravidel gradingu, apod.), v prediktivní diagnostice se stěžejní pozornost soustředí na spolehlivost a kontrolu kvality vyšetření a také na maximální přínos takto prováděných testů pro individuální nemocné.

Následující text se zaměří na jeden důležitý výsek z celého komplexního diagnosticko-terapeutického přístupu, a to na novinky v oblasti detekce HER2 - tedy histopatologické diagnostiky overexprese onkoproteinu HER-2/neu, resp. genetických změn, které jsou s tímto sdruženy - tj. amplifikaci genu c-erbB-2.

Pravidla pro testování a interpretaci HER2 se až do roku 2013 řídila doporučenými postupy publikovanými ASCO/CAP v roce 2008. V roce 2013 došlo k poměrně zásadní aktualizaci pravidel – relativní množství nádorových buněk, u kterých byla vyžadována exprese proteinu pro stanovení pozitivity, se snížilo z původních 30 % na 10 %, hranice pro stanovení amplifikace genu se posunula z 2,2 na 2,0 (v případě hodnocení poměru HER2/CEP17 mezi počtem signálů genu a signálů pericentromerické oblasti chromozomu 17, resp. na 6 v případě hodnocení jen absolutního počtu signálů genu). Došlo také ke změně kritérií pro vyhodnocení exprese jako 2+, kromě již dříve zavedené kategorie slabé kompletní membránové pozitivity spadá do kategorie 2+ nyní také střední či silná inkompletní membránová pozitivita (1). Tyto změny, ačkoli vypadají jako zdánlivě kosmetické, vedly k poměrně významnému nárůstu počtu případů hodnocených jako „hraniční“ či „neurčité“, které vyžadují po provedení imunohistochemie dořešení pomocí in situ hybridizace, jak bylo potvrzeno v celé řadě nezávislých studií (2-4). V každodenní rutině funguje v ČR, stejně jako ve většině dalších zemí, zavedená praxe s primárním testováním pomocí imunohistochemie, která je doplněna v indikovaných případech in situ hybridizací. Platí přitom, že konkordance obou metod je velmi vysoká (nad 90 %), nikoli však absolutní – v rozsáhlé recentní metaanalýze dosahoval podíl případů, které byly IHC negativní (0 nebo 1+) a přitom vykazovaly amplifikaci genu až 4 % (5). Publikovaná data rovněž ukazují, že shoda mezi menšími primárními laboratořemi, které vyšetření HER2 provádějí méně často, a velkými specializovanými centrálními laboratořemi má daleko k ideálu (6,7). Z tohoto důvodu je pro finální potvrzení HER2 pozitivity před zahájením cílené terapie prováděno v ČR ještě ověření výsledků v síti tzv. referenčních laboratoří.

Schematicky lze roli patologa při stanovení HER2 rozdělit do několika rovin. První je detekce HER2 v core-cut biopsiích, druhou totéž vyšetření v resekátu a poslední (časově, nikoli však významem) detekce HER2 u recidivy nádoru.

Před zahájením jakékoli systémové léčby karcinomu musí být znám nejen typ nádoru, ale také jeho molekulární charakteristiky. Pokud jde o hodnocení core-cut biopsie, je vyšetření HER2 nezbytné v podstatě u všech nemocných s výjimkou případů, u kterých se multidisciplinární tým a pacientka shodnou na primárním chirurgickém řešení (8). V takových situacích přichází v úvahu odložení vyšetření molekulárních prediktivních markerů až z definitivního resekátu. Jak však ukazuje dlouhodobá praxe, multidisciplinární tým většinou upřednostňuje postup, kdy již v momentě prvního zvažování možných terapeutických řešení jsou k dispozici veškeré dostupné údaje včetně imunofenotypu nádoru, a proto je u valné většiny core-cut biopsií provedeno vyšetření HER2 ještě před vlastním operačním zákrokem. Na tomto místě je ale třeba upozornit, že přesnost stanovení některých parametrů v malém punkčním vzorku je podle některých prací limitovaná, i bez ovlivnění neoadjuvantní chemoterapií (NACHT) může např. shoda mezi stanoveným grade v core-cut vzorku a v definitivním resekátu dosahovat jen 67 %, shoda v přesné histologické typizaci pak jen 84 % (9). Při hodnocení exprese HER2 jsou data poněkud optimističtější, shoda mezi punkčními vzorky a resekáty dosahuje nad 90 % (10, 11).

Je třeba rovněž mít na paměti, že u nemocných podstupujících primární systémovou léčbu, představuje punkční biopsie odebraná před zahájením terapie jediný vzorek nádorové tkáně terapií neovlivněné a u případů s kompletní patologickou odpovědí (pCR) pak jediný dostupný vzorek nádorové tkáně vůbec.

Podíl nádorů s pCR po NACHT se mezi jednotlivými studiemi výrazně liší. Možných příčin těchto rozdílů je hned několik - různé složení léčených kohort nádorů, různé terapeutické režimy (kombinace cytostatik i dávková schémata) i různé klasifikace použité pro vyhodnocení odpovědi. Je proto velmi obtížné až nemožné srovnávat jednotlivé studie mezi sebou. Pravděpodobnost patologické kompletní odpovědi je různá u jednotlivých molekulárních subtypů karcinomu prsu (12). Zatímco u triple-negativních a HER2 pozitivních karcinomů prsu dosahuje procento pCR v různých studiích až 27-51 %, u hormonálně dependentních nádorů, zejména těch s nízkou proliferační aktivitou, je významně nižší (13-15). Přitom pCR je statisticky významným prediktorem celkového přežití (16).

Je však třeba zdůraznit, že i v rámci jedné molekulární třídy - tj. HER2 pozitivního karcinomu - lze identifikovat další dílčí podskupiny, u kterých se pravděpodobnost pCR liší. HER2 pozitivní karcinomy se současnou expresí ER a PR (zařazované mezi tzv. luminální B HER2 pozitivní karcinomy) mají procento pCR nižší než nádory HER2+ bez současné exprese hormonálních receptorů. I v této podskupině lze ještě dále odhalit nádory s horší prognózou - jsou to např. karcinomy s expresí vysokomolekulárních keratinů (CK14, CK 5/6) ukazující na diferenciaci směrem k bazálnímu fenotypu nebo např. nádory u kterých je přítomna některá z mutací genů HER2/AKT signální dráhy, jako jsou např. aktivační mutace genu PI3K (15) nebo mutace vedoucí ke ztrátě exprese proteinu PTEN (17,18).

U nemocných podstupujících neoadjuvantní léčbu, u kterých nedošlo ke kompletní patologické odpovědi, umožňuje porovnání nádoru v punkční biopsii a v definitivním resekátu nejen okamžité hodnocení efektu zvolené terapie, ale zároveň nabízí z vědeckého pohledu jedinečnou příležitost pro lepší porozumění biologie jednotlivých subtypů karcinomu prsu a šanci na identifikaci dalších potenciálních prediktorů efektu jednotlivých terapeutických režimů. Je evidentní, že množství molekulárních i morfologických markerů, které umožní volbu optimální léčby pro konkrétní pacientku, roste a bude narůstat i do budoucnosti. S nárůstem testovaných parametrů tak logicky přichází limitace daná množstvím tkáně odebrané při core-cut biopsii, která nemusí v budoucnosti postačovat pro všechna vyšetření.

U nemocných, kde není NACHT vůbec zvažována, je otázkou, nakolik je nezbytné vyšetřování hormonálních receptorů, Ki67 a HER2 již z core-cut biopsie, zejména při vědomí rizika diskrepance mezi punkční biopsií a resekátem. Je tak na rozhodnutí multidisciplinárního týmu, zda lze stanovení prediktivních markerů ponechat až na analýzu z chirurgického materiálu s kompletně odstraněným nádorem. Pokud je přesto prediktivní vyšetření provedeno již v core-cut biopsii, je třeba zajistit, že informace o stavu exprese hormonálních receptorů, Ki67 a zejména HER2 je v maximální možné míře spolehlivá. Co se týče stanovení HER2 stavu, při pozitivním výsledku v core-cut biopsii (3+ certifikovaným IHC kitem nebo 2+ certifikovaným IHC kitem s potvrzenou amplifikací genu) již není nezbytné opakování vyšetření z resekátu, protože pozitivní výsledek je dostatečný pro zahájení cílené anti-HER2 terapie (ani negativní výsledek v resekátu, který by mohl být způsobený např. degradací proteinu v důsledku nedodržení pravidel pro zacházení s materiálem během preanalytické fáze, nezmění nic na skutečnosti, že nemocná splňuje svým HER2 stavem podmínky pro zvážení cílené léčby). Jiná je situace v případě negativního výsledku HER2 v core-cut biopsii. V takovém případě je doporučeno opakování vyšetření z resekátu, aby bylo eliminováno, resp. minimalizováno riziko falešně negativního výsledku (způsobené např. heterogenitou nádorové populace)(1,11).

Samozřejmě naprosto odlišná je situace, kdy mezi odběrem core-cut biopsie a chirurgickým zákrokem proběhla jakákoli systémová léčba. V takových nádorech může v důsledku selekčního tlaku daného terapií dojít ke změně molekulárního profilu. Poměrně časté jsou změny exprese ER a PR, pravidlem je rovněž pokles indexu proliferačního antigenu Ki67. Naopak relativně vzácně dochází ke změně HER2 stavu, pokud je toto pozorováno, jde zpravidla o změnu imunohistochemické exprese, naopak počet kopií genu detekovaný pomocí ISH zůstává většinou nezměněn. Totéž platí také pro vyšetření recidivy nádoru s časovým odstupem.

Pro dostatečně kvalitní vyšetření všech prediktivních markerů, HER2 nevyjímaje, je zcela zásadní dodržování pravidel pro zacházení s tkání. Během preanalytické fáze může při nedodržení základních pravidel - okamžité a přiměřeně dlouhé fixace v neutrálním formalínu - dojít k nenávratnému poškození antigenních epitopů kritických pro IHC vyšetření. Důsledkem pak jsou falešné negativní výsledky IHC. Příliš dlouhá fixace, případně kyselé pH formalínu vedou k fragmentaci DNA, což následně může zkomplikovat či dokonce zcela znemožnit provedení validního vyšetření pomocí in situ hybridizace (ISH)(1).

Při dodržení všech základních pravidel je imunohistochemie metodou spolehlivou, byť vždy zatíženou určitým stupněm mezilaboratorní variability. Recentní zahraniční data ukazují na přetrvávání tohoto problému, kdy diskrepance mezi výsledkem primární a referenční laboratoře může dosahovat až 12 % případů s klinicky signifikantní neshodou (HER2+ vs. HER2-) a dalších až 20 % s klinicky nesignifikantní neshodou (v rámci jedné kategorie, tedy HER2+ nebo HER2-) (7). Data z celostátního histologického registru karcinomu prsu MAGISTER naproti tomu ukazují, že systém zavedené sítě referenčních laboratoří, kde jsou opakovaně certifikovanými kity testovány všechny pacientky, které jsou potenciálními kandidátkami cílené antiHER2 terapie, vedl k výraznému zvýšení kvality testování HER2 v České republice. Shoda mezi výsledky primárních a referenčních laboratoří je velmi vysoká. Mezi 294 případy primárně diagnostikovanými v primární laboratoři jako 3+ je jen 7 (2,4%) falešně pozitivních nádorů, které byly v referenční laboratoři klasifikovány jako negativní (0 nebo 1+). Mezi 340 případy primárně hodnocenými jako negativní (0 nebo 1+) a zaslanými k potvrzení do referenční laboratoře (zpravidla z důvodů zvýšené pravděpodobnosti diskordantního fenotypu) byl jediný (0,3%!) imunohistochemicky falešně negativní (zdroj: registr MAGISTER - nepublikovaná data za rok 2016).

Pokud jde o porovnání jednotlivých referenčních laboratoří, nemáme k dispozici přímá data srovnávající výsledky vyšetření identických vzorků v různých laboratořích. Pokud se však podíváme na zastoupení HER2 pozitivních případů v jednotlivých referenčních laboratořích (a to pouze u případů na těchto pracovištích primárně zachycených, aby bylo možné eliminovat vliv „obohacení“ kohorty HER2+ případů na tato pracoviště zasílaných) které by mělo být vzhledem k homogenitě populace v rámci ČR v podstatě stejné, jsou výsledky velmi podobné. Zastoupení HER2+ nádorů (HER2 3+ nebo jakýkoli výsledek IHC se současnou amplifikací genu) se v celkové kohortě 7356 vzorků pohybuje v rozmezí 11,1 - 16,6% (průměr 14,0%).

Jaké praktické novinky tedy přináší druhá polovina roku 2017 do prediktivní diagnostiky karcinomu prsu? V prvním pololetí 2017 došlo k sérii jednání mezi zástupci ČOS a VZP, při kterých VZP vznesla požadavky na omezení či úpravu algoritmů některých doposud prováděných prediktivních vyšetření se záměrem co nejvíce zracionalizovat využití finančních prostředků investovaných plátci do prediktivního testování.

Pokud jde o vyšetření HER2 u karcinomu prsu, jsou výsledkem těchto jednání následující pravidla (závazná pro laboratoře patologie ode dne podpisu zápisu z jednání, tj. od 27. 7. 2017):

1. U vyšetření HER2 v core-cut biopsiích je v primárních (ne-referenčních) laboratořích nadále prováděno standardní IHC vyšetření. Případy 2+ a 3+ a případy negativní (0, 1+) se zvýšenou pravděpodobností diskordantního fenotypu se zasílají k ověření do referenčních laboratoří (RL).

Jen pro připomenutí dosavadních pravidel - nádory se zvýšenou pravděpodobností diskordantního fenotypu jsou definovány dle následujících parametrů: nádory se ztrátou hormonální dependence, tj. se ztrátou exprese ER a/nebo PR, které jsou současně jiné než tubulární, lobulární, mucinózní nebo papilární.

Oproti dosavadním zavedeným zvyklostem se z nádorů se zvýšenou pravděpodobností diskordantního fenotypu automaticky do RL posílají pouze nádory triple-negativní. Nádory se ztrátou exprese jen jednoho z receptorů (téměř vždy jde o ztrátu PR) se zasílají do RL jen na základě indikace onkologa.

V referenční laboratoři je HER2 vyšetřován vždy výhradně IHC certifikovaným kitem. Další postup závisí na výsledku IHC vyšetření - případy 3+ jsou považovány za definitivně pozitivní a dále se ISH netestují. Případy 2+ se vždy automaticky došetří pomocí ISH. U negativních (0 a 1+) nádorů se zvýšenou pravděpodobností diskordantního fenotypu se došetří ISH automaticky, pokud se prokáže ztráta exprese obou receptorů (ER i PR - tj. nádory triple-negativní) nebo na základě žádosti onkologa, pokud je prokázána ztráta exprese jen jednoho z receptorů (ER nebo PR).

2. U resekátů se provádí vyšetření HER2 obdobným způsobem, jako u core-cut biopsií. Navíc však platí následující pravidla:

• a) Pokud je výsledek z core-cut biopsie znám a je „definitivně pozitivní“ (tj. z RL 3+ nebo ISH+), vyšetření se neopakuje.
• b) Pokud je výsledek z core-cut znám a je negativní/sporný, platí identický postup, jako v případě vyšetření z core-cut biopsie.
• c) Pokud laboratoři testující resekát výsledek z core-cut znám není, vyšetření HER2 je provedeno až na základě žádosti onkologa.

Na první pohled složitě vypadající pravidla lze velmi zjednodušeně „přeložit“ následujícím způsobem:

1. Vždy platí, že „větší bere“ - tedy pokud je již jednou prokázána v RL jakkoli HER2 pozitivita, není toto vyšetření potřeba nijak doplňovat či opakovat.
2. Pokud laboratoř nemá k dispozici informaci o předchozích výsledcích, je na onkologovi, aby si vyžádal v referenční laboratoři další doplnění testování.

Je evidentní, že systém, který byl léta budován a všem zúčastněným stranám (mamologům, chirurgům, onkologům i patologům) se již „dostal pod kůži“ se s ohledem na rozhodnutí plátců o změnách úhrady prediktivních vyšetření bude muset změnit. To může přinejmenším zpočátku přinést určité zmatky, zdržení apod. Tato skutečnost ještě více podtrhuje nutnost úzké spolupráce všech zainteresovaných odborností v rámci multidisciplinárních týmů, kde lze vzniklé zádrhele odstranit a napomoci tak hladké implementaci nového postupu, aby byla zachována nastavená vysoká úroveň kvality prediktivního testování karcinomu prsu.

PROHLÁŠENÍ

Autor práce prohlašuje, že v souvislosti s tématem, vznikem a publikací tohoto článku není ve střetu zájmů a vznik ani publikace článku nebyly podpořeny žádnou farmaceutickou firmou. Toto prohlášení se týká i všech spoluautorů.

Adresa pro korespondenci:

Prof. MUDr. Aleš Ryška, Ph.D.

Fingerlandův ústav patologie LF UK a FN, Hradec Králové

Sokolská 581, 500 05 Hradec Králové

tel.: +420 495 832 611

email: ryskaale@gmail.com