Současné možnosti léčby hyperfenylalaninémie

Fenylketonurie (PKU) je dědičná porucha metabolismu aminokyseliny fenylalaninu, způsobená deficitem fenylalaninhydroxylázy v játrech. Pacienti s PKU musí dodržovat celoživotní nízkobílkovinnou dietu s nízkým obsahem fenylalaninu ve stravě s cílem zamezit neurologickému postižení. Adherence k dietě je často nízká vzhledem ke špatným organoleptickým vlastnostem směsí aminokyselin bez fenylalaninu a nízkobílkovinných výrobků. Pokrok v biochemii, genetice, a to zvláště molekulární, vedl v posledních letech ke změněnám v terapeutické strategii u pacientů s PKU.

V prezentované práci jsou diskutovány nízkobílkovinná dieta, neutrální aminokyseliny s dlouhým řetězcem, glykomakropeptid, mastné kyseliny s dlouhým řetězcem, DHA a EPA, terapeutická postnatální repopulace jaterních buněk, tetrahydrobiopterin, enzymová náhradní terapie pomocí fenylalaninamoniaklyázy (PAL) a genová terapie jako možnosti léčby PKU.

Klíčová slova:
hyperfenylalaninémie, fenylketonurie, terapie, nízkobílkovinná dieta, neutrální aminokyseliny s dlouhým řetězcem – LNAA, glykomakropeptid – GMP, mastné kyseliny s dlouhým řetězcem, DHA, EPA, terapeutická postnatální repopulace jaterních buněk, tetrahydrobiopterin – BH4, fenylalaninamoniaklyáza – PAL, genová terapie

Úvod

Fenylketonurie (PKU, OMIM 261600) je dědičná porucha metabolismu fenylalaninu (Phe), s autozomálně recesivním typem dědičnosti a incidencí klasické PKU v České republice 1:9869 [1]. Metaanalýzy vědeckých publikací potvrzují signifikantní korelaci mezi hladinou fenylalaninu v krvi a dosaženým IQ pacienta. Neléčená PKU vede k poruše kognitivních funkcí, jako je pozornost a exekutivní funkce [2, 3].

Fenylketonurie byla v roce 1934 objevena Föllingem jako ,,phenylpyruvic oligophrenia“ [4] a v roce 1937 přejmenována Penrosem a Quastelem na fenylketonurii [5]. V 50. letech minulého století byl odhalen enzymatický defekt, deficit fenylalaninhydroxylázy (PAH, EC 1.14.16.1) v játrech [6].

Profesor Guthrie v roce 1963 zavedl novorozenecký screening hyperfenylalaninémie (HPA) pomocí bakteriálního inhibičního testu s Bacillus subtilis ze suché krevní kapky novorozence [7]. V roce 1964 objevil Kaufman kofaktor fenylalaninu – tetrahydrobiopterin, BH4 [8]. Danks odhalil v roce 1978 tzv. maligní hyperfenylalaninémii, tj. poruchy tvorby a regenerace (recyklace) BH4 [9]. Woo v roce 1983 lokalizoval gen pro PKU na chromozom č. 12 (PAH gen, 12q23.2) [10]. PAH gen se skládá ze 13 exonů. Přes 60 % ze všech mutací PAH genu tvoří missense mutace, následují malé či velké delece, splicing mutace (mutace, které způsobují poruchy sestřihu), silent (tiché) mutace, nonsense mutace a inzerce. Většina pacientů je složenými heterozygoty pro dvě různé mutace. V naší populaci je nejčastější mutace p.R408W. V 90. letech minulého století bylo založeno konsorcium (PAH Mutation Analysis Consortium) shromažďující mutované alely v PAH genu, kterých bylo dosud popsáno přes 500. Přelomem je 21. století s objevem BH4 respozivní HPA [11].

PAH je homotetramerický enzym, který se skládá ze tří funkčních domén: regulační, katalytické a oligomerizační. BH4 senzitivní mutace jsou lokalizovány zejména v katalytické doméně. Předpokládá se, že PAH deficit patří mezi ,,protein-misfolding disease“, kde globální změny konformace mutovaného proteinu narušují fyziologickou funkci PAH enzymu [12, 13].

Deficit fenylalaninhydroxylázy v játrech nebo porucha tvorby či recyklace BH4 mohou vést k hyperfenylalaninémii.

Hyperfenylalaninémie z deficitu PAH lze rozdělit podle hladiny fenylalaninu v krvi před zahájením terapie do 3 skupin:

1. klasická PKU při hodnotách Phe >1200 µmol/l, tj. více než 20 mg/dl,
2. mírná PKU při hodnotách Phe 1200–600 µmol/l, tj. 20–10 mg/dl,
3. mírná HPA při hodnotách Phe 600–120 µmol/l, tj. 10–2 mg/dl.

Mezi HPA z poruch tvorby a regenerace BH4 zahrnujeme: deficit GPT cyklohydrolázy I (OMIM 600225), deficit 6-pyruvoyltetrahydropteridinsyntázy (OMIM 261640), deficit dihydropteridinreduktázy (OMIM 261630), deficit pterin-4a-karbinolamindehydratázy (OMIM 126090). Další dvě poruchy tvorby a regenerace biopterinu nejsou spojeny s hypefenylalaninémií: doparespozivní dystonie (OMIM 126090) a deficit sepiapterinreduktázy (OMIM 182125).

Kromě fenylalaninu BH4 působí současně jako kofaktor pro tyrozinhydroxylázu a tryptofanhydroxylázu a tím ovlivňuje též syntézu katecholaminů a serotoninu. Klinické příznaky poruchy tvorby a regenerace BH4 spojené s HPA odrážejí těžký deficit centrálních neurotransmiterů, tj. líné pití, sníženou spontánní pohybovou aktivitu, ,,floppy baby“, iritabilitu, okulogyrické krize, zvýšenou salivaci, nestabilní tělesnou teplotu, žvýkací potíže, křeče, opoždění psychomotorického vývoje a mikrocefalii [14].

Kromě novorozeneckého screeningu HPA slouží k diagnostice jejích různých forem několik testů:

1. hladina fenylalaninu v krvi (norma <120 µmol/l),
2. stanovení dihydropteridinreduktázy v krvi ze suché krevní kapky,
3. vyšetření moči na pteriny,
4. zátěžový test s BH4,
5. stanovení neurotransmiterů v likvoru: kyselina homovanilová (HVA) a 5-hydroxyindoloctová (5-HIAA).

Existuje řada modifikací zátěžového testu s BH4. Při klasickém testu se pacientovi podá před jídlem BH4 v dávce 20 mg/kg. Následují odběry krve na fenylalanin a tyrozin před jídlem v čase 0, 4, 8, 24 hodin. Při pozitivním testu by měl fenylalanin klesnout po podání BH4 (obvykle v 8. hodině) a měla by se zvýšit hladina tyrozinu v krvi. Není jednoznačně stanoveno, v jakém věku provádět zátěžový test s BH4 a jaká hodnota fenylalaninu v krvi je hraniční pro provedení testu. Test lze provádět i u novorozence před zahájením terapie a obvyklou hranicí je hladina Phe v krvi vyšší než 400–600 µmol/l [15].

V současné době je všeobecně akceptováno, že existuje interindividuální tolerance fenylalaninu ve stravě a interindividuální prostupnost hematoencefalické bariéry pro molekuly fenylalaninu [16, 17]. Fenotyp probanda s HPA/PKU je individuální a podle toho bychom měli přistupovat k jeho léčbě [18].

Léčebné možností PKU/HPA

1. Nízkobílkovinná dieta

Nízkobílkovinnou dietu uvedl do praxe v roce 1954 profesor Horst Bickel [19]. U probandů s deficitem fenylalaninhydroxylázy zavedení nízkobílkovinné diety s nízkým obsahem fenylalaninu ve stravě časně postnatálně, dostatečně intenzivně a dlouhodobě umožňuje normální či téměř normální vývoj kognitivních funkcí. Dieta se sestavuje individuálně podle pohlaví, hmotnosti, potřeby bílkovin, cukrů, tuků a tolerance fenylalaninu ve stravě. Je doporučována jako celoživotní dieta, tzv. ,,diet for life“. K léčbě se používají tzv. ,,formulas či medical food“, tj. směsi aminokyselin bez fenylalaninu, potraviny pro zvláštní lékařské účely. Jsou používány s příchutí či bez příchuti, ve formě prášku, tablet, kapslí, tyčinek nebo již připravené k vypití, tzv. ,,ready to drink“ formulas. Nutnou součástí diety jsou nízkobílkovinné výrobky, tzv. ,,low protein“ products, které zahrnují pečivo, těstoviny, vaječnou náhražku, mléko, cornflakes, cracery, müsli tyčinky, paštiky, knedlíky, zmrzlinu a další. Nevýhodou je vysoká cena výrobků.

Deficit v organoleptických vlastnostech, nutričním obsahu a vysoká cena diety vedou ke snížené adherenci k dietě, zvláště u dospívajících a dospělých. Nedodržování diety je spojeno s poruchou exekutivních funkcí, vizuálně prostorovým deficitem, poruchami nálady a chování. V graviditě je pak nedodržování diety spojeno se syndromem maternální PKU, tj. embryopatií z hyperfenylalaninémie matky [20, 21].

Pacient s PKU má problémy s plánováním diety, nemá často schopnost pamatovat si obsah fenylalaninu v potravinách, nebere formuli, jí zakázaná jídla a nekontroluje si hladinu fenylalaninu v krvi. Ve škole mívají děti potíže s psaním, geometrií a kreslením. Mohou být klienty psychiatra pro úzkostnou poruchu, agarofobii a deprese. V současné době v Evropské unii není jednotný konsenzus o hodnotách fenylalaninu v krvi při léčbě PKU/HPA. Vzhledem k možným komplikacím je obecná tendence doporučené hodnoty Phe v krvi snižovat. Hodnoty fenylalaninu v krvi u zdravého člověka 40–120 µmol/l, tj. do 2,0 mg/dl, označujeme jako normální.

2. Neutrální aminokyseliny s dlouhým řetězcem – LNAA (large neutral amino acids)

U pacientů s PKU byly prokázány snížené hodnoty mozkových neurotransmiterů: dopaminu a serotoninu a s tím spojené zhoršení kognitivních funkcí. L-fenylalanin přestupuje hematoencefalickou bariéru na tzv. L-typu nosiče (LAT1), který sdílí s LNAA (tj. asparagin, cystein, glutamin, histidin, isoleucin, leucin, methionin, serin, threonin, tyrozin, tryptofan a valin). Na podobném typu nosiče přechází Phe z buňky do krve (transport Phe ze střeva). Vysoké hodnoty fenylalaninu v mozku, které při porušování nízkobílkovinné diety lze pozorovat u pacientů s PKU, snižují hodnoty LNAA v mozku u non-adherentních pacientů s PKU.

Principem léčby pomocí LNAA je podávání prekurzorů neurotransmiterů – tyrozinu a tryptofanu – a větvených aminokyselin – valinu, leucinu a isoleucinu. Podávání diety s definovaným množstvím fenylalaninu a LNAA vede k poklesu Phe v krvi a mozku při soutěži o L-typ nosiče [22, 23, 24].

3. Glykomakropetid – GMP

GMP je glykofosfopeptid, složený z 64 aminokyselin a vzniká ze syrovátky při výrobě sýra. Obsahuje 2,5–5 mg Phe/g proteinu. Jeho součástí jsou i LNAA. Neobsahuje všechny esenciální aminokyseliny, takže je nutno jej obohacovat.

Dieta je založena na výrobě potravin a nápojů z GMP. Udává se, že GMP snižuje Phe v krvi asi o 13–14 % [25].

4. Esenciální mastné kyseliny

Tzv. esenciální mastné kyseliny – linolová a alfa-linolenová – se při konzumaci ve správném množství a poměru přeměňují na tzv. mastné kyseliny s dlouhým řetězcem (LC-PUFA): linolová na kyselinu arachidonovou (omega-6-mastné kyseliny) a alfa-linolenová na eikosapentaenovou (EPA) a dokosahexaenovou (DHA) (omega-3-mastné kyseliny). Tyto jsou důležité pro vývoj mozku a sítnice. Zdrojem pro novorozence je mateřské mléko, jehož přísun je u dítěte s PKU omezen. Hlavní zdroje EPA a DHA – mořské ryby – jsou ze stravy pacientů s PKU vyloučeny. Pacienti s PKU konzumují mnoho kyseliny linolové, málo alfa-linolenové a v nesprávném poměru. Hladiny EPA a DHA jsou v séru pacientů s PKU nízké.

Je snaha podávat pacientům s PKU rybí tuk jako zdroj EPA a DHA s cílem zlepšit neurologické funkce. Problémem však zůstává konzumace rybího tuku a směsí aminokyselin bez fenylalaninu stran organoleptických vlastností. Je třeba optimalizovat formu podání a určit přesnou dávku [26].

5. Terapeutická postnatální repopulace jaterních buněk

V roce 1993 byla provedena u pacienta s PKU transplantace jater z jiné indikace [27]. Tím byl nahrazen i deficit PAH v játrech.

V současné době je experimentální možností na myších modelech tzv. terapeutická postnatální repopulace jaterních buněk. Jedná se o parciální hepatektomii s následnou transplantací hepatocytů a regenerací jaterních buněk. Hlavním problémem je procento nahrazených buněk příjemce. Udává se, že 5–10 % dosud nestačí [28].

6. Tetrahydrobiopterin (BH4) responzivní HPA

V roce 2002 popsal Ames 50 genetických chorob charakteru enzymopatie, u kterých lze zvýšením dávky kofaktoru zvýšit aktivitu narušeného enzymu [29]. Jednou z nich je i PKU. V roce 2002 provedla Muntau zátěžový test s BH4 u 38 pacientů s HPA/PKU a podle odpovědi a genotypu poprvé definovala mutace v PAH genu senzitivní na léčbu BH4. Mezi BH4 senzitivní zahrnula P314S, Y417M, V177M, V254A, A300V, E390G, IVS4-5C◊G. Jako potenciálně senzitivní označila: A403V, F39L, D415N, S310Y, R158Q, I65T. Mezi proměnlivě senzitivní zařadila: Y414C, L48S, R261Q, I65V [11]. Práce dalších autorů vedly k popsání dalších BH4 responzivních mutací, které jsou nyní popsány v databázi www.bh4.org/biopku.html. V evropské populaci se jedná asi o 55 % mutací PAH genu, nejčastějšími jsou A403V, R261Q, Y414C. Mechanismem účinku BH4 je tzv. „chaperone-like therapeutic effect“. BH4 zvyšuje termální stabilitu a ochranu proti proteolytické degradaci a oxidační inaktivaci mutovaného proteinu [12].

Ukazuje se, že existují limity pro léčbu pomocí BH4 [30]. Pacienti jsou nejčastěji složenými heterozygoty pro dvě různé mutace. Ve východoevropské populaci nejčastější mutace p.R408W (46 až 73,4 %, nejvíce Polsko a Pobaltí) se v americké populaci vyskytuje v 18 %. Reziduální aktivita PAH in vitro se v tomto případě pohybuje mezi 1,2 ± 1,1 %. Geografické rozložení BH4 mutací ve východní Evropě může být limitem pro léčbu pomocí BH4.

Dalším problémem je i tzv. intraalelový komplementační efekt, kdy PAH může mít reziduální aktivitu in vitro relativně vysokou, ale u konkrétního pacienta in vivo je oproti očekávání hladina Phe v krvi vyšší. Existuje tedy skupina mutací s proměnlivým fenotypem a k léčbě pomocí BH4 je nutno přistupovat individuálně [12].

Princip léčby spočívá ve vytypování pacientů s charakteristickým BH4 responzivním genotypem. Následuje provedení zátěžového testu s BH4 (20 mg/kg). Na našem pracovišti používáme preparát Kuvan^®, sapropterin dihydrochlorid. Pokud dojde k poklesu hladiny Phe v krvi za 24 hodin v testu s BH4 o více než 30 %, je proband označen za tzv. BH4 respondéra.

Léčebný postup zahrnuje podávání BH4 v dávce 5–20 mg/kg tělesné hmotnosti. Cílem léčby je dosáhnout optimální hladinu Phe v krvi pacienta, zvýšit obsah přirozených bílkovin a snížit obsah směsí aminokyselin v dietě, vzácně až dietu opustit.

V současné době je možná léčba dětí od 4 let věku. BH4 nelze užívat v graviditě a laktaci. Tablety se rozpouští ve vodě. Obvykle se podává celá dávka 1krát denně. Nežádoucí účinky BH4 jsou mírné. Jde nejčastěji o bolesti hlavy a břicha, které po úpravě dávky odeznívají [31, 32].

Ve Spojených státech amerických zahrnuje léčebný postup podávání BH4 v dávce 5–20 mg/kg po dobu 4 týdnů. Pokud hladina fenylalaninu v krvi neklesne o více než 30 %, terapie se ukončí. Zátěžový test s BH4 se obvykle neprovádí [33].

7. Enzymová náhradní terapie, „enzyme replacement therapy“ (ERT)

Bohužel většina pacientů s klasickou PKU a někteří s mírnou PKU nereagují na léčbu pomocí BH4. Takoví by mohli profitovat v budoucnosti z enzymové náhradní terapie. Na myších modelech byla použita rekombinantní PEG-PAL (EC 4.3.1.5). Jedná se o fenylalaninamoniaklyázu (PAL) modifikovanou polyetylenglykolem (PEG) ke snížení imunogenicity. Enzym se nachází v mnoha rostlinách, některých plísních a bakteriích. Nevyžaduje exogenní kofaktor. Fenylalanin je alternativně metabolizován na stopové množství amoniaku a kyselinu trans-skořicovou. PEG-PAL se podává 1krát týdně subkutánně. Sleduje se nikoli hladina fenylalaninu v krvi, ale změna barvy srsti myších modelů, neboť fenylalanin je součástí metabolismu melaninu. Dávkování je závislé na pohlaví, lépe reagují samci. Léčba je bohužel reverzibilní [34].

Byla zahájena i klinická studie u pacientů s  PKU pomocí rAvPAL-PEG (http://clinicaltrials. gov). Jedná se o rekombinantní PAL z Anabaena variabilis se dvěma substitucemi, které snižují agregaci a zvyšují stabilitu náhradního enzymu (p.C503S/p.C565S).

8. Genová terapie

V současnosti se jedná o myší modely. Jako vektory slouží adenoviry či lentiviry. Existují rizika a nevýhody této terapie: gen se opravuje ,,pomalu“ a na omezenou dobu. K opravě je nutno použít mnoho vektorů-virů současně s rizikem virémie, zánětu či tumoru jater [28].

9. Léčba poruch tvorby a regenerace BH4 spojených s HPA

Léčba závisí na typu poruchy. Cílem je zvýšit hladinu centrálních neurotransmiterů a snížit hladinu fenylalaninu v krvi. U deficitu GPT cyklohydrolázy I a deficitu 6-pyruvoyltetrahydropteridinsyntázy je hladina Phe v krvi snížena aplikací BH4. Tento princip nefunguje u deficitu dihydropteridinreduktázy. Podává se nízkobílkovinná dieta a kyselina listová.

BH4 nepřestupuje přes hematoencefalickou bariéru a nelze ho použít ke zvýšení hladiny centrálních neurotransmiterů. K léčbě je používán L-dopa a 5-hydroxytryptofan, který je přeměňován na dopamin a serotonin. Používají se společně s karbidopou [14].

Závěr

Dědičné poruchy metabolismu jsou klasickou ukázkou pokroku v lidské medicíně v posledních padesáti letech. Přes výraznou progresi v jejich diagnostice a terapii není osud nemocných zatím vždy příznivý.

HPA/PKU dosud představuje celospolečenský problém na sociální i ekonomické úrovni. Léčba je finančně nákladná a její hodnota neustále narůstá. Fenotyp probanda s PKU/HPA je individuální a podle toho by se mělo přistupovat k jeho léčbě.

Práce byla přednesena v říjnu 2009 jako tzv. přednáška pro odbornou veřejnost v rámci habilitačního řízení autorky na LF MU Brno.

Doc. MUDr. Dagmar Procházková, Ph.D.
Pediatrická klinika
Lékařská fakulta Masarykovy univerzity
a Fakultní nemocnice Brno
Černopolní 9
625 00 Brno
e-mail: prochazkovad@fnbrno.cz