Cirkulující protein tepelného šoku 90 (HSP90) u pacientů s revmatoidní artritidou a axiální spondyloartritidou

Overview

Úvod:
Protein tepelného šoku 90 (HSP90) se podílí na regulaci imunologické a zánětlivé odpovědi a jeho inhibice je úspěšná v léčbě několika zvířecích modelů autoimunitních onemocnění. Role HSP90 u revmatických onemocnění není přesně známa. Cílem naší práce bylo stanovit hladiny HSP90 v séru pacientů s revmatoidní artritidou (RA) a porovnat je s těmi u pacientů s axiální spondyloartritidou (AxSpA) a u zdravých dobrovolníků a zhodnotit asociaci těchto nálezů s aktivitou onemocnění.

Metodika:
HSP90 byl analyzován z periferní krve u 58 pacientů s RA, 68 pacientů s AxSpA a 30 zdravých dobrovolníků. Aktivita nemoci u pacientů s RA byla hodnocena podle DAS28 skóre, u pacientů s AxSPA podle indexu BASDAI. Standardní metodou byla měřena koncentrace sérového C-reaktivního proteinu (CRP), autoprotilátek (revmatoidní faktory, protilátky proti cyklickým citrulinovaným peptidům) a přítomnost antigenu HLA-B27.

Výsledky:
Ačkoliv se mezi skupinami pacientů a zdravých kontrol sérové hladiny HSP90 nelišily, u pacientů s RA léčených anti-TNF terapií byly jeho hodnoty významně nižší v porovnání s jedinci bez této terapie (6,03, 95% CI 3,77–12,00 vs. 8,46, 95% CI 4,26–18.78 ng/ml; p = 0,016). Nebyl pozorován vztah sérového HSP90 s klinickou aktivitou obou nemocí, ale u pacientů s RA byla zjištěna pozitivní korelace cirkulujícího HSP90 se sérovým CRP (p = 0,017). Cirkulující HSP90 neměl vztah k autoprotilátkové aktivitě RA.

Závěr:
Výsledky této práce poukazují na možný význam HSP90 v regulaci zánětlivého procesu u revmatoidní artritidy.

Klíčová slova:
Rheumatoid arthritis, axial spondylarthritis, heat shock proteins, disease activity

Úvod

Revmatoidní artritida (RA) je autoimunitní onemocnění způsobující preferenčně zánět synoviální membrány a následně kloubní poškození. Výsledkem může být těžké strukturální kloubní postižení, funkční hendikep, systémové komplikace a zvýšené riziko kardiovaskulárních onemocnění. RA vzniká na podkladě blíže neznámého narušení tolerance imunitních buněk vůči strukturám vlastních tkání. Jednou z oblastí výzkumu při studiu mechanizmů ztráty autotolerance jsou proteiny tepelného šoku (HSP) (1, 2, 3).

HSP jsou evolučně velmi konzervovanou skupinou peptidů, jejichž úlohou je ochrana prokaryotických i eukaryotických buněk před důsledky různých forem stresové zátěže. Vyskytují se intracelulárně, ale v podmínkách buněčného stresu jsou uvolňovány i do extracelulárního prostředí (4, 5). Mnoho těchto proteinů je vylučováno také konstitutivně, tedy nezávisle na aktivačním stavu buňky. HSP hrají roli tzv. molekulárních chaperonů – molekul, které kontrolují a zabezpečují správnou prostorovou strukturu proteinů a brání vzniku nesprávných vazeb. Vedle základní funkce v udržování buněčné homeostázy a ochraně před vnějšími stresovými faktory hrají některé molekulární chaperony důležitou roli i při transformaci nádorové buňky (6). V onkologii je velký význam přikládán peptidu HSP90, který bývá nazýván nádorovým chaperonem. Inhibitory HSP90 jsou již testovány v různých fázích klinických hodnocení u několika nádorových onemocnění (7).

Vlivem různých stresových situací se může HSP90 uvolňovat extracelulárně a hraje důležitou roli v procesu prezentace antigenu, indukce tvorby cytokinů buňkami monocyto-makrofágového systému, a aktivace vyzrávání dendritických buněk (8, 9, 10). Předpokládá se, že HSP90 hraje kromě nádorových onemocnění významnou roli i v patogenezi některých autoimunitních stavů (2, 11). Výsledky z poslední doby ukazují na pozitivní účinek inhibice HSP90 u experimentálních modelů RA, systémového lupus erythematodes nebo systémové sklerodermie (11, 12, 13). Přirozené inhibitory HSP90 blokují nitrobuněčnou signalizaci nukleárního faktoru (NF-κB) a některých proteinových kináz (např. Janusovy kinázy) a tím vedou k potlačení produkce cytokinů, růstových faktorů a katalytických enzymů makrofágy a dalšími buňkami imunitního systému (11, 14).

V synoviální tkáni RA pacientů byla popsána zvýšená exprese HSP90, který se podílí na regulaci tvorby cytokinů, apoptózy, a tak může podporovat agresivní růst synoviální membrány v místech kloubní destrukce (15). Již v minulosti byly popsány významně vyšší hladiny protilátek proti HSP90 u pacientů s RA (16), nicméně hladiny vlastního HSP90 zkoumány dosud nebyly. Cílem naší práce tak bylo stanovit sérové hladiny HSP90 u pacientů s RA, porovnat je s těmi s axiální spondyloartritidou (AxSpA) a u zdravých dobrovolníků a zhodnotit jejich asociaci s aktivitou onemocnění.

Metodika

Pacienti

V této práci byly studovány tři soubory jedinců, jednalo se o 58 pacientů s RA (diagnóza byla stanovena podle revidovaných ACR 1987 kritérií nebo ACR/EULAR 2010 klasifikačních kritérií), 68 pacientů s AxSpA dle modifikovaných newyorských kritérií nebo dle ASAS kritérií a 30 zdravých dobrovolníků. Pacienti byli rekrutováni z jednoho centra – revmatologické ambulance II. interní kliniky FN u sv. Anny v Brně. Zkušeným revmatologem bylo provedeno klinické revmatologické vyšetření a byl zhodnocen počet oteklých a bolestivých kloubů. Pacienti provedli hodnocení aktivity onemocnění na vizuální analogové škále (VAS). U pacientů s RA byla na základě získaných údajů provedena kalkulace DAS28 skóre. Pacienti s AxSpA provedli hodnocení aktivity onemocnění na VAS a podle standardizovaného indexu BASDAI (Bath Ankylosing Spondylitis Disease Activity Index). Všichni pacienti a zdraví jedinci udělili podepsaný informovaný souhlas s výzkumem v souladu s Helsinskou deklarací.

Laboratorní analýza

U všech jedinců byl nalačno proveden odběr periferní krve z kubitální žíly a následně bylo získáno sérum standardní technikou centrifugace při 3000 otáčkách/min. Byly stanoveny hladiny C-reaktivního proteinu (CRP). Běžnými laboratorními metodami byly u pacientů s RA stanoveny hladiny revmatoidních faktorů (RF) a protilátek proti citrulinovaným proteinům (anti-CCP). U pacientů s AxSpA byl stanoven antigen HLA-B27. Sérová koncentrace humánního HSP90 byla měřena na základě postupů doporučených výrobcem metodou ELISA za použití komerční soupravy ELISA Human HSP90 alpha (eBioscience, San Diego, USA). Analýzy byly vyhodnoceny pomocí ELISA readeru SUNRISE (Tecan, Salcburg, Austria) při vlnové délce 450 nm.

Statistika

Při statistickém zpracování byl při popisu spojitých dat stanovován průměr doplněný o směrodatnou odchylku a medián doplněný 5–95percentilovým rozptylem. Pro porovnání rozdílů mezi soubory statistických dat a výpočtu statistické významnosti byl u spojitých dat použit neparametrický Mann-Whitneyův U test. Za statisticky signifikantní byla považována 5% hladina významnosti. Korelace spojitých proměnných byly počítány pomocí Spearmanova korelačního koeficientu. Pro porovnání nezávislých výběrů byl použit neparametrický Kruskal-Wallisův test.

Výsledky

Pacienti a zdravé kontroly

Demografická data pacientů a zdravých dobrovolníků jsou uvedena v tabulce 1. V hodnoceném souboru pacientů s RA bylo zastoupeno 88 % žen, věkový průměr byl 50 let a délka trvání onemocnění byla průměrně 13 let. Průměrná aktivita onemocnění dle DAS28 byla 3,47. Téměř 90% pacientů mělo pozitivní RF a anti-CCP protilátky. 48 % pacientů bylo aktuálně léčeno některým z anti-TNFα preparátů (n = 28) a 17% tocilizumabem (n = 10). V souboru 68 pacientů s AxSpA bylo 31 % žen, věkový průměr pacientů byl 45 let a délka trvání onemocnění byla průměrně 12 let. Aktivita onemocnění dle BASDAI byla v průměru 39 %. Vysoké aktivity onemocnění podle BASDAI ≥ 40 dosáhlo 47 % pacientů. 88 % pacientů bylo HLA-B27 pozitivních. Diagnóza ankylozující spondylitidy na podkladě newyorských klasifikačních kritérií byla stanovena u 84 % pacientů a neradiografické AxSpA podle ASAS kritérií byla stanovena u 16 % pacientů. Aktuálně bylo léčeno anti-TNF terapií 59 % pacientů s AxSpA. V souboru 30 zdravých jedinců bylo 77 % žen, průměrný věk byl 49 let.

Hsp90 a aktivita onemocnění

Mezi skupinami testovaných jedinců nebyl v hladinách sérového HSP90 významný rozdíl (obr. 1). U pacientů s RA byla tendence k vyšším hladinám HSP90 v porovnání se skupinou zdravých dobrovolníků (p = 0,104) a hladiny sérového HSP90 byly v souboru pacientů s AxSpA srovnatelné se zdravými kontrolami (p = 0,394).

U pacientů s RA pozitivně korelovala koncentrace HSP90 s hladinou CRP (r = 0,313; p = 0,017), kdežto ve skupině AxSpA nebyl vzájemný vztah mezi hladinami HSP90 a laboratorní zánětlivou aktivitou nalezen. U pacientů s RA ale nebyla pozorována korelace mezi hladinami HSP90 a aktivitou onemocnění podle DAS28 (r = -0,026; p = 0,848) a stejně tak nebyla prokázána korelace sérového HSP90 s hladinou CRP (r = 0,104, p = 0,400) nebo aktivitou nemoci podle BASDAI u pacientů s AxSpA (r = -0,023; p = 0,849). Nebyl pozorován rozdíl v hladinách sérového HSP90 mezi AxSpA pacienty bez rentgenového a s rentgenovým průkazem postižení sakroiliakálních kloubů (p = 0,777).

Vliv léčby na hladiny sérového Hsp90

Při rozdělení pacientů s RA na 2 podsoubory podle anti-TNF terapie jsme prokázali statisticky významný rozdíl v hladinách HSP90 mezi těmito dvěma skupinami. Pacienti aktuálně léčení anti-TNF terapií měli nižší hladiny HSP90 (6,03, 95% CI 3,77–12,00 vs. 8,46, 95% CI 4,26–18,78 ng/ml; p = 0,016) (obr. 2). Na rozdíl od souboru pacientů s RA jsme ve skupině pacientů s AxSpA statisticky signifikantní rozdíl v hladinách HSP90 u léčených anti-TNF terapií oproti neléčeným neprokázali (7,34 ± 2,79 vs. 6,35 ± 2,43; p = 0,159).

Diskuse

V této práci jsme pozorovali tendenci k vyšším hladinám sérového HSP90 u pacientů s RA oproti zdravým kontrolám. Sérové hladiny HSP90 byly významně vyšší ve skupině nemocných s RA, kteří nebyli léčení anti-TNF terapií. Přestože sérové hladiny HSP90 nekorelovaly s klinickou aktivitou nemoci, byl pozorován významný vztah HSP90 s mírou laboratorní zánětlivé aktivity RA. Naopak u jedinců s AxSpA nebyl rozdíl v sérových hladinách HSP90 proti zdravým dobrovolníkům, nebyl vztah s aktivitou nemoci, ani nebyl pozorován vliv biologické léčby na hladiny sérového HSP90.

HSP90 je zvýšeně tvořen buňkami RA synoviální tkáně, účastní se regulace přirozeného zániku buněk a může podporovat formaci agresivního pannu (17). Zvýšená exprese HSP90 v podmínkách zánětu stimuluje imunitní buňky a indukuje zvýšenou tvorbu prozánětlivých cytokinů, které jsou důležité v patogenezi RA a dále prodlužují a podporují zánětlivý stav (10, 15). Úlohu HSP90 v patogenezi RA podtrhuje fakt, že u pacientů s těžkou formou RA a plicním postižením byly recentně popsány specifické protilátky proti citrulinovanému HSP90 (18). Ačkoliv sérové hladiny HSP90 nebyly v naší práci významně vyšší proti zdravým kontrolám, byly zvýšené v podskupině jedinců s RA, kteří nebyli léčeni anti-TNF terapií. Lze tak předpokládat, že hladiny HSP90 jsou vyšší u pacientů s vyšší zánětlivou aktivitou, což podtrhuje průkaz pozitivní korelace mezi sérovým HSP90 a CRP. V souladu s našimi výsledky bylo nedávno prokázáno, že lokální exprese HSP90 ve střevní sliznici je zvýšena u nemocných s ulcerózní kolitidou a významně se snižuje po úspěšné léčbě (19). Nicméně se zdá, že ačkoliv sérové hladiny HSP90 mají vztah k laboratorní zánětlivé aktivitě nemoci, neodráží klinickou ani autoprotilátkovou aktivitu nemoci.

Na druhé straně jsme nepozorovali zvýšené hladiny HSP90 u jedinců s AxSpA a nebyl pozorován vztah k aktivitě nemoci, ani k sérové hladině CRP. Biologická léčba blokující TNF neměla u jedinců s AxSpA na hladinu HSP90 žádný vliv. Lze tak usuzovat, že HSP90 nemá v průběhu AxSpA podstatnou roli. Jedním z možných vysvětlení pro rozdílné hladiny HSP90 u RA a AxSpA je i odlišný charakter těchto dvou onemocnění. Počínaje odlišným genetickým podkladem obou nemocí, opačnou distribucí mezi pohlavími (u RA jsou častěji postiženy ženy oproti vyššímu výskytu AxSpA u mužů), přes přítomnost autoprotilátek u RA, zatímco u AxSpA nejsou specifické autoprotilátky prokazovány, až po rozdílné typy predominantního strukturálního postižení (u RA je typickým projevem osteoresorpce v podobě erozí, u AxSpA je dominantní osteoprodukce v podobě osifikací). Je tedy možné, že na základě rozdílnosti patofyziologických mechanismů vedoucích k odlišným imunologickým i klinickým projevům obou onemocnění je i souvislost HSP90 s těmito chorobami rozdílná. Nelze také vyloučit, že se HSP90 na patogenezi AxSpA podílí lokálně, aniž by docházelo k jeho nadměrnému uvolňování do krevního oběhu. Tuto hypotézu může podpořit zjištění u nemocných s bulózním pemfigoidem, kde zvýšená exprese HSP90 v postižené kůži není provázena zvýšenou sérovou koncentrací, naopak systémové hladiny HSP90 byly ještě nižší než u zdravých kontrol (20). Nevýhodou výše uvedené práce proti naší studii je významně menší počet studovaných pacientů. Na druhé straně je nevýhodou naší práce průřezový charakter studie a fakt, že HSP90 nebyl studován u pacientů s časnou RA, kteří dosud nebyli vystaveni vlivu žádné imunosupresivní léčby, která by potenciálně mohla hladiny HSP90 ovlivnit. To vše je předmětem našeho dalšího výzkumu. Dalším faktorem, který mohl přispět k těmto výsledkům, je relativně nízká aktivita nemoci ve studovaném souboru pacientů s RA a fakt, že pacienti s AxSpA mají obecně nižší laboratorní zánětlivou aktivitu nemoci ve srovnání s jedinci s RA.

Závěrem lze konstatovat, že jsme prokázali pozitivní asociaci mezi cirkulujícím HSP90 a sérovou hladinou CRP u pacientů s RA, ale ne u jedinců s AxSpA. Dále jsme zjistili, že u RA může mít vliv na hladiny systémového HSP90 biologická léčba anti-TNFα, která vede k jejich snížení. V současné době lze spíše než jako biomarker aktivity nemoci považovat HSP90 za molekulu, která může navodit prolomení imunitní tolerance (15) anebo se může stát cílem léčby autoimunitních onemocnění (11).

Poděkování: RNDr. M. Goldbergové za statistické zpracování dat.

Tato práce vznikla za podpory koncepčního rozvoje MZČR pro výzkumné organizace 023728

Adresa pro korespondenci:

MUDr. Leona Procházková , Ph.D.

Revmatologie, II. interní klinika, FN u sv. Anny Brno

Pekařská 53

656 91 Brno

e-mail: leona.prochazkova@fnusa.cz