Význam vybraných biomakerů v hodnocení a patogenezi osteoartrózy a revmatoidní artritidy. Souhrn doktorské dizertační práce

Overview

Revmatoidní artritida (RA) a osteoartróza (OA) představují nejčastější svalově kloubní onemocnění, postihují diartrodiální klouby a často vedou k disabilitě. Diagnóza obou chorob je podložena konvenčním rentgenovým vyšetřením. Ireverzibilní rentgenové změny se často vyskytují až v pozdější fázi onemocnění, což platí zejména pro OA. Současný výzkum postupně odhaluje potenciální využití molekulárních markerů od pochopení patogeneze onemocnění až k předpovědi progrese či monitorování efektu léčby. Molekulární markery by měly odrážet poškození kloubu, zánět nebo imunitní odpověď. Cílem této dizertační práce byla analýza vybraných biomarkerů v séru, synoviální tekutině a synoviální tkáni u pacientů s RA a OA a vyhodnocení jejich diagnostické a prediktivní hodnoty, včetně patogenetického významu. U pacientů s OA kolenních kloubů jsme prokázali zvýšené hladiny sérového pentosidinu, což mělo prediktivní význam progrese choroby ve smyslu zúžení kloubní štěrbiny. Pozitivní korelace mezi pentosidinem a oligomerním proteinem chrupavkové matrix (COMP) v synoviální tekutině navíc poukázala na pentosidin jako na jeden z dalších potenciálních biomarkerů OA. Hladiny COMP v séru byly srovnatelné u pacientů s OA, RA i zdravé kontrolní skupiny. V naší práci COMP v séru nevykazoval prediktivní význam progrese OA kolenních kloubů, ani žádnou asociaci se zánětlivými ukazateli u pacientů s OA i RA. Zvýšené koncentrace COMP v synoviální tekutině pacientů s OA oproti RA ukazovaly na druhé straně na odlišný patogenetický mechanismus degradace chrupavky během OA. Vztah mezi modulátorem metabolismu kosti osteoprotegerinem (OPG) a ukazatelem kostního obratu deoxypyridinolinem v séru u pacientů s OA může představovat rovnováhu mezi ochrannou úlohou OPG ve vztahu ke kosti a vlastní resorpcí kosti. U pacientů s RA jsme neprokázali asociaci zvýšených koncentrací pentosidinu s CRP ani s aktivitou onemocnění. Pozitivní vztah mezi COMP a protilátkami proti cyklickému citrulinovanému peptidu (anti-CCP) v séru, COMP a OPG v synoviální tekutině může odrážet asociaci systémové degradace kloubní chrupavky a imunitní odpovědi, lokální destrukci kloubní chrupavky a metabolismu kosti u RA. Snížené hladiny OPG u pacientů s RA mohou být odpovědné za vznik periartikulární osteoporózy, kostních destrukcí a mohou tak naznačovat nedostatečnou ochrannou úlohu OPG ve smyslu kostních ztrát u chronických zánětlivých chorob. Dále jsem prokázali zvýšenou expresi proteinu indukujícího metastázy – S100A4 RA synoviální tkání v místech kloubní invaze. Navíc exogenní S100A4 ovlivňoval expresi a tvorbu několika matrixových metaloproteináz (MMP) synoviálními fibroblasty. Protože mezi RA a malignitami existuje podobnost, můžeme předpokládat, že S100A4 přispívá k agresivnímu, invazivnímu a tumorům podobnému chování RA synoviální tkáně. Na závěr lze shrnout, že pentosidin může představovat nový biochemický marker progrese OA. Zvýšená koncentrace COMP v synoviální tekutině u pacientů s OA může být odrazem rozdílné patogeneze destrukce kloubní chrupavky u RA a OA. Vztah mezi ukazateli destrukce chrupavky, kosti a imunitní odpovědi u RA poukazuje na komplexní charakter onemocnění. S100A4 může představovat novou molekulu, která může být součásti patogeneze RA.

Klíčová slova:
revmatoidní artritida, osteoartróza, pentosidin, oligomerní protein chrupavkové matrix, osteoprotegerin, protilátky proti cyklickému citrulinovanému peptidu, S100A4

ÚVOD

Osteoartróza (OA) a revmatoidní artritida (RA) patří mezi nejčastější kloubní onemocnění. Téměř 15 % dospělé populace je postiženo OA a přibližně 0,5–1 % populace RA (1). Přestože se jedná o onemocnění způsobující úbytek kloubní chrupavky, patogenetický mechanismus tohoto je odlišný. OA je heterogenní onemocnění postihující především váhonosné klouby, páteř a drobné klouby rukou. Na patogenezi OA se podílí kloub jako celek, dochází k narušenému metabolismu kloubní chrupavky, subchondrální kosti (2), ovlivněny jsou také měkké tkáně včetně kloubní výstelky a úponů. Vedle ztráty chrupavky vzniká subchondrální kostní skleróza a tvoří se osteofyty. U RA je naopak kostní tkáň postižena destrukcí na rentgenu se typicky projevující kostními usuracemi. RA se manifestuje často extraartikulárně, počínaje revmatoidními uzly a konče život ohrožující vaskulitidou. V současné době je za klíčovou tkáň vzniku OA považována kloubní chrupavka a tkáň kloubní výstelky je pokládána za primární místo vzniku RA. Synoviální membrána kloubu během RA podléhá hyperplazii, je infiltrována zánětlivými buňkami, což vede k tvorbě agresivní vaskularizované granulační tkáně (panu) (3).

Diagnóza obou onemocnění se opírá o kombinaci klinického a rentgenového nálezu. Stanovení diagnózy RA navíc napomáhá autoimunitní aktivita v podobě přítomnosti specifických protilátek. Rentgenový snímek často vypovídá o poměrně pokročilém stadiu choroby. Mezi mírou obtíží a rentgenovým nálezem často existuje významná diskrepance. Při sledování progrese choroby je třeba opakovat rentgenová vyšetření s odstupem několika měsíců, často i let. Tento poměrně dlouhý interval by bylo vhodné zkrátit, k čemuž by měly sloužit nové biologické markery. Stanovením biomarkerů bychom měli být schopni zachytit časná stadia onemocnění nebo včas určit prognózu dalšího vývoje choroby (4). Rozvíjející se výzkum v oblasti biomarkerů by měl dále přispět k jejich využití pro diagnostiku, hodnocení efektu léčby a pochopení patogeneze obou kloubních onemocnění.

V klinické praxi a při hodnocení lékových studií existuje v současné době několik prediktivních ukazatelů rentgenové progrese. Při hodnocení RA jde jednak o klinické a funkční známky aktivity choroby, laboratorní ukazatele zánětu, genetické markery a rentgenový nález. Nicméně tyto ukazatele mají svá omezení a nízkou senzitivitu. Kostní eroze a destrukce chrupavky mohou totiž probíhat nezávisle na zánětlivém postižení kloubního aparátu a mohou progredovat i navzdory nízké aktivitě nemoci a klinickému zlepšení (5). Mezi nové potenciální markery pro hodnocení RA patří některé nové autoprotilátky, zánětlivé parametry, ukazatele kloubního metabolismu a dědičné faktory. Při hodnocení progrese OA je stále zlatým standardem rentgenový snímek a měření zúžení kloubní štěrbiny. Experimentálně se začínají uplatňovat také různé modifikace magnetické rezonance. Jako náhradní ukazatele slouží biologické markery OA, které by měly reflektovat metabolismus kloubní tkáně, tj. hyalinní chrupavky, kosti nebo synoviální membrány.

Hypotéze této práce se opírala o předpoklad, že molekulární markery odrážejí patologický stav kloubního aparátu. Cílem tak bylo stanovení vybraných potenciálních biologických markerů v séru a synoviální tekutině u pacientů s OA a RA, zhodnocení jejich vztahu k zánětlivým parametrům, klinické aktivitě choroby a morfologickému postižení kloubů. Jednalo se o ukazatele metabolického obratu chrupavky, kosti, markery imunologické aktivity a parametry systémového a lokálního zánětu. Zásadním cílem bylo zhodnocení jejich diagnostického a prognostického potenciálu. Dalším cílem bylo bližší pochopení patogenetických mechanismů na podkladě vzájemných vztahů mezi jednotlivými markery, které odrážejí odlišné metabolické pochody. Vybrané markery jsme hodnotili v longitudinální studii a v řadě průřezových prací. Dalším cílem bylo zjistit, je-li protein podporující tvorbu metastáz S100A4 (metastasin) tvořen RA synoviální tkání a má-li význam v patogenezi RA s ohledem na tvorbu enzymů degradujících extracelulární matrix.

PACIENTI A METODY

Pacienti a kontrolní skupina

Do této práce byli zařazeni pacienti s revmatoidní artritidou a osteoartrózou kolenních kloubů splňující daná kritéria onemocnění podle Americké revmatologické asociace. Kontrolní skupinu tvořili zdraví jedinci. V longitudinální studii bylo celkově vyšetřeno 89 pacientů s OA kolenních kloubů. V průřezových studiích byl vyšetřen různý počet pacientů (n=32–48).

Synoviální tkáň a synoviální fibroblasty

Synoviální tkáň byla získána během operačního zákroku od pacientů s RA, OA a od zdravých jedinců po traumatické události (Ortopedická klinika, Schulthess Hospital Zürich). Synoviální fibroblasty použité k experimentu na tkáňových kulturách byly získány ze 4–8 pasáže. Synoviální fibroblasty byly stimulovány oligomerní frakcí proteinu S100A4. Koncentrace S100A4 v experimentu v závislosti na dávce byla 0.1 až 4,0 μg/ml. Pro experimenty v závislosti na čase (6, 12 a 24 hodin) byla použita koncentrace 0,5 μg/ml. Buňky byly sesbírány a mRNA izolována v každém z uvedených časů. Buněčný supernatant byl získán za 24 hodin po stimulaci proteinem S100A4.

Měření vybraných biologických markerů

Tělní tekutiny (sérum a synoviální tekutina) a supernatant byly po odběru skladovány při teplotě -70 ľC. Většina biomarkerů byla měřena pomocí ELISA; COMP sendvičovou metodou ELISA, matrixové metaloproteinázy pomocí komerčně dostupných kitů (Biotrak Amersham Biosciences Company), OPG a solubilní RANKL pomocí sendvičové ELISA (Biomedica, Wienna). Absorpce byla měřena při 450 nm (Dynex Technologies). Pentosidin byl měřen pomocí vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC).

Imunohistochemie

Protein S100A4 byl analyzován imunohistochemicky na řezech synoviální tkáně zalitých v parafínu. Po odstranění parafínu z tkáně a blokování nespecifických vazeb byla použita myší monoklonální protilátka anti-S100A4 v ředění 1 : 300. Inkubace tkáně s myší biotynilovanou protilátkou (1:1000) a streptavidin alkalickou fosfatázou byla následována barvením tkáňových řezů pomocí DAKO Fast Red Substrátu (DAKO Corporation, Carpinteria, USA). Myší specifický IgG byl použit jako negativní kontrola.

Real-time polymerázová řetězová reakce (PCR)

Ribonukleová kyselina (RNK) byla izolována ze synoviálních fibroblastů za použití Rneasy kitu (Qiagen) podle standardního protokolu. Komplementární DNA (cDNA) byla získána reverzní transkripcí za použití Random hexameru a MultiScribe reverzní transkriptázy (Applied Biosystems). Komplementární DNA byla skladována při -20 °C do zpracování. Real-time PCR byla provedena pomocí přístroje ABI Prism 7700 Sequence Detection system (Applied Biosystems). K reakci byly použity předem připravené komerčně dostupné primery a próby pro MMP-1, MMP-3, MMP-9, MMP-13 a MMP-14. Amplifikační reakce byla následována 40 cykly dvoustupňového PCR, denaturací, ztužovací a extenzivní reakcí.

Inhibice NF-κB signální dráhy

Syntetický peptid NF-κB SN50 (Cell-Permeable Inhibitor Peptide, Calbiochem) tlumící translokaci aktivního komplexu NF-κB do jádra byl použit k inhibici signální dráhy NF-κB. NF-B SN50 byl přidán k synoviálním fibroblastům 30 minut před stimulací proteinem S100A4. Pro zhodnocení funkční aktivity NF-κB byla použita transfekce synoviálních fibroblastů DNA vektorem IBM pCMV (BD Bioscience) za použití nukleofekčního kitu (Amaxa, Switzerland). Synoviální fibroblasty byly stimulovány po dobu 6 hodin proteinem S100A4. MMP-1 a MMP-3 byly měřeny pomocí Rel-time PCR.

Klinické a rentgenové vyšetření

Aktivita obou chorob byla hodnocena pomocí speciálních dotazníků. Pro RA byl použit dotazník DAS 28 (Disease Activity Score), který se vypočítá podle vzorce 0,56 x √ (počet bolestivých kloubů) + 0,28 x √ (počet oteklých kloubů) + 0,7 ln (FW) + 0,012 x (pacientovo globální hodnocení stavu) (6). Funkční aktivita RA byla určena podle dotazníku zdravotního stavu HAQ (Health Activity Questionnaire) (7). Bolest a funkční stav u pacientů s OA byly hodnoceny pomocí indexu WOMAC (Western Ontario and McMaster Universities osteoarthritis index) (8).

Rentgenové snímky u pacientů s OA byly provedeny v předozadní projekci podle standardního protokolu s koleny v plné extenzi a patami u sebe. Při hodnocení průřezových studií byly vyhodnoceny podle Kellgrena a Lawrence (9). Pro longitudinální sledování progrese choroby byly snímky hodnoceny modifikací metody podle Lequesena a šířka kloubní štěrbiny byla měřena v nejužším místě mediálního kompartmentu tibiofemorálního kloubu podle Altmanova atlasu (10). Snímky rukou a nohou u pacientů s RA byly provedeny v předozadní a šikmé projekci a byly hodnoceny podle Steinbrockera (11).

Statistické zpracování

Všechny hodnoty byly vyjádřeny jako průměr nebo medián ± směrodatná odchylka. Mann-Whitney U-test byl použit pro porovnání dvou nepárových hodnot, Wilcoxonův test pro porovnání dvou párových hodnot a metoda lineární regrese při analýze vztahu mezi dvěma proměnnými a statistická významnost byla vyjádřena Spearmanovým koeficientem. Analýza rozptylu byla použita pro adaptaci hodnoty sledovaných veličin k více proměnným. Hodnoty p menší než 0,05 byly považovány za statisticky významné.

VÝSLEDKY

Pentosidin u pacientů s osteoartrózou a revmatoidní artritidou

Do průřezové studie bylo zařazeno 38 pacientů s OA kolenních kloubů (13 mužů a 25 žen, průměrný věk 64,1 let). Ve skupině pacientů s RA bylo 39 jedinců (7 mužů a 32 žen, průměrný věk 53,0 let). Kontrolní skupinu tvořilo 38 jedinců bez anamnézy kloubních obtíží (15 mužů a 23 žen, průměrný věk 58,3 let). Do longitudinální studie se z celkového počtu 100 pacientů ke konečnému vyšetření po 2 letech dostavilo 89 pacientů (tab. 1). Jednalo se o pacienty s relativně časným začátkem choroby, jehož délka nepřesáhla 3 roky. Jedinci s diabetem mellitus či renální insuficiencí nebyli zařazeni do žádné ze studií.

Zvýšená hladina pentosidinu u pacientů s osteoartrózou kolenních kloubů

U pacientů s OA kolenních kloubů jsme v porovnání s kontrolní skupinou pozorovali významně vyšší sérové hladiny pentosidinu (132,1 ± 56,2 vs 97,7 ± 24,0 nmol/l, p<0,01) (obr. 1A). Pentosidin byl vyšší v séru než v synoviální tekutině (132,1 ± 56,2 vs 70,7 ± 22,8, p<0,001) a mezi koncentracemi pentosidinu v obou kompartmentech byl statisticky významný vztah (r² = 0,56, p<0,001).

Vztah pentosidinu k ukazateli destrukce kloubní chrupavky oligomernímu proteinu chrupavkové matrix (COMP) u pacientů s osteoartrózou kolenních kloubů

Zjistili jsme statisticky významný vztah mezi pentosidinem a COMP v synoviální tekutině (r²=0,11, p<0,05) (obr. 1B), přičemž tento vztah platil i pro pentosidin v séru a COMP v synoviální tekutině (r²=0,12, p<,05). Nepozorovali jsme žádný vztah mezi COMP a pentosidinem v séru (r²=0,01).

Vztah pentosidinu ke klinickému stavu a rentgenovému stadiu osteoartrózy

U jedinců s OA kolenních kloubů i kontrolní skupiny jsme nepozorovali závislost pentosidinu na věku. Pentosidin nevykazoval vztah k míře kloubní bolesti, ani ke klinickému stavu (dotazník WOMAC). Neshledali jsme významný rozdíl mezi pentosidinem u pacientů s unilaterální či bilaterální OA kolenních kloubů, hladiny pentosidinu nebyly také ovlivněny rentgenovým stadiem OA.

Vztah pentosidinu k rentgenové progresi osteoartrózy kolenních kloubů

Během 2 let studie došlo k průměrnému zúžení kloubní štěrbiny o 0,4 ± 0,79 mm. Koncentrace pentosidinu byly na začátku studie vyšší v porovnání s kontrolní skupinou (143,4 ± 99,0 vs 115,3 ± 34,3 ± nmol/l, p=0,04). Vstupní (r=0,30, p<0,05) i konečné (r=0,34, p<0,05) hodnoty pentosidinu měly významný vztah k progresi choroby ve smyslu zúžení kloubní štěrbiny (obr. 2).

Zvýšená hladina pentosidinu u pacientů s revmatoidní artritidou

Hodnoty pentosidinu byly významně vyšší u pacientů s RA oproti kontrolní skupině (156,0 ± 124,0 vs 97,7 ± 24,0 nmol/l, p<0,02). Pentosidin byl významně vyšší v séru než v synoviální tekutině (156,0 ± 124,0 vs 83,1 ± 68,6 nmol/l, p<0,001) a jako u pacientů s OA byla pozorována významná korelace pentosidinu mezi oběma tělními tekutinami (r²=0,9, p<0,001). Pentosidin v séru a synoviální tekutině se statisticky příliš nelišil mezi pacienty s RA a OA. Koncentrace pentosidinu v tělních tekutinách nebyla ovlivněna věkem ani délkou choroby.

Vztah pentosidinu ke klinické aktivitě a rentgenovému postižení u pacientů s revmatoidní artritidou

Koncentrace pentosidinu v séru korelovaly se sedimentací erytrocytů (r²=0,44, p<0,03), nikoli však s CRP (r=0,04). Neshledali jsme korelaci pentosidinu s leukocyty v synoviální tekutině (r=0,02). Pentosidin v séru (r=0,06) i synoviální tekutině (r=0,007) nekoreloval s koncentracemi autoprotilátek anti-CCP v daných tělních tekutinách. Nebyla také zjištěna asociace mezi aktivitou choroby (DAS28, HAQ) a koncentracemi pentosidinu v séru či synoviální tekutině. Rentgenové stadium RA také nemělo vliv na hladinu pentosidinu v tělních tekutinách.

OLIGOMERNÍ PROTEIN CHRUPAVKOVÉ MATRIX (COMP) U PACIENTŮ S OSTEOARTRÓZOU A REVMATOIDNÍ ARTRITIDOU

Do této průřezové studie bylo zařazeno 32 pacientů s aktivní RA (6 mužů a 26 žen, průměrný věk 51,3 let) a 48 pacientů s OA kolenních kloubů (13 mužů a 25 žen, průměrný věk 66,1 let).

COMP v séru a synoviální tekutině

U jedinců s OA a RA i zdravých kontrol vzrůstaly významně sérové koncentrace COMP s věkem (p<0,001). Koncentrace COMP v séru adaptované k věku se nelišily mezi pacienty s RA (3,8 ± 1,0 μg/ml), OA (3,8 ± 1,3 μg/ml) a kontrolami (3,5 ± 1,4 μg/ml). COMP v séru byl vyšší u jedinců mužského pohlaví ve všech sledovaných skupinách, nicméně pozorovaný rozdíl nebyl statisticky významný. Koncentrace COMP byly významně vyšší v synoviální tekutině než v séru u pacientů s RA (19,1 ± 12,6 vs 3,3 ± 1,0 μg/ml, p<0,001) i u pacientů s OA (32,5 ± 11,4 vs 3,9 ± 1,3 μg/ml, p<0,001). Koncentrace COMP v synoviální tekutině u OA pacientů byla významně vyšší než u RA pacientů (p<0,001). Hladina COMP v synoviální tekutině nebyla ovlivněna věkem ani pohlavím jedinců v žádné ze sledovaných skupin.

Vztah COMP k aktivitě a rentgenovému stadiu choroby

Průměrná koncentrace CRP u pacientů s RA byla významně vyšší než u pacientů s OA (35,8 ± 37,1 vs 5,8 ± 9,3 mg/ml, p<0,001). Průměrná hodnota sedimentace erytrocytů u pacientů s RA dosahovala 38,4 ± 19,7 mm/h. Počet leukocytů v synoviální tekutině byl vyšší u RA pacientů oproti OA pacientům (7581 ± 6066 vs 402 ± 1045 v 1 ml). Žádný z těchto ukazatelů zánětlivé aktivity nevykazoval vztah ke COMP v tělních tekutinách. Aktivita choroby RA pacientů hodnocená dle HAQ či DAS 28 a OA pacientů hodnocená dle WOMAC neměla také vliv na hladiny COMP v tělních tekutinách. Stejně tak nebyly hodnoty COMP ovlivněny časnějším začátkem choroby u RA pacientů (do 4 roků) oproti pacientům s delším průběhem choroby (více než 5 let). Sérové hodnoty COMP u RA a OA pacientů nevykazovaly žádný vztah k rentgenovému stadiu choroby. Totéž platilo pro COMP v synoviální tekutině OA pacientů. U pacientů s RA byla nalezena korelace sérového COMP s koncentrací anti-CCP protilátek (p=0,05).

LIGAND PRO RECEPTOR AKTIVUJÍCÍ TRANSKRIPČNÍ FAKTOR NF-κB A OSTEOPROTEGERIN U PACIENTŮ S OSTEOARTRÓZOU A REVMATOIDNÍ ARTRITIDOU

Do této průřezové studie bylo zařazeno 45 pacientů s RA (9 mužů a 36 žen, průměrný věk 54,0 let) a 46 pacientů s OA kolenních kloubů (15 mužů a 31 žen, průměrný věk 66,0 let).

Ligand pro receptor aktivující transkripční faktor NF-κB (RANKL)

Sérové koncentrace solubilního RANKL byly u většiny jedinců (více než 80 %) pod detekčním limitem (<0,4 pmol/l). Koncentrace RANKL v synoviální tekutině byly vyšší oproti příslušným hodnotám v séru a nelišily se mezi skupinami RA a OA (3,36 ± 2,7 vs 3,41 ± 1,4 pmol/l). Nezávisle na diagnóze byl zjištěn negativní vztah RANKL k CRP (p<0,05). RANKL v synoviální tekutině nevykazoval žádný vztah k aktivitě RA.

Osteoprotegerin

Koncentrace OPG byla významně vyšší v synoviální tekutině než v séru (p<0,001) a v obou tělních tekutinách OPG navzájem koreloval u sledovaných skupin (p<0,005). OPG v synoviální tekutině pacientů s OA byl významně vyšší než u pacientům s RA (8,4 ± 2,9 vs 3,9 ± 2,4 pmol/l, p<0,001). Totéž platilo i pro OPG v séru (2,40,8 vs 1,9 ± 1,0 pmol/l, p<0,03) (obr. 3). Poměr OPG:RANKL v synoviální tekutině byl významně menší u pacientů s RA než u pacientům s OA (p<0,001). Koncentrace OPG v synoviální tekutině a séru se nelišila mezi jednotlivými rentgenovými stadii OA. U pacientů s OA vzrůstala koncentrace sérového OPG s věkem (p<0,03). OPG v synoviální tekutině u pacientů s OA a v obou tělních tekutinách u pacientů s RA nebyl věkem ovlivněn.

U pacientů s RA velmi významně korelovaly hodnoty OPG a COMP v synoviální tekutině (p=0,005). To neplatilo u pacientů s OA, kde OPG v séru významně koreloval s ukazatelem resorpce kosti deoxypyridinolinem (p=0,05) a jistý trend byl pozorován také pro pyridinolin (p=0,06), což platilo i po adaptaci OPG k věku. Tento pozitivní vztah mezi OPG a markery metabolického obratu kosti nebyl pozorován u pacientů s RA.

VÝZNAM S100A4 V PATOGENEZI REVMATOIDNÍ ARTRITIDY

Exprese proteinu S100A4 synoviální tkání

S100A4 protein byl exprimován všemi RA synoviálními tkáněmi (10/10), byl lokalizován v oblastech synoviální intimy, intersticia a kolem synoviálních cév. Navíc byl přítomen v oblastech agresivního panu u 4/4 pacientů s RA. S100A4 se nacházel i v extracelulárním prostoru. Podle morfologické charakteristiky buněk tvoří S100A4 synoviální fibroblasty i makrofágy. Synoviální tkáň pacientů s OA (5/7) vykazovala podobný charakter barvení na protein S100A4, nicméně jeho intenzita byla slabší a extracelulární lokalizace S100A4 nebyla pozorována. U kontrolní synoviální tkáně jedinců po traumatu (3/3) nebyla tvorba S100A4 pozorována vůbec.

S100A4 zvyšuje expresi MMP mRNA synoviálními fibroblasty

Po stimulaci RA synoviálních fibroblastů proteinem S100A4 byla pozorována zvýšená exprese MMP-1 a MMP-3 (obr. 4A), dále MMP-9 a MMP-13 mRNA již po 6 hodinách stimulace v závislosti na dávce proteinu. Mírná indukce exprese MMP byla pozorována při stimulaci RA synoviálních fibroblastů nejnižší koncentrací S100A4 (0,1 μg/ml) –2,9x, 2,3x, 1,3x, a 1,1x vzestup). Při vyšších koncentracích S100A4 byla pozorována významně vyšší exprese MMP. Pro nejvyšší použitou koncentraci S100A4 (4,0 μg/ml) byl pozorován 5,8x, 5,6x, 4,7x, a 5,2x vzestup exprese MMP. Na druhé straně nedošlo ke zvýšené expresi MMP-14 mRNA. Podobné výsledky byly pozorovány u synoviálních fibroblastů OA pacientů. Při stimulaci RA synoviálních fibroblastů v závislosti na čase (6, 12 a 24 hodin) jsme použili 0,5 μg/ml S100A4 proteinu. Indukce exprese MMP-3 mRNA (obr. 4B) byla zjištěna ve všech časových intervalech s nejvyššími hodnotami po 6 hodinách (4,8x, 4,2x, a 3,7x vzestup). Po stimulaci proteinem S100A4 byla zvýšena také exprese MMP-1, MMP-9 ± MMP-13, nicméně s různou kinetikou. Významná korelace byla nalezena mezi indukcí exprese MMP-1 a MMP-3 mRNA (p<0,05).

Uvolnění MMP ze stimulovaných synoviálních fibroblastů

Zvýšená exprese MMP na úrovni mRNA byla potvrzena na proteinové úrovni. Došlo ke zvýšenému uvolnění proteinů MMP-1 (180 %, p<0,03) a MMP-3 (160 %, p<0,05) do buněčného supernatantu z RA synoviálních fibroblastů stimulovaných proteinem S100A4 po 24 hodinách.

Význam NF-κB signální dráhy v indukci tvorby MMP synoviálními fibroblasty stimulovanými S100A4

Význam transkripčního faktoru NF-κB v indukci MMP synoviálními fibroblasty byl určen pomocí NF-κB SN50 – inhibitoru translokace aktivního komplexu NF-κB do jádra. RA synoviální fibroblasty předem inkubované s molekulou NF-κB SN50 vykazovaly sníženou expresi genů pro MMP-1 a MMP-3 (26 ± 17 a 55 ± 23 % pokles). Funkční aktivita NF-κB potvrzena transfekcí synoviálních fibroblastů vektorem IκBαM pCMV. Transfekované synoviální fibroblasty vykazovaly také sníženou indukci exprese MMP-1 a MMP-3 (34 ± 14 a 46 ± 3 % pokles) oproti fibroblastům transfekovaným prázdným vektorem.

DISKUSE

Pentosidin a osteoartróza

U pacientů s OA kolenních kloubů jsme zjistili zvýšené sérové hladiny pentosidinu v porovnání se zdravou skupinou dobrovolníků. Pozorovali jsme významnou asociaci pentosidinu s ukazatelem metabolického obratu kloubní chrupavky COMP v synoviální tekutině (a). Navíc jsme u jedinců s časným začátkem choroby pozorovali pozitivní vztah sérového pentosidinu s progresí zúžení kloubní štěrbiny po 2 letech sledování (b).

Osteoprotegerin a ligand pro receptor aktivující NF-κB u pacientů s osteoartrózou a revmatoidní artritidou

Osteoprotegerin a RANKL sehrávají významnou úlohu při regulaci kostního obratu a vedle kostních buněk či synoviálních fibroblastů se na jejich tvorbě podílí řada imunokompetentních buněk. To je důvod proč jsme pozorovali vyšší hladiny těchto molekul v místech probíhajícího zánětu, tj. v synoviální tekutině. Nižší koncentrace OPG v tělních tekutinách u pacientů s RA svědčí pro teorii nedostatečné protektivní úlohy OPG před kostní resorpcí u systémového zánětlivého onemocnění.

V porovnání se zdravými a stejně starými ženami byly vyšší sérové koncentrace OPG pozorovány u žen s postmenopauzální osteoporózou (30). U těchto pacientek byly koncentrace OPG vyšší u žen, které měly nižší denzitu kostního minerálu a navíc korelovaly s močovým pyridinolinem a deoxypyridinolinem. Korelaci s markery kostní resorpce jsme pozorovali také v naší práci u pacientů s OA kolenních kloubů. Důležitou charakteristikou RA je lokální úbytek kostní denzity a vznik kostních erozí, což je provázeno nižší tvorbou OPG synoviální tkání (31). V souladu s tímto jsme zjistili nižší koncentraci OPG v synoviální tekutině u pacientů s RA a navíc korelaci OPG s COMP v synoviální tekutině. Jedná se o dosud nepopsaný moment, který je pravděpodobně odrazem asociace lokální destrukce hyalinní chrupavky a metabolismu kosti u pacientů s RA. Tento vztah nebyl pozorován u pacientů s OA, což je pravděpodobným vysvětlením odlišného patogenetického mechanismu postižení kloubních struktur u obou chorob.

V porovnání s nadměrnou tvorbou RANKL lymfocyty a makrofágy v RA synoviální tkáni (32) jsme nepozorovali vyšší koncentraci volného RANKL v synoviální tekutině u pacientů s aktivní RA oproti jedincům s OA. Dá se tak předpokládat, že na lokální osteoresorpci se nepodílí volný, ale na buňky vázaný RANKL. Nízké koncentrace měřeného volného RANKL, zejména nedetekovatelné hodnoty v séru, mohou být způsobeny vazbou RANKL na OPG in vivo. ELISA metoda pro detekci RANKL totiž využívá princip potažených jamek molekulou OPG, což umožní vazbu volného RANKL, ale ne RANKL vázaného na OPG.

Nižší lokální produkce markeru regulace metabolického obratu kosti OPG v synoviální tekutině představuje sníženou ochranu zánětem postižené tkáně před destrukcí kosti. Navíc, významný vztah OPG s ukazatelem destrukce chrupavky COMP svědčí pro asociaci lokálního postižení kosti a hyalinní chrupavky u aktivní RA.

Význam S100A4 v patogenezi revmatoidní artritidy

Jako první jsme prokázali intracelulární i extracelulární přítomnost proteinu S100A4 v synoviální tkáni RA pacientů. Protein S100A4 byl přítomen i v oblastech agresivní synoviální tkáně (panu). Dále jsme zjistili, že extracelulární S100A4 indukuje zvýšenou tvorbu několika MMP synoviálními fibroblasty, což ukazuje na význam S100A4 v procesu kloubní destrukce během RA (e, f).

Na různých typech tumorů byly zjištěny účinky intracelulárního i extracelulárního proteinu S100A4 podporující tvorbu metastáz (33, 34). Invazivní chování buněk je nejdůležitějším znakem zakládání metastáz, přispívá k neovaskularizaci a šíření nádorových buněk. Na tomto procesu se významně podílí zvýšená tvorba MMP. Enzymy degradující matrix jsou hlavními strůjci kloubní destrukce u RA. Hlavním zdrojem těchto enzymů jsou fibroblasty synoviální intimy a agresivního panu (35). Protože jsme pozorovali extracelulární lokalizaci S100A4, lze uvažovat o významu secernovaného S100A4 u RA. Objevili jsme, že exogenní S100A4 stimuluje tvorbu několika MMP synoviálními fibroblasty, což bylo nedávno pozorováno též u endotelových a nádorových buněk (34). Invazivní chování agresivních synoviálních fibroblastů tak připomíná zvýšený metastatický potenciál nádorových buněk v přítomnosti S100A4.

NF-κB představuje klíčový nitrobuněčný regulátor zánětu a jeho tvorba u RA synoviální tkáně byla pozorována v místech panu, kde dochází k destrukci kloubu (35). Při inhibici NF-κB signální dráhy byla o polovinu redukována syntéza MMP-3 synoviálními fibroblasty stimulovanými proteinem S100A4. Úloha NF-κB při expresi MMP fibroblasty stimulovanými proteinem S100A4 je v souladu s nedávnou prací na endotelových buňkách, které vedle synoviálních fibroblastů či makrofágů mohou také produkovat S100A4 a podporovat angiogenezi popsanou u tumorů (34, 37). Zvýšená vaskularizace RA synoviální tkáně představuje důležitý moment choroby, a tak lze spekulovat, že S100A4 tvořený endotelovými buňky cév synoviální tkáně může podporovat zánětlivou aktivitu RA. Byla popsána interakce S100A4 s tumor supresorovým proteinem p53, což může ovlivnit délku buněčného přežívání (38). Nedávno bylo popsáno, že zvýšená exprese S100A4 působí jako negativní regulátor mineralizace extracelulární matrix. Podílí se na tom ovlivnění diferenciace osteoblastů a potlačení tvorby osteoblastických genů (39). Jestli protein S100A4 ovlivňuje regulaci apoptózy či snižuje kostní kvalitu u RA by mělo být předmětem dalších výzkumů.

ZÁVĚR

V této disertační práce se pojednává o využití vybraných biomarkerů při hodnocení OA a RA. Dále řeší vzájemné vztahy těchto markerů, což přispívá k bližšímu pochopení patogeneze obou chorob. Z vybraných markerů jsme hodnotili ukazatele oxidačního stresu a zánětlivé aktivity (pentosidin, CRP), parametry degradace kloubní chrupavky (COMP), metabolického obratu kosti (OPG, RANKL, deoxypyridinolin, pyridinolin), markery imunity (anti-CCP) a protein asociovaný s metastázami S100A4.

U pacientů s OA kolenních kloubů jsme prokázali zvýšené hladiny pentosidinu a jejich pozitivní vztah k ukazateli destrukce kloubní chrupavky COMP v synoviální tekutině. Navíc jsme zjistili prediktivní význam pentosidinu při hodnocení progrese OA kolenních kloubů u časné formy OA, kdy jedinci s časným začátkem choroby a s vyššími koncentracemi pentosidinu vykazovali rychlejší rentgenovou progresi postiženého kloubu. Naše výsledky tak poukazují na asociaci oxidačního zatížení organismu a degradaci kloubní chrupavky, a staví pentosidin mezi několik nových potenciálních biologických markerů OA. Vyšší rozptyl sérových hodnot pentosidinu u pacientů s OA a u kontrolní skupiny však představuje limitující faktor pro diagnostické využití pentosidinu. V porovnání s pacienty s RA jsme u pacientů s OA kolenních kloubů pozorovali vyšší koncentraci COMP v synoviální tekutině, což pravděpodobně odráží odlišný patogenetický mechanismus lokálně probíhající degradace a metabolismu artrotické chrupavky. Sérové hladiny COMP odráží systémový charakter metabolismu hyalinní chrupavky, nikoli postižení jednoho kloubu. Na úrovni jednotlivců navíc koncentrace COMP neodliší zdravé jedince od pacientů s kloubním postižením. Pozitivní vztah regulační molekuly kostního obratu OPG s deoxypyridinolinem v séru u pacientů s OA poukazuje na určitou rovnováhu protektivního mechanismu kostního metabolismu a resorpce kosti. Nepodařilo se nám prokázat, že by vyšší hodnoty OPG měly vztah k rentgenovému stadiu u pacientů s OA.

U pacientů s RA jsme v souladu s předchozími studiemi pozorovali vyšší hladiny pentosidinu v porovnání se zdravými kontrolami, nicméně jen nevýznamné zvýšení oproti pacientům s OA. Navíc jsme nepotvrdili pozitivní asociaci pentosidinu s klinickou aktivitou choroby, ani s markerem destrukce chrupavky COMP či imunologickým prediktivním ukazatelem anti-CCP. Naopak pozitivní vztah sérového COMP s anti-CCP u pacientů s RA poukazuje na možnou asociaci imunitní aktivity a destruktivního postižení kloubní tkáně. Pacienti s RA měli v synoviální tekutině i v séru nízké hladiny regulační molekuly metabolického obratu kosti OPG, což je v souladu s pozorovaným úbytkem kostní hmoty a destrukcí kloubu. Pozitivní korelace COMP a OPG v synoviální tekutině může ukazovat na přirozenou asociaci lokálních změn destrukce kloubní chrupavky a kosti. Dále jsme zjistili zvýšenou tvorbu proteinu stimulujícího tvorbu metastáz S100A4 buňkami synoviální tkáně u pacientů s RA, zejména pak v oblastech agresivního panu. Tento objev poukazuje v určitém ohledu na podobnost RA s nádorovými chorobami. Zjistili jsme, že obdobně jako nádorové buňky, synoviální fibroblasty vystavené vlivu proteinu S100A4 zvýšeně tvoří enzymy degradující extracelulární matrix (MMP), což představuje jeden z důležitých momentů patogeneze revmatoidní artritidy. Tvorba proteinu S100A4 RA synoviální tkání a uplatnění S100A4 v patogenezi této choroby přispělo k rozšíření spektra prozánětlivých mediátorů podobných cytokinům, které mohou nalézt uplatnění v hodnocení či budoucí léčbě RA.

MUDr. Ladislav Šenolt

Revmatologický ústav

Na Slupi 4

128 50 Praha 2

e-mail: seno@revma.cz