Solubilní Toll-like receptor 2 v pupečníkové krvi u těhotenství komplikovaných předčasným odtokem plodové vody

Overview

Cíl studie:
Stanovit hladiny solubilního Toll-like receptoru 2 (sTLR2) v pupečníkové krvi novorozenců pacientek s těhotenstvím komplikovaným předčasným odtokem plodové vody (PPROM) za přítomnosti nebo absence histologické chorioamnionitidy (HCA) a funisitidy.

Typ studie:
Retrospektivní studie.

Název a sídlo pracoviště:
Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta a Fakultní nemocnice v Hradci Králové, Ústav klinické imunologie a alergologie, Porodnická a gynekologická klinika.

Metodika:
Do studie bylo zařazeno 86 žen s PPROM mezi 24. a 36. týdnem gestačního stáří. Vzorky pupečníkové krve byly odebrány z podvázaného pupečníku ihned po porodu novorozence. Vzorky placenty, plodových obalů a pupečníku byly vyšetřeny na přítomnost zánětlivých změn. Koncentrace sTLR2 v pupečníkové krvi novorozenců byla měřena metodou ELISA.

Výsledky:
U žen s HCA nebyla zaznamenána rozdílná koncentrace sTLR2 v pupečníkové krvi ve srovnání s ženami bez HCA (s HCA: medián 7,6 ng/mL, interkvartilový rozsah [IQR] 5,1 – 12,3 vs. bez HCA: medián 8,0 ng/mL, IQR 6,0 – 9,4; p = 0,79). Nebyl nalezen rozdíl v koncentraci sTLR2 v pupečníkové krvi mezi skupinami pacientek s funisitidou a bez funisitidy (s funisitidou: medián 7,2 ng/mL,IQR 5,5 – 22,3 vs. bez funisitidy: medián 7,9 ng/mL, IQR 5,2 – 10,5; p = 0,31).

Závěr:
Hladiny sTLR2 v pupečníkové krvi nejsou ovlivněny přítomností HCA nebo funisitidy u těhotenství komplikovaných PPROM.

Klíčová slova:
funisitida – histologická chorioamnionitida – předčasný odtok plodové vody – sTLR2 – vrozená imunita

ÚVOD

Předčasný porod je závažnou komplikací moderního porodnictví. Jde o porod před 37. týdnem gestačního věku. V Evropě postihuje zhruba 5 % všech těhotenství, ve Spojených státech amerických je jeho četnost více než dvojnásobná a v některých afrických státech šplhá výskyt předčasných porodů k 20 % [5]. Předčasný odtok plodové vody (preterm premature rupture of membranes, PPROM) je definován jako porušení celistvosti plodových obalů s následným odtokem plodové vody, který předchází minimálně 2 hodiny před nástupem děložních kontrakcí. Nastává mezi 24. – 37. týdnem těhotenství [12]. Faktor, který je silně asociován s PPROM, je intrauterinní infekce. Nejen samotný výskyt a působení patogenů na okolní tkáně matky a plodu, ale i narušení imunologické homeostázy může zapříčinit mnoho obtíží v těhotenství [43]. Po mikrobiální invazi amniální dutiny dochází k migraci imunokompetentních buněk do místa napadení a k zahájení obranné odpovědi [19]. Mateřská odezva na infekci koreluje s histologickou chorioamnionitidou (histological chorioamnionitis, HCA), která je definována histologickým průkazem zánětlivých změn v placentě. Pacientky s HCA jsou asymptomatické, bez horečky, bolestí v podbřišku, mateřské či fetální tachykardie [50]. Odezvou plodu na expozici patogenních agens může být v některých případech aktivace jeho imunitního systému, tzv. syndrom fetální zánětlivé odpovědi (fetal inflammatory response syndrom, FIRS) [14]. Jako morfologický korelát FIRS se někdy udává funisitida. Histologický nález funisitidy lze stanovit post partum. Zánět pupečníku je spojen se zvýšeným rizikem poškození plodu a novorozence, například mozkovou obrnou [16] nebo chronickým plicním onemocněním [8].

Klíčovou úlohu při průniku mikrobiální infekce má vrozená imunita, která u člověka zaujímá první obrannou linii. Jde o archaický způsob obrany, který je fylogeneticky konzervovaný na molekulární úrovni [28]. Porozumění jejímu vlivu na zdárný průběh těhotenství se jeví jako esenciální [26]. Součástí přirozené imunity je rodina Toll-like receptorů (Toll-like receptors, TLRs), jež hraje zásadní roli při rozpoznání a eliminaci patogenů. Nyní již známe deset lidských TLRs [52]. TLRs jsou transmembránové glykoproteiny rozpoznávající tzv. signály nebezpečí či poškození [1]. Molekulové vzory potenciálně nebezpečných mikroorganismů (např. lipopolysacharid) jsou TLRs schopné identifikovat jako vzory PAMP (pathogen associated molecular patterns) [41]. Stejně tak TLRs rozeznávají endogenní molekuly (damage-associated molecular patterns, DAMPs) uvolněné z aktivovaných či nekrotických buněk a extracelulárního matrix pod vlivem probíhajícího zánětu a infekce [39]. Jde například o stresový protein HSP70 nebo kyselinu hyaluronovou [37, 55]. Aby nedocházelo k hyperaktivaci imunitního systému při infekci, a tím možnému poškození orgánů a chronickým zánětům, musí být odpověď přísně regulována [33]. Jedním z mechanismů kontroly TLR aktivace je tvorba solubilní formy TLR (sTLR). Tato forma kompetuje o přirozené ligandy s povrchovými TLRs [40]. Solubilní forma je zřejmě produkována dvěma způsoby. První možností je pohlcení povrchových TLRs zpět do buňky, kde jsou TLRs posttranslačně modifikovány na solubilní formu a poté uskladněny v intracelulárním váčku. V případě potřeby je buňka uvolní do prostoru [10, 31]. Druhým způsobem vzniká sTLR odštěpením TLR z povrchu buňky proteázami (tzv. shedding) [58].

TLR2 zaujímá speciální místo mezi TLRs. Jeho schopnost rozeznávat patogeny je dobře probádaná a zahrnuje širokou škálu bakterií, virů, plísní, mykobakterií a parazitů [1]. Mnohostrannost v rozpoznávání ligandů je umožněna schopností TLR2 vytvářet heterodimery s TLR1 nebo TLR6 [53, 54]. TLR2 má svoji solubilní formu (sTLR2), která byla nalezena v plazmě, v mateřském mléku, ve slinách a v plodové vodě [10, 31, 51]. Hlavní důvody, proč jsme se rozhodli stanovit hladiny sTLR2 v pupečníkové krvi, byly dva. Za prvé, TLR2 je schopen rozeznat PAMP grampozitivních bakterií, jakými jsou peptidoglykany, kyselina lipo-teichoová [47] nebo lipoproteiny/lipopeptidy [30]. Právě grampozitivní bakterie se nejčastěji vyskytují při mikrobiální invazi amniální dutiny a aktivují TLR2 [57]. Za druhé, v dřívější studii byl potvrzen signifikantní nárůst sTLR2 v plodové vodě u pacientek s HCA oproti pacientkám bez HCA [3, 19]. sTLR2 v plodové vodě se ukázal být nadějným markerem HCA. Proto nás zajímalo, zda obdobná závislost platí i v pupečníkové krvi. Vzhledem k neinvazivnímu způsobu odběru pupečníkové krve by šlo o velmi šetrnou metodu, bez rizik pro matku a dítě. Cílem naší studie bylo stanovit koncentraci sTLR2 v pupečníkové krvi novorozence a určit vztah k těhotenstvím komplikovaným PPROM a HCA nebo funisitidou.

SOUBOR PACIENTEK A METODIKA

Soubor pacientek

Studie byla schválena Etickou komisí FN Hradec Králové. Všechny pacientky podepsaly informovaný souhlas. Celkem bylo odebráno 86 vzorků pupečníkové krve na porodním sále Porodnické a gynekologické kliniky Fakultní nemocnice Hradec Králové v období od června 2008 do září 2010 v gestačním týdnu 24+0 až 36+6. Ze studie byly vyloučeny pacientky s vícečetným těhotenstvím, s komplikovaným těhotenstvím (hypertenze, preeklampsie, diabetes mellitus, nemoci štítné žlázy a jiné) a/nebo s vrozenými vývojovými vadami plodu či známkami neprospívání plodu (váha plodu o 10 % nižší pro dané gestační stáří, určeno ultrazvukovým vyšetřením). Vaginální výtok a známky hypoxie plodu byly rovněž důvody k vyřazení ze studie.

PPROM byl definován jako porušení integrity plodových obalů s následným odtokem plodové vody, který předcházel minimálně 2 hodiny před nástupem děložních kontrakcí. PPROM byl potvrzen Temešváryho testem a pozitivním testem na insulin-like growth factor-binding protein (ACTIM PROM test, Medix Biochemica, Kauniainen, Finland) v poševním hlenu.

Sběr vzorků

Vzorky pupečníkové krve byly odebírány z podvázaného pupečníku novorozence před porodem placenty. Sběr pupečníkové krve proběhl pomocí uzavřeného vakuového systému pro odběr krve. Následně byly vzorky centrifugovány a jejich supernatanty uschovány v polypropylenových zkumavkách při -70 °C až do analýzy. Po porodu byly placentární tkáně fixovány v 10% neutrálně pufrovaném formalinu. Standardně byly po fixaci odebírány k dalšímu zpracování do parafinových bloků minimálně dva vzorky z placenty, dva vzorky z plodových obalů a jeden vzorek z pupečníku. Řezy byly obarveny hematoxylin-eozinem.

Diagnostika HCA a funisitidy

Diagnóza HCA byla stanovena podle klasifikace Salafia et al. [26], která hodnotí intenzitu (stupně – grade 1–4) infiltrace neutrofily v konkrétních kompartmentech placenty, pupečníku a plodových obalů. HCA byla definována jako: grade 1–4 ve tkáních amnia a/nebo grade 3–4 ve tkáních choria a deciduy a/nebo grade 3–4 v choriové ploténce a/nebo grade 1–4 ve tkáních pupečníku. Funisitida byla diagnostikována při nálezu v pupečníku – grade 1–4. Vzorky byly vyhodnoceny jedním patologem, který nebyl obeznámen s klinikou pacientek.

Stanovení sTLR2 v pupečníkové krvi

Koncentrace sTLR2 byla zjišťována metodou ELISA. Postup byl prováděn podle pokynů výrobce komerčního kitu pro lidský sTLR2 (Uscn Life Science & Technology Company, China). Detekční limit pro sTLR2 byl 0,098 ng/mL. Absorbance byla měřena na Multiskan RC ELISA reader (Thermo Fischer Scientific, USA) při vlnové délce 450 nm.

Statistika

Demografické a klinické charakteristiky znaků s kontinuální variabilitou se hodnotily parametrickým t-testem (uvedeny jako průměr ± smě-rodatná odchylka) nebo neparametrickým Wilcoxonovým testem (uvedeny jako medián [interkvartilový rozsah]). Znaky s kategorickou binární variabilitou byly hodnoceny neparametrickým Fisherovým exaktním testem a byly uvedeny jako počet (%). Normalita dat byla testována Kolmogorovovým-Smirnovovým testem a χ2 testem. Vzhledem k tomu, že koncentrace sTLR2 v pupečníkové krvi nesplňovaly normální distribuci, byl pro jejich vyhodnocení použit neparametrický Wilcoxonův test a výsledky prezentovány jako medián (interkvartilový rozsah).Za statisticky významné byly považovány rozdíly s p < 0,05. Všechny p-hodnoty byly zpracovány v softwarovém programu MedCalc (MedCalc Software, Mariakerke, Belgie).

VÝSLEDKY

Demografická a klinická charakteristika

Demografické a klinické charakteristiky žen a novorozenců jsou uvedeny v tabulce 1. Pacientky s PPROM byly rozděleny na základě přítomnosti nebo absence HCA a funisitidy. Z celkových 86 pacientek byla HCA diagnostikována u 61 (71 %) žen a funisitida u 18 (21 %) žen. Medián gestačního stáří pacientek s PPROM a HCA při porodu byl významně nižší než u pacientek s PPROM bez HCA. Rovněž medián gestačního stáří pacientek s PPROM a funisitidou při porodu byl signifikantně nižší než u žen bez známek zánětu pupečníku. Hmotnost novorozenců pacientek s PPROM a HCA a pacientek s PPROM a funisitidou byla výrazně nižší než hmotnost novorozenců žen bez HCA a bez funisitidy.

Koncentrace sTLR2 v pupečníkové krvi ve vztahu k HCA

Hladiny sTLR2 se nalezly ve všech testovaných vzorcích pupečníkové krve. Mediány koncentrace sTLR2 byly u pacientek s PPROM a HCA a u pa-cientek s PPROM bez HCA naměřeny na podobných hodnotách (s HCA: medián 7,6 ng/mL, IQR 5,1 – 12,3 vs. bez HCA: medián 8,0 ng/mL, IQR 6,0 – 9,4; p = 0,79). Statistická významnost nebyla zjištěna (graf 1, tab. 2).

Koncentrace sTLR2 v pupečníkové krvi ve vztahu k funisitidě

Při porovnávání výsledků ve skupině pacientek s PPROM a funisitidou se skupinou pacientek s PPROM bez funisitidy nebyla nalezena statistická významnost (s funisitidou: medián 7,2 ng/mL, IQR 5,5 – 22,3 vs. bez funisitidy: medián 7,9 ng/mL, IQR 5,2 – 10,5; p = 0,31) (graf 2, tab. 2).

DISKUSE

Předčasný porod se stává velmi častým diskutovaným problémem. Jeho management je mnohdy zkomplikován přítomností HCA a funisitidy, které se podílejí na zvýšení perinatální morbidity a mortality novorozenců. Při obraně proti mikroorganismům zastávají jednu z nejdůležitějších rolí mechanismy vrozené imunity. Rozpoznání patogenů receptory PRR na povrchu buněk je první krok k jejich eliminaci. Jako jeden z regulátorů imunitní odpovědi slouží rozpustné formy receptorů, jež brání nepřiměřené zánětové reakci.

Existují důkazy, že vstup patogenů a aktivace signální cesty TLR může spustit buněčné a cytokinové aktivity, které vedou k předčasnému porodu [18, 36]. Nejčastěji dochází k navýšení hladin IL-6, IL-8, prostaglandinů, cyklooxygenázy a oxytocinových receptorů na buňkách trofoblastu [34, 49]. Již dříve naše skupina zkoumala koncentrace mnoha prozánětových molekul v plodové vodě a v pupečníkové krvi. Zde se ukázala být velmi slibná molekula solubilního vychytávacího receptoru pro hemoglobin (sCD163). Hodnoty sCD163 v plodové vodě a zároveň v pupečníkové krvi byly výrazně navýšené u pacientek s přítomnou HCA a funisitidou ve srovnání se skupinou bez zánětlivých změn [21, 24]. Mohlo by jít o potenciální marker HCA a funisitidy. V nedávné době jsme se zaměřili na koncentrace sTLR v plodové vodě v závislosti na přítomnosti nebo absenci HCA a funisitidy u žen s PPROM. Zjistili jsme, že koncentrace sTLR2 v plodové vodě významně stoupá u pacientek s PPROM s mikrobiální invazí amniální dutiny a s potvrzeným zánětem ve srovnání s pacientkami bez invaze patogenů a bez zánětu [19, 20]. Proto jsme se rozhodli k vyšetření solubilní formy Toll-like receptoru 2 v pupečníkové krvi novorozenců ve vztahu k HCA a funisitidě.

Jde o prioritní studii, jelikož koncentrace sTLR2 v pupečníkové krvi nebyla zatím nikdy zkoumána. Ve všech testovaných vzorcích byl sTLR2 přítomen. Naše výsledky nepotvrdily signifikantní nárůst koncentrace sTLR2 v pupečníkové krvi u pacientek s PPROM a s HCA nebo funisitidou oproti ženám bez HCA nebo bez funisitidy. Mediány koncentrace sTLR2 byly u všech skupin naměřeny na podobných hodnotách. Limitací naší práce je menší počet pacientek, zejména ve skupině žen s PPROM a funisitidou.

Pokud chceme hledat vysvětlení, proč se nám podařilo objevit elevaci hladin sTLR2 v plodové vodě v závislosti na zánětu, a v pupečníkové krvi nikoliv, musíme si nejprve zodpovědět otázku, jaké buňky sTLR2 uvolňují do prostoru. TLR2 je v době těhotenství u žen exprimován nejen na imunitních buňkách, tj. na dendritických buňkách, monocytech, placentálních makrofázích a děložních NK buňkách, ale i na buňkách ne-imunitní povahy. TLR2 je vyjádřen na buňkách amnionu, chorion-deciduální membrány nebo také na buňkách trofoblastu [27, 38]. Bylo prokázáno, že v případě diagnostikované HCA docházelo k výraznému nárůstu vyjádření TLR2 na povrchu buněk chorioamnionu [27]. Buněčné zdroje sTLR2 v plodové vodě mohou být velmi rozmanité, na rozdíl od pupečníkové krve, kde jsou zřejmě hlavním producentem sTLR monocyty [48]. Jak se ukázalo, vyjádření TLR2 na monocytech je poměrně stálé. Nebyl nalezen zásadní rozdíl v expresi TLR2 na monocytech u novorozenců mezi 25. až 42. týdnem porodu [44]. Určité zastoupení má TLR2 i na povrchu fetálních NK buněk, ale to je v porovnání s NK buňkami dospělého jedince zanedbatelné [33]. O vyjádření TLR2 na povrchu endoteliálních buněk je uveřejněno mnoho prací, ovšem o expresi TLR2 na endotelu cév v pupečníku se zmiňuje pouze jedna čínská studie. Ta potvrdila pouze genovou expresi mRNA molekuly TLR2 v endoteliálních buňkách pupečníkové žíly [32].

Výskyt bakterií je pro zahájení imunitní odpovědi esenciální. U žen s předčasným porodem se nejčastěji v plodové vodě vyskytovaly bakterie Mycoplasma hominis, Ureaplasma spp., Chlamydia trachomatis, Streptococcus mitis či Fusobacterium nucleatum [9]. Bylo objeveno, že exprese TLR2 na amniálních a deciduálních buňkách se signifikantně zvýšila při bakteriální či virové infekci u předčasných porodů ve srovnání s plodovými obaly bez infekce [15]. Egawa a kol. zkoumali přítomnost bakterií Ureaplasma urealyticum a Mycoplasma hominis v pupečníku u předčasně narozených dětí a pouze u 10 % z analyzovaných vzorků byla přítomna alespoň jedna z bakterií. Zároveň u těchto 10 % novorozenců byla potvrzena funisitida [11]. K invazi patogenů do pupečníku a rozsáhlé imunitní reakci dochází zřejmě jen v těch nejzazších případech. Tím by se mohla vysvětlit absence změn v koncentraci sTLR2 v pupečníkové krvi.

V neposlední řadě je potřeba zmínit možný vliv dávek kortikosteroidů na hladiny sTLR2 v pupečníkové krvi. Kortikosteroidy se využívají v porodnictví k indukci maturace plicní tkáně u nezralých plodů. Podávají se pacientkám v gestačním týdnu mladším než 33+6 [7]. Patří ovšem mezi imunosupresivní léky, jež potlačují produkci mnoha aktivačních molekul v imunitních buňkách a mohly by mít potenciální vliv na uvolňování sTLR2 [6]. K vyloučení vlivu dávek kortikosteroidů na koncentrace sTLR v pupečníkové krvi, byla provedena přídatná analýza dat (není zobrazeno). Nebyly nalezeny významné rozdíly v hladinách sTLR2 mezi pacientkami, kterým byly kortikosteroidy podány (gestační stáří ≤ 33+6), a těmi, které kortikosteroidy nedostaly (gestační stáří ≥ 34+0). Tato analýza porovnávala skupinu s HCA a skupinu bez přítomnosti HCA. Ve skupině s potvrzenou funisitidou analýza nemohla být provedena pro nízký počet vzorků.

Ač se nám nepodařilo potvrdit naši hypotézu o zvýšené koncentraci sTLR2 v pupečníkové krvi u žen postižených HCA a funisitidou, existují jiné markery, které by bylo možné použít k identifikaci zánětlivých změn. Například již zmíněný sCD163 nebo IL-6 a IL-8. Všechny tyto molekuly byly signifikantně zvýšené v pupečníkové krvi u pacientek s HCA a funisitidou oproti ženám bez známek zánětu [2, 24]. Hledání dalších ukazatelů zánětu u pacientek s PPROM touto neinvazivní metodou může napomoci včasné léčebné intervenci.

ZÁVĚR

Námi studovaný biomarker sTLR2 se vyskytoval ve všech analyzovaných vzorcích pupečníkové krve. Neprokázali jsme však změny v koncentraci sTLR2 v pupečníkové krvi při porovnání jeho hladin u žen s HCA nebo funisitidou.

Práce byla podpořena projektem „PRVOUK“, P37/10, Univerzity Karlovy v Praze, Lékařské fakulty UK v Hradci Králové a grantem NT13461-4/2012 IGA MZČR.

Mgr. Eva Mitášová

Ústav klinické imunologie a alergologie

Univerzita Karlova v Praze

LF a FN Hradec Králové

Sokolská 581

500 05 Hradec Králové

e-mail: flidrova@lfhk.cuni.cz