Optimalizace vyšetření protilátek proti trombocytům u těhotných a žen po porodu

Cíl studie:
Optimalizovat vyšetření trombocytárních protilátek v rámci imunohematologického vyšetření těhotných žen a žen krátce po porodu.

Typ studie:
Retrospektivní analýza.

Název a sídlo pracoviště:
Krevní centrum FN Ostrava, Lékařská fakulta OSU.

Metodika:
Analýza a vlastní zkušenosti při zavádění testů pro vyšetření trombocytárních protilátek na sledovaném souboru pacientek.

Závěr:
Postup vyšetření trombocytárních protilátek nově zaváděných v letech 2008-2009 kombinací základních a speciálních vyšetření se v praxi pracoviště Krevního centra FN Ostrava ukazuje jako optimální pro záchyt neonatální trombocytopenie.

Klíčová slova:
trombocytární protilátky, antigeny trombocytů, neonatální aloimunní trombocytopenie.

ÚVOD

Neonatální (fetomaternální) aloimunní trombocytopenie (FMAIT, NAITP) se rozvíjí v důsledku inkompatibility v HPA (Human Platelet Antigens) systému antigenů, mezi matkou a plodem, podobně jako u hemolytického onemocnění novorozenců [18]. Incidence NAITP se udává okolo 1 na 1500 porodů [4, 8, 9]. Přestože většinou dochází k aloimunizaci až při porodu, může dojít k manifestaci již v prvním těhotenství [11, 15]. NAITP je nejčastěji vyvoláno přítomností anti-HPA-1a protilátky (v kavkazké populaci 75–95 % případů), zbylých 5–25 % je vyvoláno ostatními anti-HPA, především anti-HPA-5b, -3a, -15. Byly publikovány i případy, kdy NAITP indukovaly specifické anti-HLA protilátky [4, 5, 9, 10, 11, 12, 15, 16, 19]. Trombocytopenie způsobená přítomností těchto protilátek spontánně odeznívá obvykle do 4 týdnů [15]. Nejzávažnější komplikaci představuje intrakraniální krvácení u plodu, které se vyskytuje přibližně 1 na 20 000 porodů (zejména u anti-HPA-1a, -3a pozitivních žen) [5, 9, 10]. V naší populaci jsou přibližně 2 % HPA-1a negativních žen (genotyp HPA-1b/1b), asi u 10 % z nich dochází k aloimunizaci, tj. tvorbě anti-HPA-1a protilátky [10].

SOUBOR PACIENTŮ A METODIKA

V rámci požadavků na imunohematologické vyšetření u žen krátce po porodu nebo během těhotenství jsou v Krevním centru FNO vyšetřovány protilátky proti trombocytům a leukocytům. Ročně je provedeno přibližně 300 vyšetření. V případě pozitivity ve screeningovém testu zachytávajícím protilátky proti trombocytům není možné určit, o jaký typ protilátky jde (aloimunní anti-HLA, anti-HPA, auto-/panreaktivní trombocytární protilátky, eventuálně falešnou pozitivitu). Pro rozlišení a identifikaci aloimunních HLA a HPA protilátek jsou v ČR k dispozici komerční testy – PAK 12 nebo kity MACE (MACE 1 a MACE 2) od firmy GTI (GTI Diagnostics, Brookfield, USA). V Krevním centru FNO jsme v praxi vyzkoušeli oba typy testů.

V roce 2007 bylo testem MACE 1 a MACE2 vyšetřeno 22 vybraných gravidních žen pozitivních ve screeningových testech zachycujících trombocytární protilátky (ELISA – enzym linked immunosorbent assay, DIFT – destičkový imunofluerescenční test) včetně jedné ženy po porodu indikované k vyšetření na základě trombocytopenie u novorozence. ELISA test PAK 12 je využíván rutinně od konce roku 2009. Dosud jím bylo vyšetřeno 28 gravidních nebo žen po porodu, pozitivních ve screeningovém vyšetření zachycujícím trombocytární protilátky (ELISA, DIFT) a 6 žen po porodu indikovaných k vyšetření na základě trombocytopenie u novorozence.

Při sérii analýz jak testem MACE, tak PAK12 byla identifikována anti-HPA-1a protilátka, nejčastější příčina FMAIT (vždy jedenkrát). Vyšetření bylo doplněno genotypizací HPA znaků. V roce 2008 a 2009, před zavedením rutinního testování kitem PAK 12, byla u gravidních s pozitivním DIFT (případně zároveň ELISA či LCT testem) prováděna křížová zkouška (cross-match) mezi trombocyty otce a sérem matky, doplněná genotypizací HPA znaků obou rodičů. Kombinace vyšetření anti-HLA/-HPA protilátek testem PAK 12 s HPA genotypizací matky případně dítěte či otce, která byla zavedena ke konci roku 2009, napomáhá při potvrzení či vyloučení přítomnosti specifických aloimunních HPA protilátek, z nichž anti- HPA-1a a anti HPA-5b jsou nejčastější příčinou neonatální aloimunní trombocytopenie u plodu [1, 9, 14].

Pro screening protilátek byly provedeny tyto testy:

LCT – lymfocytotoxický test (standardizovaný podle National Institutes of Health – NIH, detekce komplement dependentních anti-HLA protilátek), ELISA – enzym linked immuno sorbent assay (zachycuje protilátky proti trombocytům aktivovaným adhezí), DIFT – destičkový imunofluorescenční test (zachycuje všechny protilátky reagující s trombocyty) [20], GAT – granuloaglutinační test (detekuje protilátky proti granulocytům).

K identifikaci protilátek byly testovány kity:

PAK 12 (ELISA technika, GTI Diagnostics, Brookfield, USA) – odlišení HLA protilátek od anti-HPA a/nebo identifikace specifických trombocytárních protilátek (anti-HPA-1,-3,-4a, -5); MACE 1 a MACE 2 (Modified Antigen Capture ELISA, GTI Diagnostics, Brookfield, USA) – odlišení anti-HLA protilátek od anti-HPA anebo identifikace specifických trombocytárních protilátek.

Jako doplňující vyšetření byla provedena HPA-1, -2, -3, -4, -5, -15 genotypizace metodou PCR-SSP (polymerázová řetězová reakce se sekvenčně specifickými primery) kity firmy BAG Health Care (Německo) a křížová zkouška (DIFT cross-match) mezi sérem/plazmou matky a trombocyty otce.

VÝSLEDKY

V roce 2007 bylo testem MACE 1 a MACE 2 vyšetřeno 22 gravidních žen vybraných pro pozitivitu při screeningu v destičkovém imunofluorescenčním testu a/nebo pro pozitivitu v trombocytovém ELISA testu či LCT. MACE 1 a MACE 2 jsou testy technicky a časově náročnější než test PAK12 vzhledem k nutnosti přípravy testovacích trombocytů (součástí kitu jsou lyofilizované trombocyty určené pouze pro pozitivní a negativní kontrolu). MACE 1 je určen pro záchyt HLA protilátek proti antigenům I. třídy a k detekci protilátek proti GPIIa/IIIa, respektive HPA epitopům nacházejícím se na těchto glykoproteinech (tj. HPA-1, HPA-3, HPA-4, HPA-7, HPA.9, HPA-10). MACE 2 je určen pro identifikaci protilátek proti GPIa/IIa (epitop HPA-5), IV a IIb/IX (epitop HPA-2). Pro testování byla připravena suspenze trombocytů od dárců krve (krevní skupina 0), u kterých byla provedena HPA genotypizace (směs trombocytů obsahovala tyto znaky: HPA-1a/a, HPA-2a/a, HPA-3a/b, HPA-4a/a, HPA-5a/a, HPA-15a/b). Výsledky testování kitem MACE 1 a MACE 2 jsou uvedeny v tabulce 1.

V roce 2008–2010 bylo provedeno celkem 1057 screeningových vyšetření (viz tab. 2). V roce 2008 a 2009 byl u vybraných gravidních či žen po porodu pozitivních v DIFT a/ nebo pozitivních také v ELISA nebo LCT testu, proveden cross-match mezi trombocyty otce a plazmou/sérem matky a zároveň genotypizace HPA znaků matky či obou rodičů. Takto bylo vyšetřeno 9 párů. V 15 případech byla provedena HPA genotypizace pouze u matky (tab. 3). U dvou matek, nositelek genotypu HPA-1b/1b, nebyla přítomnost protilátky anti-HPA-1a testováním kitem PAK 12 respektive křížovou zkouškou ani opakovaným screenigem (DIFT) potvrzena (tab. 3). Výše uvedenou kombinací testování často nebylo možné vyloučit přítomnost protilátek anti-HPA-5b (11krát), tj. druhé nejfrekventovaněji uváděné příčiny FMAIT [12, 13] a také vyloučení anti-HPA-15a/b (8krát). Vzhledem k problematičtější interpretaci a skutečnosti, že náběry pro doplnění vyšetření o HPA genotypizaci rodičů a křížovou zkoušku nebyly často na naše pracoviště dodány, zavedli jsme ke konci roku 2009 rutinní testování specifických protilátek proti trombocytům (anti-HPA) kitem PAK 12 (tab. 3).

DISKUSE

MACE 1 a MACE 2 test je ve srovnání s PAK 12 finančně, časově i technicky náročnější. Pro identifikaci nejčastějších respektive klinicky nejzávažnějších protilátek z hlediska rozvoje FMAIT se testování pouze kitem MACE 1 (anti-HPA-1a a anti-HPA-3a) jeví jako nedostačující, je nutno použít také kit MACE 2 (identifikace anti-HPA-5b). Proto postup, při kterém na základě pozitivity v DIFT případně současně v ELISA či LCT testu, následuje potvrzení pozitivity testem PAK 12, se v běžné praxi osvědčil lépe. Podle některých studií může hladina specifických trombocytárních protilátek během těhotenství kolísat [2, 11] anebo se mohou vyskytnout časné přechodné protilátky bez klinického významu [21]. Kvůli vyloučení falešně pozitivních (nespecifických) reakcí, které se u tohoto typu testu mohou vyskytnout [13] respektive pro potvrzení přítomnosti specifické protilátky je potřeba vždy provést i HPA genotypizaci matky a otce (před porodem) anebo dítěte (po porodu), eventuálně testování kitem PAK 12 opakovat, a navíc doplnit křížovým testem mezi sérem matky a trombocyty otce. GTI-PAK 12 je široce užívaný spolehlivý screeningový test, který je díky své jednoduchosti vhodný zejména pro menší rutinní laboratoře [6, 17, 22]. Nevýhodou komerčního kitu PAK 12 je, že jím nelze zachytit protilátky proti antigenu HPA-15 respektive protilátky proti antigenům trombocytů s velmi nízkou frekvencí výskytu, které také mohou být klinicky relevantní. Na jejich přítomnost pak můžeme usuzovat pouze z výsledků HPA genotypizace, z opakované pozitivity v DIFT (při LCT testu negativním) a z pozitivní křížové zkoušky mezi trombocyty otce a sérem matky. V takových případech je potřeba zorganizovat vyšetření v (referenční) laboratoři využívající techniky, které detekci těchto protilátek umožňují.

ZÁVĚR

Na národní a mezinárodní úrovni zatím neexistují jednotné guidelines pro postup při identifikaci respektive stanovení protilátek vedoucích k NAITP. Na druhé straně existuje několik in house a komerčních testů k zachycení a identifikaci aloimunních anti-HPA a anti-HLA protilátek majících různou citlivost, specificitu a své výhody či omezení [22]. V Krevním centru FNO jsou imunhematologická vyšetření prováděna u rizikových pacientek na základě požadavku gynekologů a dále při nálezu trombocytopenie u novorozenců. Postup vyšetření, při kterém na základě pozitivity v DIFT a/nebo ELISA a/nebo lymfocytotoxického testu následuje vyšetření kitem PAK 12, v indikovaných případech doplněných o genotypizaci HPA systému anebo křížovou zkoušku mezi trombocyty otce a sérem matky, se v praxi Krevního centra jeví zatím jako dostačující. S přibývajícími praktickými zkušenostmi a přibývajícími komerčními detekčními technikami lze očekávat další úpravy v postupu při potvrzování diagnózy NAITP.

MUDr. Zuzana Čermáková, Ph.D.
Krevní centrum FN Ostrava
17. listopadu 1790
708 52 Ostrava
e-mail: zuzana.cermakova@fno.cz