Metabolomika vo výskume fytoterapeutík

Overview

Farmaceutický a potravinársky výskum sa vo zvýšenej miere zameriava na veľký potenciál rastlinných sekundárnych metabolitov alebo prírodných látok, ktoré možno využiť ako terapeutiká alebo vzorové zlúčeniny pre vývoj nových liečiv. Práca sa venuje využitiu metabolomiky, metabolického profilovania a metabolického „fingerprintu“ pri identifikácii jednotlivých aktívnych fytolátok v rastlinných extraktoch, pri profilovaní unikátnych skupín rastlinných sekundárnych metabolitov, ktoré možno využiť na zlepšenie klasifikácie viacerých druhov liečivých rastlín, ako aj na lepšie charakterizovanie a kontrolu kvality liečivých extraktov, tinktúr a fytofarmaceutických prípravkov pripravených z týchto rastlín. Na identifikáciu metabolitov sa používajú hlavne kombinované analytické metódy a multivariačná štatistická analýza. Liečivé rastliny sa v tomto prípade hodnotia nielen na základe obmedzeného počtu metabolitov, ktoré sú farmakologicky významné zlúčeniny, ale aj na základe fingerprintov menej významných metabolitov a bioaktívnych molekúl.

Kľúčové slová:
metabolomika • metabolické profilovanie • metabolický „fingerprint“ • liečivé rastliny

Úvod do metabolomiky

Metabolomikou nazývame vedecké skúmanie chemických procesov zahrňujúcich metabolity, ktoré obsahuje postupy využívané pri analýze metabolómu alebo časti metabolómu, ako je vzorkovanie, príprava vzorky, chemická analýza a analýza údajov. Metabolóm predstavuje úplnú sadu všetkých metabolitov, ktoré sa používajú alebo vytvárajú v bunke v spojení s ich metabolizmom. Je potrebné rozlíšiť endometabolóm, ktorý predstavuje úplnú sadu intracelulárnych metabolitov, od exometabolómu, čiže sady metabolitov vylučovaných do rastového média alebo extracelulárnych tekutín. Analýzu skupiny špecifických metabolitov (napr. skupiny metabolitov, ako sú sacharidy alebo aminokyseliny), ktorá nemusí byť kvantitatívna, ale často je prinajmenšom semikvantitatívna, nazývame metabolickým profilovaním. Metabolickým fingerprintingom nazývame zasa NMR spektrá alebo MS analýzy, ktoré poskytujú fingerprint metabolitov, ktoré produkuje bunka, zatiaľ čo kvantitatívnu analýzu špecifických metabolitov nazývame cielenou analýzou metabolitu¹⁾.

Analýza metabolómu pokrýva identifikáciu a kvantifikáciu všetkých intracelulárnych a extracelulárnych metabolitov s molekulovou hmotnosťou menšou než 1000 Da použitím rôznych analytických techník. Takéto obmedzenie molekulovej hmotnosti však nie je obvykle veľmi presné, pretože mnoho sekundárnych metabolitov s molekulovou hmotnosťou väčšou ako 1000 Da považujeme tiež za metabolity. Metabolické profilovanie poskytuje priamu fyziologickú informáciu a získané údaje je možné začleniť do metabolických modelov. Metabolický fingerprinting poskytuje odtlačok prstov, ktorý sa dá použiť na zoskupenie rôznych vzoriek, napr. použitím klastrovej analýzy. Aj keď konvolučná povaha bunkového metabolizmu, kde sa ten istý metabolit môže zúčastňovať viacerých rôznych dráh, komplikuje interpretáciu metabolických dát, záujem o metabolomiku a/alebo metabolické profilovanie v biológii rastlín neustále rastie. Jej čoraz širšie využívanie umožňuje vývoj a aplikácia necielených multivariačných prístupov na analýzu zloženia rastlinných metabolitov²⁾. Výhodou metabolomiky však je, že nie je závislá od rastlinného druhu³⁾, možno ju aplikovať i na značne sa líšiace druhy a optimalizácia protokolov pre nový druh si vyžaduje iba krátky čas⁴⁾.

Fytoterapeutiká

Z celkového počtu cca 350 000 cievnatých rastlín sa v histórii ľudstva doteraz na liečebné účely použilo asi 35 000 druhov. Na európskom trhu je k dispozícii 2000 druhov liečivých a aromatických rastlín, z ktorých rastie voľne v prírodných podmienkach Európy asi 1200–1300 druhov, pričom 130–140 druhov sa pestuje agrotechnicky. Klimatické a pedologické podmienky v strednej Európe sú vo všeobecnosti veľmi dobré pre pestovanie mnohých druhov liečivých rastlín^{5, 6)}. Nedávno sa tiež zistilo, že biomasu získanú z odpadu liečivých rastlín (zvyšky z farmaceutickej produkcie) možno použiť ako veľmi účinné zelené hnojivo, nakoľko tento materiál obsahuje zlúčeniny, ktoré sú špecificky účinné voči burinám a rôznym škodcom⁷⁾.

Predpokladá sa, že rastlinné metabolómy sú oveľa komplexnejšie ako metabolómy cicavcov: odhady naznačujú, že sa objaví viac ako 200 000 molekúl rastlinných metabolitov⁸⁾. Sekundárne metabolity rastlín, ktoré vznikli prostredníctvom nepretržitej interakcie rastliny s náročným a prevažne nepriateľským okolím, charakterizuje značná rozmanitosť, pričom sa tieto metabolity obvykle vyznačujú špecifickou bioaktivitou súvisiacou s ich chemickou štruktúrou a zapojením do biochemických pochodov⁹⁾. Mnohé známe chemoterapeutické liečivá na liečbu rakoviny sú odvodené od rastlinných sekundárnych metabolitov, ako sú paclitaxel (taxol), camptothecin (irinotecan, topotecan) a podofylotoxíny (etoposid, teniposid). V súčasnosti sa farmaceutický a potravinársky výskum opätovne začal zameriavať na veľký potenciál rastlinných sekundárnych metabolitov a prírodných látok, ktoré možno využiť ako terapeutiká alebo vzorové zlúčeniny pre vývoj nových liečiv¹⁰⁾.

Využívané analytické metódy

Identifikovať jednotlivé aktívne obsahové látky v rastlinných extraktoch je často problematické pre ich relatívne nízke zastúpenie v rastlinách a spektrum farmakologickej účinnosti obvykle narastá iba v dôsledku synergického účinku viacerých zložiek jednej rastliny alebo viacerých rastlín¹¹⁾. Špecifický „podpis“ týchto látok v profiloch expresie génov alebo proteínov môže byť tiež veľmi významný pre farmakologickú štandardizáciu (napr. pri využití v „biologických fingerprintoch“ extraktov liečivých rastlín^{12, 13)}). Metabolomické postupy využívajúce techniky GC–MS, LC–MS, HPLC–MS, CE–MS alebo 2D NMR sú účinným prostriedkom pre kontrolu kvality liečivých rastlín alebo výrobkov z liečivých rastlín^14–16). Ako príklad možno uviesť použitie postupov komparatívnej metabolomiky na charakterizovanie fytoterapeutík, ktoré použili Shyur et al.¹⁰⁾. Títo autori na analýzu extraktov troch liečivých druhov Echinacea (E. purpurea, E. pallida a E. angustifolia) využili špeciálnu prípravu rastlinného extraktu, on-line GC–MS alebo LC–MS/MS-ESI a systémy klastrovania metabolitov.

Na štúdium metabolického profilu rastlín sa používajú predovšetkým kombinované techniky ako napr. HPLC–MS, UHPLC–MS, UPLC–MS a pod. Technika UPLC–MS-TOF, ktorá sa použila na štúdium metabolického profilu rôznych rastlinných orgánov Panax notoginseng, umožnila identifikáciu početných saponínov v kvetoch, koreňoch a rizozómoch tejto rastliny¹⁷⁾. Kombinovaná technika HPLC–MS-IT sa použila na získanie fingerprintu u prípravkov z Ginkgo biloba¹⁸⁾, ďalšia kombinovaná technika HPLC–MS/MS sa využila na identifikáciu a kvantifikáciu artemisinínu a ďalších zložiek v rastlinách Artemisia afra¹⁹⁾, zatiaľ čo systémy HPLC–MS-IT/TOF sa využili na stanovenie flavanolignánov v liečivej rastline Silybum marianum²⁰⁾.

Kombinované techniky HPLC–NMR, resp. pokročilé experimenty NMR sú tiež mimoriadne cenným nástrojom pri objasňovaní chemického zloženia komplexnej, bioaktívnej frakcie prírodného pôvodu²¹⁾.

Metabolomické štúdie/metabolické profilovanie liečivých rastlín

Ako modelová rastlina v molekulárnej genetike rastlín bola zvolená Arabidopsis thaliana (arábovka Thalova), predovšetkým pre malý jadrový génom²²⁾. Bola preto aj prvou rastlinou, u ktorej sa už v roku 2000 vykonalo sekvenovanie genómu²³⁾. Rastliny tohto druhu sa tiež modelovo využívali na metabolomické štúdie. Tholl et al.²⁴⁾ využili na identifikáciu enzýmov, ktoré sú zodpovedné za syntézu prchavých terpénov v kvetoch Arabidopsis a benzénoidných esterov v ich listoch, práve metabolické profilovanie spoločne s profilovaním génovej expresie, ako aj rôzne biochemické metódy. Tato skupina autorov využila kombináciu vyššie popísaných metód aj na identifikáciu enzýmov syntetizujúcich terpény a metylované fenylpropény v rastlinách bazalky (Ocimum basilicum)²⁴⁾. Vo všeobecnosti možno konštatovať, že metabolické profilovanie, ktoré spočíva v súčasnej analýze viacerých metabolitov s čo najmenšími úpravami vzorky, je založené predovšetkým na vzájomnom porovnávaní a nachádzaní rozdielov a neočakávaných zmien. Môže sa využívať na určovanie taxonomicky blízkych rastlín a ich zaraďovanie do skupín. Taktiež ho možno využiť na kontrolu a štandardizovanie rôznych rastlinných extraktov. Niektoré typické príklady sú stručne popísané nižšie.

Hypericum sp.

Filippini et al.²⁵⁾ študovali rôzne fázy dozrievania u troch rôznych podruhov Hypericum perforatum a pomocou metabolického profilovania vyhodnocovali zmeny v kontexte hlavných sekundárnych metabolitov tejto rastliny. Z výsledkov tohto štúdia vyplynulo, že H. perforatum, subsp. perforatum obsahuje viac sekundárnych metabolitov ako ďalšie dva študované poddruhy (H. augustifolium, H. veronese). Tieto tri študované poddruhy sa v jednotlivých štádiách vývinu vyznačujú rozdielnymi metabolickými profilmi, a to hlavne v súvislosti s hypericínom a hyperforínom. Preto je pre produkciu rastlinného liečiva s vyhovujúcim metabolickým profilom nevyhnutný optimálny čas zberu.

Alali et al.²⁶⁾ stanovili hlavné aktívne metabolity (naftodiantróny a floroglucinoly) v metanolických extraktoch dvoch druhov Hypericum z oblasti Jordánu, a to H. empetrifolium a H. sinaicum. Na základe LC–UV/VIS profilov, retenčných časov a spektrálnych údajov získaných pomocou MS-ESI techniky skenov TIC alebo SIM sa u oboch študovaných druhov potvrdila prítomnosť hypericínu, protohypericínu a pseudohypericínu. Adhyperforín sa však zistil iba u H. empetrifolium, zatiaľ čo hyperforín a protopseudohypericín iba u H. sinaicum.

Melissa officinalis

Kim et al.²⁷⁾ použili na metabolomické štúdium zamerané na vplyv sacharózy na metabolizmus rastlín modelovú rastlinu Melissa officinalis. Metabolické profily rastlín M. officinalis ošetrených sacharózou analyzovali prostredníctvom GC–MS a analýzy hlavných komponentov (PCA – principal component analysis). Metabolické profilovanie ukázalo, že aplikácia vyššej koncentrácie sacharózy spôsobila nárast hladín metabolitov, ako sú sacharidy, ktoré sa vzťahujú ku glykolytickej dráhe M. officinalis. S nárastom koncentrácie sacharózy sa zvyšovala aj syntéza prolínu a kyseliny jantárovej, ktoré sú spojené s pentózovou fosfátovou dráhou, dráhou kyseliny šikimátovej, ako aj biosyntéza fenylpropanoidov. Výsledkom týchto metabolických zmien vyvolaných sacharózou napokon bola zvýšená produkcia flavonoidov a kyseliny kávovej.

Panax

Lee et al.²⁸⁾ študovali 35 vzoriek ženšenu pochádzajúcich z Kórey a Číny s cieľom vyvinúť metódu vhodnú na rozlíšenie pôvodu ženšenu. Na základe výsledkov multiprvkovej analýzy sa zistili významné rozdiely v prípade horčíka, železa, hliníka a skandia. Na základe údajov získaných z ¹H NMR spektier sa vykonala analýza hlavných komponentov (PCA), ktorá preukázala významné rozlíšenie medzi rastlinami pochádzajúcimi z dvoch rôznych krajín. Hlavné metabolity zodpovedné za toto rozlíšenie boli sacharidy, ako je glukóza, xylóza a sacharóza.

Lee et al.²⁹⁾ pomocou ¹H NMR metabolického fingerprintu a metabolického profilovania hodnotili tiež kvalitu rôznych kultivarov ženšena, ako aj niektorých komerčných produktov. Analýza hlavných komponentov na základe ¹H NMR spektier spoľahlivo rozlíšila jednotlivé vzorky ženšenu. Hlavné metabolity, ktoré sa testovali v rastlinných vzorkách v rámci tohto štúdia, boli glutamín, arginín, sacharóza, malát a myo-inozitol. Kombináciou metabolického fingerprintu a profilovania sa zistilo, že viaceré zlúčeniny včítane glukózy, fumarátu a rôznych aminokyselín môžu slúžiť ako biomarkery pre zaručenie kvality ženšenu.

Chamomilla

Weber et al.³⁰⁾ analyzovali etanolický extrakt kvetov rastlín Chamomilla recutita pomocou kombinovaných techník HPLC-MS a HPLC-NMR s cieľom charakterizovať hlavné zložky v tomto extrakte. Zistili, že hlavnými komponentmi v extrakte sú cis- a trans-izoméry 2-(glukozyloxy)-4-metoxyškoricovej kyseliny a tiež herniarín a apigenín, apigenín-7-O-ß-glukozid, ako aj niektoré jeho deriváty.

Ricinus

Pigott et al.³¹⁾ skúmali rozdiely v metabolómoch šiestich vzoriek známych kultivarov Ricinus communis, ktoré by bolo možné použiť pri určovaní pôvodu, resp. identifikácii kultivaru pomocou ¹H NMR analýzy, s následným využitím multivariačnej analýzy ortogonálnej projekcie metódy čiastočných najmenších štvorcov (OPLS – orthogonal partial least squares). Analýza grafického znázornenia spolu s ďalšími chemickými analýzami extraktov umožnili identifikovať fenylalanín, ricinín, N-demetyl a O-demetyl analógy ricinínu a sacharózu ako dôležité molekulové markery jednotlivých kultivarov.

Glycyrrhiza sp.

Yang et al.³²⁾ využili metabolomickú techniku založenú na ¹H NMR na klasifikáciu rôznych druhov Glycyrrhiza, pričom na multivariačnú štatistickú analýzu súboru dát použili diskriminantnú analýzu čiastočných najmenších štvorcov (PLS). Kľúčovými metabolitmi prispievajúcimi k rozdeleniu „score plots“ (znázornenie rozdielov medzi údajmi, ktoré patria do rôznych tried) u rôznych druhov Glycyrrhiza boli kyselina mliečna, alanín, arginín, prolín, kyselina jablčná, asparagín, cholín, glycín, glukóza, sacharóza, kyselina 4-hydroxyfenyloctová a kyselina mravčia. Relatívne vysoké hladiny glukózy a kyseliny 4-hydroxyfenyloctovej sa zistili u G. glabra, zatiaľ čo u G. uralensis vysoké hladiny dosahovali arginín, kyselina jablčná a sacharóza.

Metabolomika v kontrole kvality fytofarmák

Tinktúry sú rozšírene používané kvapalné liekové formy, ktoré sa tradične získavajú maceráciou jednej alebo viacerých liečivých rastlín v etanolickom vodnom roztoku. Výsledkom takéhoto procesu je extrakcia stoviek štrukturálne odlišných zlúčenín s odlišnou polaritou. Vzhľadom k rozsiahlej rozmanitosti štruktúr zložiek, ktoré sa nachádzajú v bylinných tinktúrach, analytické postupy využívané na kontrolu kvality tinktúr sa obvykle optimalizujú iba na detekciu jednej chemickej látky alebo špecifickej triedy zlúčenín.

Politi et al.³³⁾ stanovili priamy metabolický „fingerprint“ komerčných tinktúr pripravených z liečivých rastlín Echinacea purpurea, Hypericum perforatum, Ginkgo biloba a Valeriana officinalis pomocou NMR spektroskopie a MS spektrometrie. Využitie týchto techník umožnilo získať metabolický fingerprint vhodný pre rozlíšenie tinktúr pripravených z rôznych rastlín, a to bez odparenia a separačných krokov, pričom sa potvrdilo, že vyššie spomenuté techniky sú vhodné na rýchlu priamu analýzu liečivých bylinných tinktúr.

Metódy založené na využití NMR sa tiež použili na charakterizovanie extraktov a fytofarmaceutických prípravkov z rastlín Arnica montana³⁴⁾, Artemisia annua^{19, 35)}, Matricaria recutita³⁶⁾, Cannabis sativa³⁷⁾, Panax ginseng³⁸⁾, Angelica sp.³⁹⁾, Ephedra sp.⁴⁰⁾.

Perspektívy a využitie

V posledných rokoch stratégie využívajúce klasickú genetiku a molekulovú biológiu (biobalistika, transformácia Agrobacterium tumefaciens, rekombinantné enzýmy) na prípravu prírodných látok, ako aj šľachtenie liečivých a aromatických rastlín, prispeli k rozšíreniu a zlepšeniu získavania čistých účinných látok z rastlín. Z tohto aspektu zohrávajú hlavnú úlohu prírodné produkty s vysokou hodnotou využívané na terapeutické a kozmetické účely (napr. silice, paclitaxel, artemisinín, vinca alkaloidy). Akademický výskum a aj priemysel sa preto zameriavajú na vyžitie genetických a biotechnologických techník, ako je metabolické inžinierstvo, miestne cielená mutagenéza a optimalizácia dráh s cieľom znížiť náklady a zvýšiť produktivitu. Nevýhodou využitia rastlinných kultúr a izolovaných enzýmov na komerčné účely je nízka produkcia, v dôsledku čoho sa výskum orientuje vo zvýšenej miere na metabolické inžinierstvo⁴¹⁾.

Zvýšenie dostupnosti účinných liečivých látok z rastlinných zdrojov musí sprevádzať kvalitatívna kontrola obsahových látok využívajúca botaniku, chémiu, biológiu a informatiku. Takéto integrované stratégie zahŕňajú informačné systémy, analýzu genómu, metabolomiku, biotechnológiu, nanotechnológiu, analýzu liečivých rastlín in situ, ako aj využitie nových detekčných techník pre produkciu liečivých rastlín obsahujúcich zvýšené hladiny látok s liečivým účinkom⁴²⁾.

Metabolomická stratégia je čoraz užitočnejšia pre profilovanie unikátnych skupín rastlinných sekundárnych metabolitov, ktoré možno využiť v chemotaxonómii a pre lepšiu kontrolu kvality liečivých extraktov z týchto rastlín.

Záver

Stratégie rastlinnej metabolomiky poskytujú nové a dôležité informácie pre výskum liečivých rastlín, ktoré spájajú predpokladanú bioaktivitu s hlavnými účinnými obsahovými látkami rastlín využívaných v oblasti fytomedicíny. Je tiež potrebné zdôrazniť, že metabolomiku možno využívať na hodnotenie kvality liečivých rastlín, ktoré je založené na rozmanitosti metabolických fingerprintov získaných na základe multivariačnej analýzy necielenej alebo v značnej miere cielenej analýzy metabolitov. Výhodou takéhoto postupu je to, že liečivé rastliny sa hodnotia nielen na základe obmedzeného počtu metabolitov, ktoré sú farmakologicky významnými zlúčeninami, ale aj na základe fingerprintov menej významných metabolitov a bioaktívnych molekúl⁴³⁾.

Skratky

CE–MS – Capillary Electrophoresis – Mass Spectrometry; spojenie kapilárnej elektroforézy s hmotnostnou spektrometriou

2D NMR – Two Dimensional Nuclear Magnetic Resonance; dvojrozmerná nukleárna magnetická rezonancia

ESI – Electrospray Ionization; ionizácia elektrosprejom

GC–MS – Gas Chromatography – Mass Spectrometry; spojenie plynovej chromatografie s hmotnostnou spektrometriou

HPLC – High Performance Liquid Chromatography; vysokoúčinná kvapalinová chromatografia

HPLC–MS – High Performance Liquid Chromatography – Mass Spectrometry; spojenie vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie s hmotnostnou spektrometriou

HPLC–NMR – High Performance Liquid Chromatography – Nuclear Magnetic Resonance; spojenie vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie s nukleárnou magnetickou rezonanciou

IT – Ion Trap; ionová pasca

LC–MS – Liquid Chromatography – Mass Spectrometry; spojenie kvapalinovej chromatografie s hmotnostnou spektrometriou

LC–UV/VIS – Liquid Chromatography – Ultraviolet/Visible; spojenie kvapalinovej chromatografie s UV/VIS detekciou

MS – Mass Spectrometry; hmotnostná spektrometria

MS/MS (MSⁿ) – Tandem Mass Spectrometry; tandemová hmotnostná spektrometria

NMR – Nuclear Magnetic Resonance; nukleárna magnetická rezonancia

OPLS – Orthogonal Partial Least Squares; multivariačná analýza ortogonálnej projekcie metódy čiastočných najmenších štvorcov

PCA – Principal Component Analysis; analýza hlavných komponentov

PLS – Partial Least Squares; analýza čiastočných najmenších štvorcov

SIM – Selected Ion Monitoring; selektívny záznam vybraného iónu

TIC – Total Ion Current; iónový prúd vyvolaný dopadom všetkých elektrónov

TOF – Time of Flight; analyzátor doby letu

UHPLC – Ultra High Performance Liquid Chromatography; – ultra-vysokoúčinná kvapalinová chromatografia

UPLC – Ultra Performance Liquid Chromatography; ultra účinná kvapalinová chromatografia

Publikácia bola vytvorená realizáciou projektu „Výskum a vývoj nových technológií chemickej analýzy pre metabonomiku/metabolomiku“ ITMS: 26240220007, na základe podpory operačného programu Výskum a vývoj financovaného z Európskeho fondu regionálneho rozvoja.

Konflikt záujmov: žiadny.

Došlo 13. listopadu 2011 / Přijato 5. ledna 2012

doc. PharmDr. Josef Jampílek, PhD.

Ústav chemických léčiv FaF VFU

Palackého 1–3, 612 42 Brno

e-mail: jampilekj@vfu.cz