Význam genetického polymorfizmu enzýmov cytochrómu P450 – časť I.Enzýmový systém cytochrómu P450 a cytochróm P450 1A2

Interindividuálna variabilita v odpovedi na liečivo je významným klinickým problémom. Významný podiel na tom májú rozdiely v metabolizme liečiv, jedná sa hlavne o enzýmy cytochrómu P450. Genetický polymorfizmus týchto enzýmov môže ovplyvniť odpoveď pacienta u bežne užívaných liečiv. Cieľom prvej časti tohoto článku je podať stručný výklad o enzýmovom systéme cytochrómu P450 a zároveň popísať vplyv genetického polymorfizmu cytochrómu P450 1A2 na účinok liečiv.

Kľúčové slová:
cytochróm P450 – genetický polymorfizmus – CYP1A2

Enzýmový systém cytochrómu P450

Enzymový systém cytochrómu P450 je univerzálnym systémom biotransformačných enzýmov nachádzajúcich sa v baktériách, rastlinách a rôznych živočíšnych druhoch. Pôvodnou funkciou cytochrómu P450 bolo zachovanie integrity bunečnej membrány metabolizmom a biosyntézou steroidov. Neskôr cytochróm P450 prevzal úlohu v zbavovaní sa organizmu cudzorodých látok ¹⁾. Enzýmy cytochrómu P450 tvoria superrodinu hemoproteínov. Pojem „cytochróm P450“ vznikol na základe absorbčného píku redukovanej formy enzýmu v komplexe s oxidom uhoľnatým pri vlnovej dĺžke 450 nm ^{2, 3)}. Enzýmy cytochrómu P450 sú podľa svojho reakčného mechanizmu často nazývané i oxidázami so zmiešanou funkciou, pretože pri ich metabolickej reakcii sa spotrebováva molekula kyslíka na oxidáciu substrátu.

Na klasifikáciu jednotlivých enzýmov cytochrómu P450 sa využíva podobnosti aminokyselinovej sekvencie. V rámci tejto nomenklatúry sú jednotlivé enzýmy združené v rodinách a subrodinách označované predponou „CYP“. Enzýmy so zhodnosťou v sekvencii aminokyselín 40 % a viac patria do jednej rodiny (značí sa arabským číslom, napr. CYP3). Enzýmy so zhodnosťou sekvencie vyššou než 55 % patria do jednej subrodiny (značia sa veľkým písmenom, napr. CYP3A). Enzýmy, ktorých proteíny sú kódované jednotlivými génmi (označené italikou), sa označujú ako formy alebo izoformy (značia sa arabským číslom za písmenom, napr. CYP3A4). U človeka bolo doteraz popísaných 18 rodín a 44 podrodín. Spomedzi nich rodiny CYP 1, 2 a 3 tvoria 70 % celkového obsahu v pečeni a podieľajú sa v 94 % na metabolizme liečiv v pečeni ^2–5). Najvýznamnejších je šesť základných izoenzýmov cytochrómu P450, ide o CYP1A2, CYP2A6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP3A4 a CYP3A5.

Distribúcia enzýmov cytochrómu P450 v organizme človeka je vysoká. Najvyššie hladiny sa nachádzajú v pečeni, významné hladiny sú taktiež v pľúcach, tenkom čreve, ľadvinách, koži, mozgu a nadľadvinkách. V bunke je cytochróm P450 lokalizovaný v hladkom endoplazmatickom retikule a v mitochondriách. Čo sa týka podielu jednotlivých enzýmov z rodín cytochrómu P450 1–3 na celkovom obsahu v pečeni, má najvyššie zastúpenie CYP3A4 s 30 %. Kvantitatívne zastúpenie jednotlivých izoenzýmov v pečeni však nekoreluje s ich významnosťou pre metabolizmus liečiv. Priemerný podiel jednotlivých izoforiem na celkovom obsahu cytochrómu P450 v pečeni a na biotransformácii liečiv je uvedený v tabuľke 1.

Enzýmový systém cytochrómu P450 je najdôležitejším systémom prvej fáze biotransformačných reakcií. Podieľa sa na metabolizme jak exogénnych, tak i endogénnych látok (tab. 2). Biotransformáciou väčšinou mení lipofilné látky na hydrofilné či polárne, ktoré môžu byť z organizmu následne vylúčené. Pri metabolizme niektorých látok však dochádza naopak k ich aktivácii. Niektoré cytochrómy P450 sú dokonca zodpovedné za iniciáciu kancerogenézie ^{2, 6)}. Pre enzýmovú aktivitu je nutný nielen cytochróm P450, ale i ďalší enzým NADPH-cytochróm P450 reduktáza a fosfolipidová frakcia membrán. Uvedené tri súčasti tvoria mikrozomálny cytochrómový monooxygenázový systém. Centrálnym enzýmom monooxygenázového systému je cytochróm P450. Typickou reakciou katalyzovanou monooxygenázovým systémom je:

RH + 0₂ + NADPH + H⁺ → ROH + H₂O + NADP⁺.

Aktíve miesto cytochrómu P450 obsahuje atóm železa, ktorý sa v oxidovanej forme (Fe³⁺) viaže so substrátom. Dochádza k redukcii (Fe²⁺) komplexu enzým-substrát prenosom elektrónu z NADPH. Tento redukovaný komplex viaže molekulárny kyslík a je následne redukovaný ďalším elektrónom. Komplex enzým – substrát – kyslík sa nakoniec štiepi na vodu, oxidovaný substrát a oxidovanú formu enzýmu. Enzýmy cytochrómu P450 katalyzujú rozmanité chemické reakcie ako N-dealkyláciu, O-dealkyláciu, S-oxidáciu, epoxidáciu a hydroxyláciu. Enzýmy cytochrómu P450 majú rozličnú ale často sa prekrývajúcu substrátovú špecificitu, vykazujú veľkú variabilitu v katalytickej účinnosti a regulácii medzi jednotlivými živočíšnymi druhmi i v rámci nich. Na metabolizme jedného liečiva sa môže podieľať i viacero enzýmov cytochrómu P450 ^{3–5, 7)}.

Na rozdiel od enzýmov cytochrómu P450 podieľajúcich sa na metabolizme endogénnych látok, aktivita enzýmov cytochrómu P450 metabolizujúcich látky exogénne môže významne kolísať ⁸⁾. Rozdiely v hladinách a aktivitách týchto enzýmov môžu viesť k rozdielnym plazmatickým hladinám liečiv medzi jednotlivými pacientmi, a tým k rozdielnym odpovediam na liek (nedostatočný alebo nadmerný účinok lieku). Tieto odlišnosti v metabolickej aktivite enzýmov cytochrómu P450 môžu byť spôsobené faktormi genetickými (genetický polymorfizmus) a negenetickými (pohlavie, rasa, patologický stav a faktory prostredia ako fajčenie a expozícia rôznym látkam).

Genetické faktory variability

Dnes je už známe, že veľký podiel v rozdielnej odpovedi na liek zohráva dedičnosť. Polymorfizmus v géne kódujúcom metabolické enzýmy má významnú úlohu, je obecne definovaný ako genetické rozdiely vyskytujúce sa medzi jednotlivcami v incidencii > 1% ⁹⁾ . Pre genetický polymorfizmus v biotransformácii liečiv sú podstatné génové mutácie. Ich podkladom môže byť zámena, chýbanie, vsunutie jedného alebo viacerých nukleotidov, duplifikácia alebo amplifikácia genómu. Genetické rozdiely tvoria významnú príčinu variability hlavne u CYP2D6, CYP2C9 a CYP2C19. Aktivita týchto enzýmov je polymorficky distribuovaná v populácii a závisí na prítomnosti a počte alelických variant ^10–12). CYP3A4 a CYP1A2 sa vyznačujú veľkou inter- a intraindividuálnou variabilitou, ktorá je výsledkom konštitučných a enviromentálnych faktorov ¹³⁾. Najčastejšie sa vyskytujúca alela pre každý enzým („wild type“) je označovaná *1. Alelické varianty sú následne označované podľa ich identifikácie (napr. *2, *3 atď.). Súčasný prehľad alelických variant je na webových stránkach http://cypalleles.ki.se ¹⁴⁾. Funkčný význam jednotlivých alelických variant sa líši, je taktiež odlišná ich frekvencia distribúcie medzi jednotlivými etnickými skupinami ¹⁵⁾. Enzymový defekt prejavujúci sa zmenou v metabolickej aktivite je v populácii prenášaný autozomálne recesívne, prejavy sú preto najvýraznejšie u homozygotov pre defektný gén. Na základe stupňa aktivity enzýmov cytochrómu P450 možno rozdeliť populáciu do štyroch metabolických skupín: 1. pomalí metabolizátori (PM), 2. intermediárni metabolizátori (IM), 3. extenzívni metabolizátori (EM) a 4. ultrarýchli metabolizátori (UM). PM sú jedinci, ktorí postrádajú funkčný enzým, a majú teda najnižšiu metabolickú aktivitu. Sú vystavení vyššiemu riziku toxicity následkom vysokých hladín nezmetabolizovaného liečiva, alebo je u nich naopak riziko zlyhania terapie v prípade užívania liečiv, ktoré vyžadujú pre svoj účinok metabolickú premenu. IM sú nositeľmi buď jednej nefunkčnej variantnej alely (heterozygoti), alebo nositeľmi dvoch variantných aliel so zníženou metabolickou aktivitou. Väčšinu populácie tvoria EM, ktorí majú dve funkčné (normálne) alely. UM vykazujú najvyššiu metabolickú aktivitu v dôsledku duplifikácie alebo amplifikácie génu. Metabolizujú liečivá rýchlejšie než EM a môžu vyžadovať vyššie než bežné dávky liečiva, aby dosiahli terapeutické plazmatické koncentrácie ^{11, 16)}. Výsledný účinok polymorfizmu na metabolizme liečiva závisí na množstve enzýmov, ktoré sa na premene liečiva podieľajú. Enzýmy cytochrómu P450 majú obecne širokú substrátovú špecificitu, čo znamená, že sa na metabolizme určitého lieku môže zúčastniť niekoľko enzýmov cytochrómu P450. V prípade, že je metabolizmus liečiva závislý principiálne na jednej izoforme, genetický polymorfizmus môže viesť k významnej zmene účinku tohto liečiva (hlavne u liečiv s úzkym terapeutickým indexom). Naopak tam, kde sa na metabolizme podieľajú viaceré formy cytochrómu P450, môžu ostatné enzýmy prevziať úlohu v metabolizme daného liečiva. Nie vždy však musí alternativná metabolická cesta plne nahradiť tú nefunkčnú ^{12, 17)}.

Negenetické faktory variability

Hoci genetický polymorfizmus enzýmov cytochrómu P450 má veľký dopad na biotransformáciu liečiv, genetika sama o sebe nevysvetľuje všetku variabilitu ¹⁸⁾. Rozdielnu biotrasformáciu možno pozorovať aj v rámci jednej genotypovej skupiny. Pekným príkladom je práca Aklillu et al. poukazujúca na vplyv faktorov prostredia na zmenu aktivity enzýmu CYP2D6 u populácie Étiopčanov po presťahovaní do Švédska ¹⁹⁾. Metabolickú aktivitu enzýmov cytochrómu P450 môže ovplyvniť pohlavie ²⁰⁾, patologický stav ²¹⁾, zmena fyziologického stavu (tehotenstvo) ²²⁾ a faktory prostredia ako fajčenie ²³⁾ a expozícia rôznym látkam (potrava, liečiva ...). Je známych veľa príkladov interakcií niektorých potravín ^{24, 25)} a liečiv ^{26, 27)} s enzýmami cytochrómu P450, následkom ktorých došlo ku klinicky významnej inhibícii či indukcii metabolickej aktivity daného enzýmu.

Enzýmová indukcia

Niektoré liečivá i zložky potravy vyvolávajú zvýšenú enzymatickú aktivitu, indukciu. Dôsledkom enzýmovej indukcie po opakovanom podaní látky je zrýchlenie biotransformácie, zníženie plazmatických hladin a terapeutického účinku daného liečiva. K tejto situácii dochádza v prípade, pokiaľ metabolity liečiva majú malý alebo žiaden farmakologický účinok. Pokiaľ majú metabolity väčší účinok, resp. vyššiu toxicitu, môže dôjsť pri enzýmovej indukcii k prejavom intoxikácie.

Enzýmová inhibícia

Niektoré liečivá i zložky potravy naopak enzýmovú aktivitu tĺmia, inhibujú. Najčastejšie sa jedná o reverzibilnú inhibíciu. Výsledkom inhibície biotransformačných procesov je väčšinou predĺženie farmakologického účinku zvýšením plazmatických hladin daného liečiva s možnými prejavmi intoxikácie. V prípade, že sa jedná o neaktívne liečivo (proliečivo), ktoré sa potrebuje transformovať na aktívnu formu, môže naopak následkom inhibície dôjsť ku zlyhaniu terapeutického účinku.

Stanovenie biotransformačnej aktivity

Na predikciu individuálnej biotransformačnej kapacity sa používa metóda genotypovania a fenotypovania. Genotyp možno určiť analýzou DNA, použitím metódy PCR (polymerázová reťazová reakcia) a RFLP (polymorfizmus dĺžky restrikčných fragmentov). Novou alternativou genotypizácie je AmpliChip P450 test (Roche), prvý mikroanalytický farmakogenetický test. Jedná sa o prvý systém založený na znalosti časti ľudského genómu určený pre rutinnú diagnostiku využívajúci dve moderné technológie Roche PCR a Affymetrix mikroanalytiku. Poskytuje kompletnú gynotypizáciu génov CYP2C19 a CYP2D6 ²⁸⁾. Výsledok genotypovania však nie je ovplyvniteľný faktormi prostredia. Navyše citlivosť genotypovania v predikcii výskytu ultrarychlých metabolizátorov je stále nízka. Fenotypovanie je založené na podaní látky, ktorá je pre určitý enzým vysoko špecifická (substrátová látka, probe drug), je teda týmto enzýmom exkluzívne metabolizovaná. Výsledná metabolická aktivita sa stanoví z metabolického pomeru MR (materská látka/metabolit) v krvi či v moči a rozdelí populáciu do odpovedajúcich skupín. Pomalý metabolizátori majú najvyššiu hodnotu MR, naopak ultrarýchli metabolizátori vykazujú najnižšiu hodnotu MR. Fenotypovanie umožňuje stanovenie aktuálnej enzymatickej aktivity in vivo, pretože zohľadňuje i vplyv faktorov prostredia ¹²⁾.

Cytochróm P450 1A2

Zástupci podrodiny CYP1A, enzýmy CYP1A1 a CYP1A2, majú významnú úlohu v biotransformácii xenobiotik, vrátane xenobiotik bežne sa nachádzajúcich v potrave a škodlivinách životného prostredia. Oba enzýmy sa podieľajú na aktivácii niekoľkých prekarcinogénov, ako sú polyaromatické hydrouľovodíky, aromatické a heterocyklické amíny a mykotoxíny. Enzým CYP1A1 sa nachádza prevážne extrahepatálne, naopak, enzým CYP1A2 sa vyskytuje hlavne v pečeni ²⁾.

Enzým CYP1A2 vykazuje vysoký stupeň interindividuálnej variability. Jednou z príčin veľkej variability je vysoká inducibilita CYP1A2, na ktorej sa okrem xenobiotík, podieľajú i zložky potravy a fajčenie. Hlúbovitá zelenina (kapusta, brokolica, karfiol a ružičkový kel ...) je známa zvýšením aktivity enzýmu CYP1A2. Aktivita enzýmu CYP1A2 je taktiež indukovaná heterocyklickými amínmi a polycyklickými aromatickými uhľovodíkmi, ktoré sa nachádzajú napríklad v mäse upravenom za vyšších teplôt na drevenom uhlí ²⁴⁾. Ďalším faktorom variability CYP1A2 aktivity je genetický polymorfizmus ²⁹⁾. Výskyt mnohých polymorfných aliel je zriedkavý a ich funkčný význam na aktivitu enzýmu CYP1A2 nie je známy (tab. 3). Alela CYP1A2*1F je najčastejšie sa vyskytujúcou alelou v Európskej populácii (55,9 % výskyt vo švédskej populácii). Táto alela je u fajčiarov spojovaná s významne vyššou enzymatickou aktivitou, u nefajčiarov nemá prítomnosť tejto alely na aktivitu CYP1A2 vplyv ^{30, 31)}. Polymorfné alely CYP1A2 *1C a *1K sú spojované so zníženou aktivitou CYP1A2, prvá z aliel bola nájdená v japonskej populácii s frekvenciou výskytu okolo 23 %, druhá allela bola objavená v étiopskej populácii, vo švedskej populácii je jej výskyt vzácny ^{32, 33)}. Medzi etnikami existujú významné rozdiely v aktivite CYP1A2. Švédská populácia má 1,54krát vyššiu CYP1A2 aktivitu v porovnaní s Korejcami ³⁰⁾. Nižšia CYP1A2 aktivita bola nájdená u ázijskej a africkej populácie v porovnaní s belošskou populáciou ³⁴⁾.

Teofylín

V poslednej dobe bolo publikovaných niekoľko prací, ktoré sledovali vplyv polymorfizmu CYP1A2 na hladiny a účinok liečiv, prípadne výskyt nežiadúcich účinkov. Uslu et al. vo svojej práci skúmali vplyv polymorfizmu na metabolizmus teofylinu u pacientov s chronickou obstrukčnou bronchopulmonálnou chorobou. Jedinci, ktorí boli nositeľmi CYP1A2*1D a CYP1A2*1F variatných aliel, mali významne nižšie hladiny teofylinu v porovnaní s ostatnými pacientmi ³⁶⁾. Naopak prítomnosť CYP1A2*1C variatnej alely bola spojená s nižšou clearance teofylinu u astmatických pacientov ³⁷⁾.

Antipsychotiká

Rezistencia na terapiu klozapínom bola popísaná u schizofrénnych pacientov fajčiarov, ktorí boli nositeľmi variatnej alely CYP1A2*1F. Tento polymorfizmus v kombinácii s fajčením viedol k ultrarýchlemu metabolizmu a nízkým hladinám klozapínu s následným zlyhaním účinku antipsychotika. Po zvýšení dávky klozapínu alebo nasadení inhibítora CYP1A2 (fluvoxamín) došlo ku zlepšeniu klinického stavu pacientov ^{38, 39)}. Výskyt nežiadúcich účinkov z dôvodu zvýšenia hladiny klozapínu bol popísaný u pacientov, ktorý prestali fajčiť. Pacienti boli nositeľmi variatnej alely CYP1A2 *1F, a tým, že prestali fajčiť, došlo u nich k spomaleniu aktivity metabolického enzýmu ⁴⁰⁾. V inej práci naopak nebol potvrdený vzťah medzi CYP1A2*1F polymorfizmom, aktivitou enzýmu a hladinou klozapínu v skupine fajčiarov ^{41, 42)}. Vplyv CYP1A2 genotypu je popísaný i u ďalšieho antipsychotika olanzapínu ⁴³⁾. Clearance olanzapínu korelovala s aktivitou enzýmu CYP1A2 stanovenou pomocou kofeínu ako substrátovej látky u zdravých dobrovoľníkov ⁴⁴⁾.

Ostatné látky

U pacientov užívajúcich antireumatikum leflunomid s genotypom CYP1A2*1F CC bolo pozorované 9,7násobne vyššie riziko toxicity v porovnaní s pacientmi s CYP1A2*1F A alelou ⁴⁵⁾.

Enzým CYP1A2 je hlavným enzýmom v metabolizme kofeínu, ktorý je zároveň využívaný ako substrátová látka pre stanovenie fenotypu CYP1A2 ⁴⁶⁾. Pomalí metabolizátori mali vyššie riziko výskytu hypertenzie v spojení s pitím kávy ⁴⁷⁾ a dokonca vyššie riziko nefatálneho infarktu myokardu ⁴⁸⁾.

ZÁVER

Enzýmy cytochrómu P450 sú dôležitým systémom prvej fáze biotransformácie exogénnych látok. Aktivitu biotransformačných enzýmov môže ovplyvniť celá škála faktorov, významnú úlohu zohráva genetický polymorfizmus. Enzým CYP1A2 sa zúčastňuje na biotransformácii niekoľkých bežne užívaných liečiv. Aktivita tohto enzýmu je vysoko variabilná. Zdá sa však, že samotný polymorfizmus nevysvetľuje dostatočne významné rozdiely medzi jednotlivcami, významný podiel na aktivite tak budú zohrávať faktory prostredia.

Adresa pro korespondenci:

Mgr. Jana Ďuricová
Ústav klinické farmakologie LF OU
17. listopadu 1790, 708 52 Ostrava
e-mail: jana.duricova@fno.cz