Hodnocení rohovkové inervace pomocí konfokální mikroskopie

Overview

Konfokální mikroskopie rohovky (Corneal Confocal Microscopy; CCM) je neinvazivní metoda morfologického vyšetření rohovky umožňující m.j. vizualizaci korneálních nervových vláken, která jsou tenká, málo myelinizovaná či nemyelizovaná. CCM je tedy diagnostická metoda neuropatie tenkých vláken, resp. obecně periferních neuropatií. Cílem práce bylo zavedení vyšetření CCM do klinické neurologické praxe v České republice, nastavení vhodných normativních dat a stanovení reprodukovatelnosti vyšetření.

Soubor a metodika:
CCM byla vyšetřena v souborech 71 zdravých dobrovolníků a 54 pacientů s diabetickou polyneuropatií (Diabetic Polyneuropathy; DPN). Ze zjištěných dat byly stanoveny normy pro tři oddělené věkové kategorie. Nálezy byly vyhodnoceny automatickou i manuální analýzou (a to nezávisle dvěma hodnotiteli) ke stanovení spolehlivosti vyšetření.

Výsledky:
Vyšetření CCM bylo časově a metodicky nenáročné a bylo naprostou většinou pacientů dobře tolerováno. Stanovená věkově stratifikovaná normativní data vykazují velmi dobrou použitelnost ve sledovaných souborech pacientů. U pacientů s DPN byly prokázány signifikantní změny všech sledovaných CCM parametrů oproti zdravým kontrolám. Při hodnocení CCM snímků manuální analýzou byla prokázána velmi dobrá shoda dvou hodnotitelů. Při hodnocení automatickým softwarem však byly hodnoty všech sledovaných CCM parametrů signifikantně nižší.

Závěr:
Prezentovaná studie v souhrnu prokázala jednoduchost, bezpečnost a dobrou spolehlivost vyšetření rohovkové inervace pomocí konfokální mikroskopie rohovky na poměrně rozsáhlém souboru zdravých kontrol a skupině pacientů s DPN a poukázala rovněž na rozdílnost automatického a manuálního hodnocení.

Klíčová slova:
konfokální mikroskopie – rohovka – neuropatie tenkých vláken – diabetická neuropatie – spolehlivost nálezů

Úvod

Konfokální mikroskopie rohovky (Corneal Confocal Microscopy, CCM) je relativně nová neinvazivní metoda morfologického vyšetření rohovky s širokým klinickým využitím [1]. Pro potřeby neurologie je přínosná zejména možnost vizualizace korneálních nervových vláken, která je podkladem v současnosti dominujícího využití CCM v diagnostice periferních neuropatií, zejména neuropatie tenkých vláken (Small Fiber Neuropathy; SFN) [2,3]. Tato indikace je založena na skutečnosti, že rohovka je nejhustěji inervovaná tkáň lidského těla (až 400× více než lidská kůže) [4]. Současně je velmi dobře dostupná a jako jediná struktura lidského těla umožňuje neinvazivní morfologické vyšetření terminálních segmentů periferního nervového systému [2,3].

Anatomie rohovky a její inervace

Rohovka se skládá z pěti základních vrstev:

1. epitel,
2. Bowmanova membrána (amorfní vrstva mezi epitelem a stromatem),
3. stroma (lamelární vrstva složená z kolagenových fibril, proteoglykanů, keratocytů),
4. Descementova membrána (mezi stromatem a endotelem, složená z kolagenových vláken a glykoproteinů),
5. endotel (obr. 1) [5].

Její inervaci zabezpečuje trigeminální nerv, konkrétně jedna z jeho tří hlavních větví – n. ophthalmicus. Terminální větve toho nervu vytvářejí v rohovce tři základní nervové formace:

1. subbazální plexus ležící mezi epitelem a Bowmanovou membránou,
2. subepiteliální plexus mezi Bowmanovou membránou a stromatem,
3. stromální nervy [5].

Vyšetření rohovkové inervace pomocí CCM je zaměřeno především na subbazální plexus, který leží z velké části v centrální oblasti rohovky a jeho vlákna jsou uložena většinou ve svislém směru, rovnoběžně vedle sebe (obr. 2, 3) a často navzájem anastomozují. V důsledku husté inervace je rohovka velmi citlivá na chemické, mechanické i termické stimuly a i nejmenší podráždění vede k sevření víček za účelem maximální ochrany oka [6,7].

Vyšetření pomocí laserové rastrovací konfokální mikroskopie (optický princip)

Zdrojem světla v konfokálním mikroskopu je laserový paprsek, který je optikou mikroskopu zaostřen do jednoho konkrétního bodu rohovky. Stejný objektiv snímá i světlo odražené z tohoto bodu, současně ale snímá i světlo rozptýlené (z jiných bodů rohovky, a to především v menší nebo větší hloubce). Proto je v přístroji speciální konfokální clonka, která eliminuje světlo odražené z bodů mimo rovinu, do které je mikroskop právě zaostřen. Otvor v clonce je konjugovaný (con-) s ohniskem (focus) objektivu, odtud tedy název konfokální [8]. V jeden okamžik tak získáme obraz z jediného bodu (ve skutečnosti velmi malé plochy, jejíž velikost je dána rozlišením mikroskopu). Obraz celé zaostřené roviny se získává „bod po bodu“ (rastr) pomocí rozmítání laserového paprsku. Počítač registruje intenzitu světla a souřadnice a vytvoří obraz celého snímku. Ve skutečnosti je to však velmi rychlý proces a obraz je obnoven asi třikrát za sekundu. Výsledkem jsou tedy již z principu vždy ostré snímky získané v reálném čase, ve frontální rovině a především in vivo [8].

Význam hodnocení inervace rohovky pomocí CCM

Klíčovým diagnostickým přínosem konfokální mikroskopie pro neurologickou praxi je možnost neinvazivní vizualizace nervových vláken v rohovce. Nervová vlákna subbazálního plexu rohovky jsou tenká nervová vlákna typu A delta a C [5]. Úbytek a strukturální změny korneálních nervů přitom reflektují obecné postižení tenkých nervových vláken v organizmu [2,3,5,9–11]. Jedná se tedy o novou objektivní morfologickou metodu v diagnostice periferních neuropatií, zejména SFN [10–12]. Diagnostika SFN je v současné době založena především na anamnéze relevantních pozitivních senzitivních symptomů, klinickém vyšetření (v němž je prokazována často obtížně klinicky detekovatelná porucha termického a algického čití) a kvantitativním testování senzitivity (Quantitative Sensory Testing; QST), které umožňuje detailnější hodnocení percepce obou zmíněných senzitivních modalit. Klíčová diagnostická metoda (představující v současnosti zlatý standard v diagnostice SFN) je pak hodnocení intraepidermální inervace z kožní biopsie, která je však na rozdíl od CCM metodou invazivní s omezenou opakovatelností a daleko větší časovou a metodickou náročností zpracování a hodnocení nálezů [10–14]. Provedená pilotní studie přitom prokazuje obdobnou diagnostickou validitu CCM a kožní biopsie v diagnostice periferních neuropatií [10]. CCM je proto perspektivní metoda s potenciálem zjednodušit objektivní diagnostiku jinak obtížně verifikovatelného typu periferní neuropatie.

Využitelnost CCM v diagnostice různých periferně neurogenních onemocnění byla již potvrzena řadou studií. Nejčastější zkoumanou diagnostickou jednotkou je diabetická polyneuropatie (Diabetic Polyneuropathy; DPN). Konfokální mikroskopie prokazuje signifikantní redukci rohovkové inervace u pacientů s polyneuropatií při diabetes mellitus (DM) 1. i 2. typu či prediabetu a také u diabetické SFN i autonomní DPN [3,5,9]. Nálezy CCM mohou být využity dokonce jako prediktor budoucího rozvoje periferní neuropatie u pacientů s DM a slouží k identifikaci pacientů, kteří jsou z tohoto hlediska vysoce rizikoví a lze u nich zvážit zintenzivnění terapeutického přístupu k základnímu metabolickému onemocnění [15,16]. Hodnocení změn inervace rohovky při vyšetření CCM vykazuje u pacientů s DPN vysokou senzitivitu i specificitu většiny sledovaných parametrů [3]. Signifikantní morfologické změny korneální inervace byly prokázány také u pacientů se SFN při Fabryho chorobě [17] či idiopatické SFN [2], u polyneuropatie indukované chemoterapií [4] či hereditární neuropatie Charcot Marie Tooth, typ 1A [18]. Změny inervace rohovky jsou však prokazovány také u některých neurodegenerativních onemocnění, a to poněkud odlišného charakteru než v případě periferních neuropatií. Například u Parkinsonovy nemoci bylo sice zjištěno snížení hustoty nervových vláken, ale zároveň zvýšení hustoty jejich větví i celkové délky nervových vláken, což je jedinečný a klinicky determinantní nález [19]. CCM se tedy jeví jako široce využitelná, relativně jednoduchá a neinvazivní metoda rozšiřující významným způsobem spektrum diagnostických metod u pacientů s periferními neuropatiemi vč. SFN, ale i u některých dalších neurologických onemocnění.

Pro využití metody v klinické praxi je nezbytné srovnání nálezů hodnocených parametrů s normativními daty. Recentně byla publikována multicentrická studie poskytující věkově stratifikovaná normativní data pro obě pohlaví [20].

Cílem naší studie bylo zavést hodnocení rohovkové inervace pomocí CCM do klinické praxe v České republice a ověřit platnost publikovaných normativních dat pro jednotlivé CCM parametry [20] v české populaci, resp. vytvoření vlastních norem pro hodnocení této metody. Současně byla studie zaměřena na ověření spolehlivosti nálezů CCM při využití metody různými hodnotiteli a dále na srovnání nálezů manuální a automatické analýzy jednotlivých parametrů CCM.

Soubor

Inervace rohovky byla pomocí konfokální mikroskopie vyšetřena v souboru 71 zdravých dobrovolníků (tab. 1), převážně zaměstnanců Neurologické kliniky LF MU a FN Brno a jejich rodinných příslušníků. Menší část zdravých kontrol tvořili pacienti neurologické kliniky s onemocněními nepostihujícími periferní nervový systém (např. s bolestmi hlavy, lumbagem apod.). Vylučujícími kritérii pro zařazení do souboru zdravých kontrol byly:

1. Známá polyneuropatie a/nebo klinický nález či anamnestické obtíže svědčící pro polyneuropatii.
2. Anamnesticky zjištěné rizikové faktory potenciálně vedoucí ke vzniku periferní neuropatie (např. DM, porucha glukózové tolerance, chronický abúzus alkoholu, tyreopatie, stav po prodělané protinádorové chemoterapii).
3. Dlouhodobé používání kontaktních čoček v současnosti či kdykoliv v minulosti.
4. Operace či úraz oka v anamnéze.

Žádný z vyšetřených jedinců neměl známé oční onemocnění a neužíval lokální medikaci aplikovanou intraokulárně.

Za účelem vytvoření věkově stratifikovaných normativních dat byl soubor dále rozdělen do tří podskupin (do 30 let, 30–50 let a nad 50 let) (tab. 1).

Validita metodiky v diagnostice periferních neuropatií byla ověřena srovnáním nálezů se souborem 54 pacientů s DPN s postižením silných a/nebo tenkých nervových vláken (tab. 1). Dvanáct pacientů mělo DM 1. typu a 42 pacientů DM 2. typu. Polyneuropatie byla v tomto souboru verifikována klinickým a anamnestickým vyšetřením, korelující abnormitou elektromyografického vyšetření a případně (při normálním nálezu elektromyografického vyšetření a současně relevantních pozitivních senzitivních symptomech) abnormálním nálezem intraepidermální inervace v kožní biopsii (která je zlatým standardem v diagnostice SFN). Také u těchto pacientů byla vylučujícím kritériem operace či úraz oka v anamnéze a používání kontaktních čoček aktuálně a/ nebo v minulosti. Ani v tomto souboru neměli zařazení pacienti oční onemocnění a neužívali lokální medikaci aplikovanou intraokulárně.

Metodika

Všichni zdraví dobrovolníci i pacienti s DPN zařazení do studie byli informováni o účelu vyšetření a podepsali informovaný souhlas. CCM byla vyšetřena pomocí mikroskopu Heidelberg Retina Tomograph (HRT II) v souladu s publikovanými doporučeními [2,3,20] a na základě praktického školení v metodice, které absolvovaly dvě lékařky autorského týmu (IK, MH) v Centru pro endokrinologii a diabetes na Univerzitě v Manchesteru, UK, u dr. Mitry Tavakoli.

V úvodu vyšetření byla provedena anestezie rohovky lokální aplikací oxybuprokainu (Benoxi 0,4 %, Unimed Pharma, Bratislava, Slovensko). Po znecitlivění rohovky byl z důvodu dostatečné lubrikace do každého oka aplikován viskoelastický gel (Vidisic, Dr. Gerhard Mann, Chem-pharm. Fabrik, GmbH, Berlín, Německo). Malé množství tohoto gelu bylo umístěno i na povrch čočky objektivu a ta byla následně kryta jednorázovým sterilním kloboučkem (perspex cap), který byl během vyšetření v kontaktu s vyšetřovaným okem. Vyšetřovaný byl vyzván k fixaci pevného bodu (bílé světlo) v průběhu celého vyšetření, což eliminovalo nežádoucí pohyby očí. Manuálním zaostřováním čočky objektivu pak bylo možno prohlédnout rohovku v celém rozsahu a z vrstvy obsahující subbazální plexus pořídit snímky o velikosti 384 × 384 pixelů. Následně byly z náhodně zvoleného oka vybrány tři odlišné reprezentativní snímky od sebe vzájemně vzdálených vrstev. Na vybraných snímcích byly v souladu s publikovanými doporučeními [20] hodnoceny následující parametry (obr. 3A, B):

1. Hustota korneálních nervových vláken (Corneal Nerve Fiber Density; CNFD) – celkový počet hlavních nervových vláken na milimetr čtvereční snímku.
2. Délka korneálních nervových vláken (Corneal Nerve Fiber Lenght; CNFL) – celková délka všech hlavních nervových vláken a větví v rámci příslušného snímku rohovky.
3. Hustota větví korneálních nervových vláken (Corneal Nerve Branch Density; CNBD) – celkový počet větví vycházejících z hlavních vláken na milimetr čtvereční snímku.
4. Koeficient tortuozity (Corneal Nerve Fiber Tortuosity; CNFT) – míra vinutosti korneálních nervových vláken. Tortuozita je v používaném programu CCMetrics hodnocena poměrně komplikovaným způsobem. Výpočet vychází z odchylky mezi přímou linií spojující oba konce hodnoceného nervového vlákna a skutečného průběhu tohoto vlákna. Skutečný průběh vlákna je určen matematicky za pomoci diferenciálního počtu. Každé nervové vlákno je reprezentováno jako funkce. Derivací této funkce v konkrétním bodě získáme informaci o sklonu nervového vlákna v daném bodě. Pro každý bod (pixel) je určen sklon a současně i odchylka od přímé linie. Výpočet CFFT pak vychází ze sumy všech odchylek. Jde o bezrozměrné číslo, které může nabývat hodnot od 0 do 1, kde se zvyšujícím se číslem se zvyšuje i míra vinutosti nervového vlákna. Podrobnější popis výpočtu tohoto parametru je k dispozici v původní práci autorů Kallinikos et al [21].

Každý z uvedených parametrů byl hodnocen dvěma způsoby:

1. Manuálně pomocí softwaru CCMetrics (CCMetrics, MA Dabbah; Imaging Science and Biomedical Engineering, University of Manchester, Manchester, UK). Pro stanovení interindividuální variability bylo hodnocení manuálním softwarem provedeno nezávisle dvěma vyškolenými lékaři (IK, MH).
2. Automaticky softwarem ACCMetrics (ACCMetrics, MA Dabbah; Imaging Science and Biomedical Engineering, University of Manchester, Manchester, UK) [22,23].

Po skončení vyšetření byl pacient požádán, aby semikvantitativně zhodnotil náročnost vyšetření a jeho nepříjemnost, a to s použitím stupnice:

1 – vyšetření nebylo vůbec nepříjemné;
2 – vyšetření bylo lehce nepříjemné;
3 – vyšetření bylo středně nepříjemné, ale absolvoval bych ho znovu;
4 – vyšetření bylo velmi nepříjemné, znovu bych ho nechtěl absolvovat;
5 – vyšetření bylo silně nepříjemné, téměř se nedalo vydržet.

Statistická metodologie

Statistické zpracování bylo provedeno pomocí software SPSS 23.0.0.0 (IBM Corporation 2014). Iniciálně byla zhodnocena distribuce dat jednotlivých sledovaných parametrů, pro její ověření byly použity normal probability ploty (N-P ploty) a Kolmogorovův-Smirnovovův test. Hodnoty CNFL a CNFT vykazovaly normální rozdělení a hodnoty CNFD a CNBD vykazovaly log-normální rozdělení. Pro další statistické zpracování byly použity parametrické testy na logaritmicky transformovaných datech CNFD a CNBD a původních datech CNFL a CNFT. Před vlastní prezentací dat bylo v případě práce s logaritmicky transformovanými daty provedeno jejich zpětné převedení na základní formát a jako taková jsou data prezentována v tabulkách. Vzhledem k obtížné interpretaci hodnoty směrodatné odchylky (Standard Deviation, SD) u logaritmicky transformovaných dat není tato hodnota explicitně uvedena. Zviditelnění rozložení primárních hodnot kontinuálních dat bylo proto provedeno pomocí průměrů (x) a intervalů definovaných průměrem ± dvěma se směrodatnými odchylkami (x + 2 SD). Kategoriální data jsou znázorněna pomocí absolutních (relativních) četností. Na základě výsledků hodnoceného normativního souboru byla vytvořena normativní data na úrovni x ± 2 SD. Ke srovnání hodnocených parametrů mezi jednotlivými skupinami pacientů/zdravých kontrol byl použit nepárový t-test. Korelace jednotlivých parametrů s věkem byla hodnocena pomocí jednoduchého lineárního regresního modelu.

Pro analýzu spolehlivosti vyhodnocení snímků různými hodnotiteli a způsoby hodnocení (manuální/ automatická analýza) byl použit koeficient ICC (Intraclass Correlation Coefficient, varianta two-way random).

Výsledky

Náročnost vyšetření a potenciální komplikace

Vyšetření CCM proběhlo v naprosté většině případů zcela bez problémů. Z vyšetřených 125 pacientů/kontrol jsme závažnější komplikace zaznamenali pouze v jednom případě (0,8 %), a to v podobě reakce na použité lokální anestetikum (oxybuprokain) formou prekolapsového stavu u pacienta bez dosavadní anamnézy alergické reakce na lokálně anestetické preparáty. Aplikace anestetických kapek, která vyvolá přechodné (několik s až max. několik málo min trvající) lehce pálivé pocity v oblasti oka, byla obecně nejnepříjemnější částí vyšetření. U dvou dalších pacientů byla zaznamenána hypersenzitivní reakce na tyto lokálně anestetické kapky, která se projevila prolongovaným několikahodinovým trváním popsaných nepříjemných pocitů. Při použití semikvantitativní stupnice v rozsahu od 1 do 5 hodnotili pacienti vyšetření většinou jako nenáročné (1) nebo málo náročné (2), pro jednoho pacienta bylo vyšetření výrazně nepříjemné (4), a to právě v důsledku výše uvedené reakce na lokální anestetické kapky. Průměrná hodnota náročnosti vyšetření při hodnocení pacientem 1,56 ± 0,67, při hodnocení vyšetřujícím pak 1,14 ± 0,17.

Z hlediska vyšetřujících bylo pro zajištění kvalitní snímkové dokumentace velmi důležité zajištění maximálního komfortu pacienta během vyšetření (zejména pomocí jeho optimálního napolohování), protože i minimální nepohodlí způsobovalo velmi drobné pohyby těla a hlavy, které výrazně komplikovaly až znemožňovaly pořízení kvalitních snímků. U malé části pacientů bylo vyšetření ztíženo úzkou oční štěrbinou, ať už z důvodu anatomických nebo z důvodu neschopnosti pacienta více otevřít oko při obecně špatné toleranci očních vyšetření. Úzká oční štěrbina omezovala dostatečný kontakt oka s čočkou mikroskopu, který je nezbytný pro získání kvalitních snímků. U žádného z dobrovolníků nicméně nebylo nutné vyšetření ukončit předčasně bez získání požadovaných snímků.

Vlastní vyšetření pacienta nebylo v našem souboru náročné ani časově. Průměrné trvání vyšetření bylo 17,2 ± 4,6 min (rozsah 7–40 min v závislosti na spolupráci pacienta a jeho toleranci vyšetření), a to vč. vysvětlení podstaty vyšetření pacientovi, iniciální aplikace lokálních anestetik a viskoelastického gelu, nastavení mikroskopu, jeho zaostření na sledovanou vrstvu rohovky a pořízení snímkové dokumentace. Následné hodnocení jednoho snímku pak v závislosti na počtu nervových vláken trvá přibližně 3–8 min při manuálním hodnocení a zhruba 20 s (podle výkonu počítače) v případě využití automatického softwaru. Celkový čas potřebný pro vyhodnocení tří snímků u jednoho pacienta je tedy 10–25 min při manuální analýze a přibližně 1 min při analýze automatické.

Nálezy v souboru zdravých kontrol

Průměrné hodnoty jednotlivých parametrů v souboru zdravých kontrol jsou uvedeny v tab. 2. Žádný z hodnocených CCM parametrů nevykazoval významné rozdíly mezi muži a ženami (tab. 2), zachycen však byl mírný, ale již statisticky signifikantní pokles hodnot většiny parametrů (s výjimkou tortuozity) s věkem (tab. 2, obr. 4A, B). Z tohoto důvodu byly výsledky dále zpracovány odděleně ve třech věkově definovaných podskupinách zdravých kontrol (do 30 let, 30–50 let, nad 50 let) (tab. 1, 2), pro které byla následně stanovena i vlastní normativní data (tab. 2). V případě CNFD, CNFL a CNBD jsou v tabulce zvýrazněny dolní normální limity, a abnormitou je tedy hodnota pod úrovní uvedeného limitu. Pro CNFT je zvýrazněná hodnota naopak horním normálním limitem a abnormální jsou hodnoty přesahující uvedenou normu (tab. 2).

Platnost uvedených normativních dat byla dále ověřena srovnáním s publikovanou rozsáhlou multicentrickou normativní studií, jež využila manuální způsob hodnocení snímků, a to identický jako v naší studii [20]. Počet abnormit jednotlivých parametrů ve sledovaném normativním souboru při použití vlastních a dříve publikovaných normativních dat je uveden v tab. 3.

Nálezy v souboru pacientů s DPN

Věkové složení souborů pacientů s DPN a zdravých kontrol bylo v naší studii odlišné. Srovnání sledovaných parametrů mezi těmito skupinami bylo proto za účelem eliminace vlivu věku provedeno odděleně v jednotlivých věkových skupinách (tab. 4). Hodnoty CNFD, CNFL a CNBD byly u pacientů s DPN ve všech věkových skupinách signifikantně nižší než v odpovídajících souborech zdravých kontrol (tab. 4). Vzestup CNFT se nám podařilo prokázat pouze v nejstarší věkové skupině (tab. 4).

Spolehlivost hodnocení snímků různými hodnotiteli a srovnání s automatickou analýzou

Vyhodnocení spolehlivosti (reliability) hodnocení snímků je uvedeno v tab. 5. Spolehlivost manuálního hodnocení snímků mezi dvěma různými hodnotiteli (MH a IK) vyjádřená pomocí intra-class korelačního koeficientu vykazuje hodnoty > 0,8 pro všechny parametry kromě tortuozity. Tyto hodnoty odpovídají výborné shodě nálezů mezi hodnotiteli. Srovnání výsledků manuální a automatické analýzy naopak dobrou shodu neprokazuje (tab. 5). Při hodnocení automatickým softwarem byly všechny hodnocené parametry (CNFD, CNFL, CNBD) signifikantně nižší oproti analýze manuální (tab. 5).

Diskuze

Prezentovaná studie v souhrnu prokázala jednoduchost, bezpečnost a nízkou časovou i metodickou náročnost vyšetření rohovkové inervace pomocí konfokální mikroskopie na poměrně rozsáhlém souboru zdravých kontrol a skupině pacientů s DPN. Na základě zjištěných výsledků byla vytvořena vlastní normativní data a současně byla ověřena platnost recentně publikovaných normativních dat z rozsáhlé multicentrické studie [20] pro českou populaci. U pacientů s DPN byly prokázány signifikantní změny všech sledovaných parametrů, což potvrzuje využitelnost metody jako alternativního konfirmačního testu DPN. Pro hodnocení CCM snímků lze využít manuální i automatickou analýzu. Naše studie však prokázala, že oba typy analýzy nejsou vzájemně zaměnitelné. Při manuální analýze byla prokázána velmi dobrá shoda dvou hodnotitelů ve všech sledovaných parametrech s výjimkou tortuozity. Metoda tedy vykazuje uspokojivou inter-rater reliabilitu. Naopak hodnocení automatickým softwarem vykazovalo ve srovnání s manuální analýzou signifikantně nižší hodnoty CNFD, CNFL i CNBD. Při interpretaci nálezů CCM je proto nutné zohlednit typ analýzy a volit vždy jednotný způsob hodnocení nálezů pro všechny pacienty v příslušné studii.

Naše zkušenost potvrdila uspokojivou toleranci vyšetření rohovkové inervace pomocí konfokální mikroskopie prakticky u všech vyšetřených pacientů a nízkou náročnost metodiky pro vyšetřující lékaře. Jedinou zaznamenanou komplikací byla reakce na lokální anestetikum aplikované iniciálně při vyšetření: u jednoho pacienta jsme zaznamenali celkovou reakci ve formě prekolapsového stavu, u dvou pacientů pak prolongované (několik hod trvající) nepříjemné pocity v oblasti oka charakteru pálení a řezání. Oba zmíněné typy nežádoucích účinků jsou uvedeny i v příbalovém letáku Benoxi kapek a při jejich aplikaci je třeba s podobnými reakcemi počítat, i když jsou obecně poměrně málo časté. Před vyšetřením je také vhodné se na případnou anamnézu alergických reakcí na lokální anestetika cíleně dotazovat a v případě pozitivní anamnézy vyšetření neprovádět. Indikaci k vyšetření CCM je s ohledem na používání lokálních anestetik obecně vhodné pečlivě zvažovat také u pacientů s polyvalentními alergiemi, a to i v případě, že není anamnesticky známa přímo alergie na lokálně-anestetické preparáty. Je však třeba si uvědomit, že stejný problém nastává i u alternativní konfirmační metody SFN, tedy u kožní biopsie, při které je vzorek odebírán v lokální infiltrační anestezii.

Nálezy v prezentovaném souboru zdravých kontrol jsou prakticky identické jako publikované výsledky velké multicentrické normativní studie hodnotící sledované parametry CCM na souboru 343 zdravých dobrovolníků [20], stejně jako v dříve publikovaných menších souborech zdravých kontrol [15,24,25]. Tato skutečnost potvrzuje správnost použité metodiky hodnocení jednotlivých CCM parametrů a její srovnatelnost s mezinárodním standardem. Velmi blízká uvedené studii jsou také derivovaná normativní data. Při použití obou typů norem jsme abnormitu jednotlivých parametrů zachytili jen u malé (a v obou případech velmi podobné) části normativního souboru, což umožňuje v české populaci použít oba typy normativních dat.

Identicky jako zmíněná multicentrická normativní studie prokázaly i naše výsledky určitou závislost většiny parametrů CCM na věku pacienta, i když věkově podmíněné změny byly v případě obou studií spíše mírné (tab. 2) [20]. Při hodnocení nálezů je proto vhodné zvažovat věk pacienta a používat věkově stratifikovaná normativní data, která byla z těchto důvodů vytvořena i v naší práci.

Prokázán naopak nebyl signifikantní vliv pohlaví pacientů. Tavakoli et al sice uvádí oddělené normy pro muže a ženy, přímé srovnání hodnot CCM parametrů mezi oběma pohlavími však v práci překvapivě uvedeno není a orientační srovnání hodnot v souboru mužů a žen v této práci svědčí proti významným rozdílům sledovaných parametrů mezi muži a ženami [20]. I v tomto směru tak výsledky naší studie odpovídají již publikovaným nálezům.

Hodnocení rohovkové inervace pomocí konfokální mikroskopie se v současnosti využívá především v diagnostice DPN [3,5,9]. V posledních letech byla publikována řada studií potvrzujících využitelnost metodiky v hodnocení přítomnosti a tíže periferní neuropatie u pacientů s DM 1. [3,15,26,27] i 2. typu [3,24,25]. Výhodou vyšetření je jeho neinvazivita a téměř neomezená možnost opakování testu a tedy dobrá využitelnost např. pro dlouhodobé sledování pacientů [15]. Inervace rohovky vykazuje signifikantní změny již u pacientů s recentním DM 2. typu [25] a dokonce u jedinců s prediabetickými stavy (tj. především poruchou glukózové tolerance) [28]. Metoda je však využitelná i při hodnocení neuropatie jiné než diabetické etiologie [17,18], vč. idiopatické SFN [2].

Uvedené nálezy potvrdila i naše studie, v níž byly hodnoty hustoty i celkové délky nervových vláken u pacientů s DPN signifikantně nižší ve srovnání se souborem zdravých kontrol. Soubor zahrnoval pacienty s DM 1. i 2. typu, což potvrzuje využitelnost metody v hodnocení neuropatie u pacientů s oběma typy DM. Hodnoty jednotlivých parametrů zjištěné v našem souboru pacientů s DPN odpovídají dříve publikovaným nálezům u obdobných souborů pacientů [24–28] a opět nepřímo potvrzují správnost používané metodiky.

Jedním z mála limitů metodiky je při manuálním hodnocení nálezů potřeba zkušeného a vyškoleného jedince – hodnotitele – a čas, který je nutný ke zhodnocení jednoho pacienta (cca 10–25 min). Z tohoto důvodu byl univerzitou v Manchestru vyvinut software k automatické analýze CCM (ACCMetrics), který zredukoval čas potřebný k hodnocení na několik vteřin na snímek [11,29] a snížil nutnost erudice hodnotitelů. Dosud však bylo publikováno jen minimum studií poskytujících srovnání manuální a automatické analýzy CCM parametrů [29,30]. Podobně je k dispozici pouze omezená evidence o spolehlivosti nálezů CCM při hodnocení různými hodnotiteli [31,32]. V další části studie jsme se proto pokusili zaměřit na hodnocení spolehlivosti CCM při využití více hodnotiteli a na srovnání manuální a automatické analýzy.

Hodnocení inter-rater reliability jednotlivých parametrů CCM prokázalo při manuální analýze výbornou spolehlivost nálezů všech sledovaných parametrů s výjimkou tortuozity. Výsledky velmi obdobné naší studii vč. vlastních hodnot ICC koeficientů mezi více hodnotiteli prokázali např. Hertz et al [31]. Podobně jako naše nálezy byla i v této studii nejhůře reprodukovatelným parametrem tortuozita, zatímco ostatní parametry byly z hlediska shody nálezů mezi více hodnotiteli signifikantně lepší a vzájemně srovnatelné. Jiné studie prokázaly horší reprodukovatelnost NFBD. Nejlépe reprodukovatelným parametrem je ve většině sledovaných studií (vč. naší) délka nervových vláken rohovky, případně jejich hustota – tyto dva parametry lze tedy doporučit jako nejvhodnější markery pro longitudinální sledování pacientů [32].

Intra-class korelační koeficienty pro srovnání manuální a automatické analýzy byly významně nižší ve srovnání s ICC reflektujícími spolehlivost nálezů při manuální analýze snímků více hodnotiteli. Všechny hodnocené parametry (CNFD, CNFL a CNBD) vykazovaly při hodnocení automatickou analýzou signifikantně nižší hodnoty ve srovnání s analýzou manuální. Podkladem těchto rozdílů jsou pravděpodobně především technické aspekty, jako je nižší kvalita některých snímků (např. drobné vzduchové bubliny, přítomnost linií způsobených přílišným tlakem na rohovku), díky nimž automatický software neidentifikuje správně ně­kte­rá nervová vlákna. Těmto problémům se však v běžné praxi nelze úplně vyhnout a pomocí manuální analýzy lze tyto snímky bez problémů hodnotit. Prakticky identické nálezy se signifikantně nižšími hodnotami CNFL při použití automatické analýzy ve srovnání s analýzou manuální byly prokázány i v dalších podobných studiích [29,30]. Tyto rozdíly jsou tedy systémové a nelze je vysvětlit event. horší kvalitou snímků v našem centru. Výsledky všech zmíněných studií vč. naší tak ukazují, že obě metody hodnocení (manuální a automatická) nejsou vzájemně zaměnitelné a není možné je v rámci jedné studie libovolně střídat. Při hodnocení je obecně nutné používat normativní data vytvořená pro příslušný typ analýzy. Pro manuální analýzu tak lze doporučit využití dat z práce autorů Tavakoli et al [20] nebo z naší studie, zatímco pro automatický software nejsou validní normativní data prozatím k dispozici [29].

Seznam použitých zkratek

CCM – konfokální mikroskopie rohovky (Corneal Confocal Microscopy)
CNBD – hustota větví korneálních nervových vláken (Corneal Nerve Branch Density)
CNFD – hustota korneálních nervových vláken (Corneal Nerve Fiber Density)
CNFL – délka korneálních nervových vláken (Corneal Nerve Fiber Lenght)
CNFT – koeficient vinutosti (Corneal Nerve Fiber Tortuosity)
DM – diabetes mellitus
DPN – diabetická polyneuropatie
ICC – intraclass correlation coefficient
SD – směrodatná odchylka (Standard Deviation)
SFN – neuropatie tenkých vláken (Small Fiber Neuropathy)

Práce byla podpořena projektem institucionální podpory FN Brno MZ ČR – RVO (FNBr – 65269705) a projektem specifického výzkumu č. MUNI/A/1072/2015 z programu podpory studentských projektů na Masarykově univerzitě.

Autorky č. 1 a 2 (IK a MH) se podílely stejnou měrou na akvizici dat a přípravě manuskriptu.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

MUDr. Eva Vlčková, Ph.D.

Neurologická klinika

LF MU a FN Brno

Jihlavská 20

625 00 Brno

e-mail: evlckova@email.cz

Přijato k recenzi: 4. 7. 2016

Přijato do tisku: 17. 8. 2016